Hidroxiapatita sintética pura, hidroxiapatita sintética associada ao colágeno e hidroxiapatita sintética associada ao lipossoma como substitutos ósseos em defeitos provocados na tíbia de cães: aspectos da osteointegração à microscopia de luz transmitida

Pure synthetic hydroxyapatite, collagen associated synthetic hydroxyapatite and liposome associated synthetic hydroxyapatite as a bone substitute for defects in bone healing of dogs: transmitted light microscopy osteointegration aspects

Hidroxiapatita sintética pura, hidroxiapatita sintética associada ao colágeno e hidroxiapatita sintética associada ao lipossoma como substitutos ósseos em defeitos provocados na tíbia de cães: aspectos da osteointegração à microscopia de luz transmitida

[Pure synthetic hydroxyapatite, collagen associated synthetic hydroxyapatite and liposome associated synthetic hydroxyapatite as a bone substitute for defects in bone healing of dogs: transmitted light microscopy osteointegration aspects]

K.L. Franco, A.P.B. Borges^*, M.I.V. Vilória, E.S. Fernandes, A.F. Fehlberg

Departamento de Veterinária da Universidade Federal de Viçosa

Rua P.H. Rolfs, s/n

36570-000 - Viçosa, MG

Recebido para publicação em 4 de julho de 2000.

Recebido para publicação, após modificações, em 10 de julho de 2001.

RESUMO

Utilizaram-se 40 cães clinicamente sadios com o objetivo de avaliar histologicamente o efeito da hidroxiapatita sintética pura (HAP-91), da HAP-91 associada ao colágeno (COL.HAP-91) e da HAP-91 associada ao lipossoma (INT.HAP-91) como substitutos ósseos em defeitos provocados na tíbia dos animais. Após protocolo anestésico, o procedimento cirúrgico constou de incisão na face medial e no terço proximal da tíbia esquerda, com retirada de um fragmento ósseo com cerca de 10 ´ 6mm de tamanho. Os animais foram separados em quatro grupos de 10 cada. No grupo 1 a falha óssea foi preenchida com HAP-91, no grupo 2 com COL.HAP-91 e no grupo 3 com INT.HAP-91. O grupo quatro não recebeu tratamento. Dois animais de cada grupo foram sacrificados nos dias 8, 30, 60, 120 e 180 de pós–operatório para coleta de material para histopatologia. Aos oito dias observou-se neoformação óssea no grupo-controle e ao redor do implante nos grupos tratados com HAP-91 e INT.HAP-91. Aos 30 dias, notou-se preenchimento do defeito nos mesmos grupos, fato não observado no grupo COL.HAP-91. Conclui-se que a cicatrização óssea ocorreu nos grupos controle e tratados com HAP- 91 e INT.HAP-91, mais precoce neste último grupo. Nos animais tratados com COL.HAP-91 não houve cicatrização completa.

Palavras-chave: Cão, hidroxiapatita sintética, substituto ósseo

ABSTRACT

The objective of this work was to evaluate histologically the synthetic hydroxyapatite (HAP-91), associated to collagen (COL.HAP-91) and associated to liposome (INT.HAP-91), as bone substitutes. Fourty clinically healthy dogs were studied. After a conventional anaesthesic protocol, the surgical procedure consisted of skin incision on medial surface in the left tibial third middle. A bone fragment of 10 ´ 6mm in size was retreated in all animals, which were divided into four groups with 10 animals each. Group one was treated with HAP-91, group two with COL.HAP-91, group three with INT.HAP-91, group four did not receive any treatment and was used as a control. Histological material was collected after humane sacrifice of two animals from each group in 8, 30, 60, 120 180 days after surgery. By the 8^th day, bone neoformation in control group and around the implant in groups treated with HAP-91 and INT.HAP-91 was observed. On the 30^th day, the defect was filled up completely in the same groups, result which was not observed in COL.HAP-91 group. Bone repair was complete in control group, HAP-91 group and INT.HAP-91 group (most premature), but in animals treated with COL.HAP-91 complete regeneration was not observed.

Keywords: Dog, synthetic hydroxyapatite, bone substitute

INTRODUÇÃO

O emprego de substâncias químicas que facilitem a reparação óssea, que permitam rápida osteogênese, osteoindução e osteocondução, vem sendo estudado como uma nova opção. Então, os biomateriais sintéticos adquirem importância, uma vez que são biocompatíveis, de fácil aplicação e acondicionamento, além de favorecerem o crescimento ósseo por ação osteoindutora ou osteocondutora.

As propriedades biológicas da hidroxiapatita sintética (HAP) são bem documentadas na literatura, tendo sido utilizada na correção de defeitos ósseos no homem e em várias espécies (Arakaki et al., 1995; Geesink & Hoefnagels, 1995; Kveton et al., 1995; Yamaguchi et al., 1995), com resultados suficientes para indicá-la como alternativa para a enxertia óssea na rotina clínica. Nelson et al. (1993), Arakaki et al. (1995), Borges (1998) e Rezende et al.(1998) relatam a biocompatibilidade da HAP com o osso, baseado no fato de possuir a mesma estrutura cristalina e química do osso vivo, sendo considerada, portanto, como o sólido inorgânico mais importante em biologia (Heikkilla et al., 1993; Saalfeld et al.,1994). A hidroxiapatita não tem capacidade osteoindutiva, atuando como matriz passiva para o crescimento ósseo, razão pela qual é considerada como um material osteocondutor (Callan & Rohrer, 1993; Heikkilla et al., 1993; Borges, 1998; Rezende et al., 1998).

O efeito do uso do colágeno como substituto ósseo, seja sozinho ou associado a outro material, ainda não é bem elucidado. Porém, ele pode ser utilizado associado às biocerâmicas como forma de prevenir a migração de partículas do material, antes que seja incorporado ao tecido hospedeiro (Bell & Beirