Analysis of the mRNA expression of the S100β protein in adipocytes of patients with diabetes mellitus, type 2

abem Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia Arq Bras Endocrinol Metab 1677-9487 Sociedade Brasileira de Endocrinologia e Metabologia São Paulo, SP, Brazil OBJECTIVE: This study aims to explore the possible relationship between the expression level of S100β protein mRNA with diabetes mellitus type 2 in adipocytes from patients with this disease in comparison with normoglycemic individuals. MATERIALS AND METHODS: Samples of adipose tissue of eight patients from the coronary section of the Institute Dante Pazzanese of Cardiology (IDPC), four in Group Diabetes and four of Normoglycemic group, were evaluated by RT-PCR real time. RESULTS: An increase around 15 times values, between the threshold cycle (ΔCt), of mRNA expression of S100β protein in adipocytes of the diabetes group was observed in comparison to the control group (p = 0.015). CONCLUSION: Our results indicate, for the first time, that there is coexistence of increased expression of the S100β and the type 2 diabetes mellitus gene. ARTIGO ORIGINAL Análise da expressão do mRNA da proteína S100β em adipócitos de pacientes com diabetes melito tipo 2 Analysis of the mRNA expression of the S100β protein in adipocytes of patients with diabetes mellitus, type 2 Mike Yoshio HamasakiI; Mario Hiroyuki HirataII; Rosario Dominguez Crespo HirataII; Silvia Tchernin HimelfarbII; Leila Maria Guissoni CamposI; Maria Inês NogueiraI ILaboratório de Neurociências, Instituto de Ciências Biomédicas III (ICBIII), Departamento de Anatomia, Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP, Brasil IILaboratório de Biologia Molecular Aplicada ao Diagnóstico, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, USP, São Paulo, SP, Brasil Endereço para Correspondência RESUMO OBJETIVO: O presente trabalho objetiva compreender a possível relação do nível de expressão gênica do mRNA da proteína S100β em adipócitos com o diabetes melito do tipo 2, pela comparação de dados de portadores dessa doença com os de indivíduos normoglicêmicos. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram selecionadas amostras de tecido adiposo de oito pacientes da Seção de Coronárias do Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia (IDPC), sendo quatro do grupo diabetes e quatro do grupo de normoglicêmicos. Essas amostras foram submetidas à técnica de RT-PCR em tempo real. RESULTADOS: Por meio do Test-t de Student para os valores de diferença entre os ciclos threshold (ΔCt), observou-se que houve aumento de aproximadamente 15 vezes (p = 0,015) da expressão do mRNA da proteína S100β nos adipócitos dos indivíduos do grupo diabetes quando comparado aos do grupo controle. CONCLUSÃO: Nossos resultados evidenciam, de forma inédita, coexistência entre o aumento da expressão do gene S100β e a patologia do diabetes melito do tipo 2. Descritores: Diabetes; S100beta; RT-PCR; adipócitos; biomarcador ABSTRACT OBJECTIVE: This study aims to explore the possible relationship between the expression level of S100β protein mRNA with diabetes mellitus type 2 in adipocytes from patients with this disease in comparison with normoglycemic individuals. MATERIALS AND METHODS: Samples of adipose tissue of eight patients from the coronary section of the Institute Dante Pazzanese of Cardiology (IDPC), four in Group Diabetes and four of Normoglycemic group, were evaluated by RT-PCR real time. RESULTS: An increase around 15 times values, between the threshold cycle (ΔCt), of mRNA expression of S100β protein in adipocytes of the diabetes group was observed in comparison to the control group (p = 0.015). CONCLUSION: Our results indicate, for the first time, that there is coexistence of increased expression of the S100β and the type 2 diabetes mellitus gene. Keywords: Diabetes; S100beta; RT-PCR; adipocytes; biomarker INTRODUÇÃO O termo diabetes melito (DM) engloba um grupo de doenças metabólicas de etiologia múltipla, caracterizado por hiperglicemia crônica com alterações no metabolismo de carboidratos, gorduras e proteínas, em função da deficiente ação da insulina nos tecidos alvos, em consequência de alterações na secreção e/ou ação da insulina (1). De acordo com dados referidos no "Dossiê de Diabetes – Programa de Controle da Diabetes Melitos – 1998", da Direção Geral de Saúde e Sociedade Portuguesa de Diabetologia, "a DM constitui grave problema de saúde pública em nível mundial não só pela crescente incidência, mas também por sua elevada morbidade e mortalidade". Estimativas da Organização Mundial da Saúde indicam que cerca de 366 milhões de indivíduos serão afetados pela doença em 2030 (2). O diabetes melito do tipo 2 (DM2) é o mais comum entre todos os outros tipos, perfazendo cerca de 90% dos casos de diabetes (3). Entre os mecanismos fisiopatológicos da DM2, as alterações teciduais estão relacionadas a um processo de gênese de produtos de glicação avançada (AGEs). Por meio da geração de radicais livres, da formação de ligações cruzadas com proteínas ou de interações com receptores celulares, os AGEs promovem, respectivamente, estresse oxidativo, alterações morfofuncionais e aumento da expressão de mediadores inflamatórios (4). Desde as primeiras pesquisas sobre AGEs in vivo, especulou-se sobre a possível existência de sistema de receptores ou proteínas ligantes para AGEs. Atualmente já se conhece um grande número deles, sendo o receptor para produtos finais da glicação avançada (RAGE) o mais descrito, por demonstrar desempenho importante no mecanismo patogênico de diversas doenças (5,6). Consequentemente há crescente relato da interação dos RAGEs com a proteína S100β na ação de muitas patologias, principalmente do sistema nervoso (7-10). A proteína S100β pertence à família de proteínas ligantes de cálcio. Em espaços intracelulares, essa proteína regula a fosforilação de proteínas, atua na dinâmica dos constituintes do citoesqueleto, fatores de transcrição, crescimento e diferenciação celular, homeostase do cálcio, atividade enzimática e respostas inflamatórias (11-13). A literatura não identifica mecanismo específico para a ativação e o aumento da expressão dessa proteína uma vez que foi encontrada uma variedade de sinais que podem ativar seu processo de expressão gênica, entre eles estão o interferon gama (14), o fator de crescimento do fibroblasto 2 (15), as interleucinas (16), o glutamato (17), a corticoesterona (18) e a pregnisona (19). Contudo, atualmente em condições normais, essa proteína já foi detectada em astrócitos, melanócitos, adipócitos e condrócitos (20). Portanto, considerando o crescente relato da interação de RAGE com o aumento da expressão da proteína S100β, assim como sua ocorrência em adipócitos, julgamos importante pesquisar a relação de S100β com a fisiopatologia da DM2 no tecido adiposo de pacientes diabéticos. MATERIAIS E MÉTODOS Pacientes Foram selecionados oito pacientes (Tabela 1) na Seção de Coronárias do Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia (IDPC). Divididos em dois grupos, quatro pacientes para grupo controle (normoglicêmicos) e quatros pacientes para o grupo de DM2. Todos os pacientes foram informados quanto ao protocolo de estudos previamente aprovado pelo Comitê de Ética do IDPC e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Segundo os critérios de inclusão, foram requeridos indivíduos de ambos os sexos com idade entre 30 e 70 anos, sendo que, para o grupo DM2, estes deveriam apresentar duas glicemias em jejum com valores entre 126 mg/dL e 270 mg/dL em medida casual (com sintomas clínicos) ou duas horas após ingestão de 75 g de glicose; e por meio do teste da hemoglobina glicada (HbA1C) com valores superiores a 6,5%. Os dados dos pacientes foram obtidos por meio de um questionário padronizado. Foram excluídos pacientes que estivessem em uso de bloqueadores β-adrenérgicos, inibidores da enzima conversora de angiotensina, diuréticos tiazídicos, corticosteroides, fibratos e agentes hipoglicemiantes orais como: metformina, repaglinida, acarbose; pacientes com glicemia demasiadamente alta, que necessitassem de terapia insulínica, logo após o diagnóstico ou durante o tratamento; pacientes que necessitam de terapia combinada como hipoglicemiantes orais e mulheres grávidas. Os pacientes com DM2 selecionados para o estudo foram orientados a seguir uma dieta hipocalórica, sem uso de hipoglicemiante oral, por 30 dias, conforme indicação médica. Amostras biológicas Foram coletadas amostras de tecido adiposo subcutâneo (50 mg), por meio de biópsia por agulha, denominada de Punch dermatológico (Koplast, Brasil). Agulha descartável e estéril com cinco mm de diâmetro. Após anestesia local com lidocaína 2% (Xylestesin Cristália, Brasil), o tecido adiposo foi coletado da região lombar direita, por médico cirurgião do IDPC. Após a coleta, o tecido adiposo foi lavado com tampão fosfato salino (PBS) e imerso em 1 ml de reagente estabilizante RNAlater® (Qiagen, Alemanha), mantido em temperatura ambiente por 24 horas e, posteriormente, o reagente foi removido e o tecido armazenado no freezer a -80ºC até sua análise. Extração do RNA total de tecido adiposo O tecido adiposo foi homogeneizado com 1 mL de TRIZOL® (Invitrogen-Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), por 10 segundos, à velocidade de 20.000 rpm, utilizando o homogeneizador de tecido Homomix D-130 (Biosystems, PR, Brasil), com probe de 5 mm. A amostra foi mantida em gelo durante esse processo. Após a lise e homogeneização, foi realizada a extração, conforme procedimento previamente padronizado no laboratório (21,22). Resumidamente, 200 µL de clorofórmio foram adicionados aos lisados e os extratos foram centrifugados 12.000 x g por 15 min, a 4 ºC. O RNA total presente na fase aquosa foi precipitado com isopropanol gelado, centrifugado a 10.000 x g, por 10 min, 4 ºC e lavado com etanol a 75% (v/v). A seguir, o RNA foi seco à temperatura ambiente e ressuspendido em 50 µL de água esterilizada tratada com (DEPC) (Sigma Aldrich, MO, USA). Análise do mRNA total O RNA total extraído foi quantificado por espectrofotômetro Nanodrop modelo ND-1000 (Nanodrop Technologies, Wilmington, Delaware, USA). O grau de pureza do RNA foi determinado pela relação A260nm/A280nm (23). Os resultados obtidos por meio da quantificação do RNA total são apresentados na tabela 2. Escolha dos iniciadores e sondas A sequência dos genes-alvo foi obtida no Banco de genes (Genbank) do National Institute of Health (NIH) e exportada para o programa Primer Express® (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os conjuntos de iniciadores e sonda foram selecionados seguindo os critérios e padrões definidos pelo software para sondas do tipo TaqMan. Os pares de iniciadores e as respectivas sondas fluorogênicas foram sintetizados pela Applied Biosystems de acordo com a listagem apresentada na tabela 3. Síntese de cDNA O cDNA foi obtido a partir 200 ng de RNA, na presença de 200 ng de iniciadores aleatórios (random primers) (Invitrogen, MD, EUA), DTT 20 mM (invitrogen, MD, EUA), 200 dNTP 10 mM (Amersham-Pharmacia Biotech do Brasil, Brasil), 200 U de transcriptase reversa (SuperScript™II RT RNase H¯) e tampão de RT (Tris-HCl 250 mM pH 8,3, KCl 375 mM, MgCl2 15 mM) (Invitrogen, MD, EUA). O ensaio de RT foi realizado em termociclador PTC-200 (MJ Research Inc., Walthan, MA, EUA). Análise da expressão pela PCR em tempo real A PCR em tempo real com objetivo da quantificação da expressão do mRNA dos gene S100β e GAPDH foi realizada com o equipamento ABI Prism 7500 fast (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). O programa trabalha em três etapas: (1) um ciclo de 2 minutos a 50ºC; (2) um ciclo de 10 minutos a 95ºC; (3) 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC e 1 minuto a 60ºC. Os sinais de fluorescência emitidos pelos fluoróforos das sondas TaqMan foram detectados pelo equipamento e os dados analisados pelo programa ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) que geram curvas semilogarítmicas dos sinais de amplificação. Os resultados foram analisados com base no valor de CT (cicle threshold ou ciclo limiar), sendo este o ponto correspondente ao número de ciclos onde a amplificação atinge dado limiar, o que permite a análise quantitativa da expressão do fator em avaliação. Os valores de Ct obtidos nesses experimentos foram utilizados para o cálculo da expressão relativa de mRNA de S100β em relação à do GAPDH. Essa relação é denominada pelo Delta Ct (ΔCt) e é calculada pela fórmula: ΔCt = (Ct controle endógeno – Ct gene-alvo) Em função da característica logarítmica dessa variável, foi utilizado o parâmetro 2-ΔCt para a análise dos dados conforme recomendado na literatura (24). Assim, foi possível determinar a expressão gênica individual dos participantes, diabéticos e normoglicêmicos (Tabela 4). RESULTADOS Os resultados foram analisados com o auxílio do software Sigma Stat versão 3.5 (SPSS Inc., Chicago, EUA). O nível de significância considerado foi p < 0,05. Os valores estatísticos apresentados neste artigo são em relação às características biodemográficas dos dois grupos (Tabela 5) e à comparação dos valores de 2-ΔCt (Tabela 6); em ambos foram realizados o Test-t de Student. Para os valores de 2-ΔCt, foi avaliado também o tamanho de efeito ("Effect Size"), por meio da medida de "Cohen d". Os resultados evidenciam baixa variabilidade nas amostras do grupo DM2 e diferença significativa entre o 2-ΔCt do Grupo DM2 e o grupo controle (p ≤ 0,015); esta é maior do que seria esperado por acaso. A expressão do mRNA no grupo DM2 é aproximadamente 15 vezes maior que o grupo controle. DISCUSSÃO A contribuição positiva e inédita deste trabalho, além de evidenciar relação do gene S100β com DM2, é a análise da expressão de mRNA do gene S100β diretamente no tecido adiposo de humanos com DM2 por meio da técnica de RT-PCR em tempo real. Embora algumas limitações devam ser consideradas, quais sejam: número de participantes igual a quatro para cada grupo, o que decorreu da complexidade de apropriação das amostras biológicas, e a ação negativa da insulina na expressão do gene endógeno GAPDH, usado como controle em adipócitos (25), os resultados mostraram de forma consistente e significante que há coexistência de níveis alterados de S100β e a DM2. O aumento da expressão do mRNA de S100β dos indivíduos com DM2, cerca de 15 vezes maior, quando comparados aos indivíduos normoglicêmicos (controle), corrobora com resultado similar obtido em estudo com ratos (Rattus norvergicus, linhagem Sprague-Dawley) induzidos a diabetes melito do tipo I. Utilizando as técnicas de Northern blot e PCR convencional para diversos tecidos, entre eles o tecido adiposo, Zimmer e cols. (26) concluíram que houve o dobro da transcrição de S100β no grupo induzido a diabetes melito do tipo I em comparação ao grupo de ratos normoglicêmicos. O aumento observado na transcrição do mRNA do gene S100β pode refletir aumento da quantidade traduzida dessa proteína, o que, contudo, requer comprovação com técnicas de quantificação direta dos teores da proteína S100β, por exemplo a técnica de Western Blotting, como também seria interessante a realização de pesquisas que relacionem a interação entre S100β e RAGEs na DM2. No estudo comparativo entre os dois grupos com o Test-t de Student e os valores de coeficiente de variabilidade para os parâmetros de idade, peso, altura e IMC, a amostra se manteve homogênea, ou seja, neste trabalho especificamente com o grupo utilizado, os dados biodemográficos considerados não influenciaram no resultado da expressão gênica de S100β. Esta conclusão também é encontrada e confirmada por outro trabalho (27). Neste projeto, a média de idade de ambos os grupos é elevada, segundo Pham e cols. (27), Portela e cols. (28), Tiu e cols. (29) e Nogueira e cols. (30). A expressão de S100β em diversos tipos celulares é diretamente influenciada pela faixa etária dos pacientes, porém nenhum desses estudos realizou a análise do mRNA da proteína por RT-PCR, contribuição desta pesquisa. CONCLUSÃO A expressão dos genes S100β e GAPDH avaliada pela técnica do RT-PCR em tempo real em amostras de tecido adiposo humano comprovou, de forma inédita, que há expressão significante entre indivíduos diabéticos e normoglicêmicos (15 vezes maior nos diabéticos, p < 0,05), o que evidencia coexistência entre os valores aumentados de transcrição de S100β e a fisiopatologia da DM2. Dado o envolvimento de S100β com processos inflamatórios, a avaliação de seus teores pode contribuir como biomarcador para o diagnóstico da patologia ou do seu grau de severidade. Agradecimentos: A todos que direta ou indiretamente ajudaram a concretizar este trabalho. Em especial à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp), à professora Mariana Doce Passadore, ao professor Adilson Apolinário, a Natalia Cristine Jukemura, André D. Lucchesi e Silvia Honda Takada. Declaração: os autores declaram não haver conflitos de interesse científico neste estudo. Correspondência para: Maria Inês Nogueira Av. Prof. Lineu Prestes, 2415 05508-900 − Cidade Universitária São Paulo, SP, Brasil [e-mail] Recebido em 7/Jun/2011 Aceito em 30/Ago/2012 1 1. American Diabetes Association: Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care. 1997;20:1183-97. Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus Diabetes Care 1997 1183 97 20 2. OMS. Organização Mundial da Saúde. Diabetes Programe. www.who.int/diabetes/facts/world_figures/en. Acessado em: 18 jan, 2010. Diabetes Programe 3 3. World Health Organization. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications: report of a WHO consultation. Geneva, World Health Organization; 1999. p. 59. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications: report of a WHO consultation 1999 4. Monnier VM. Intervention against the Maillard reaction in vivo. 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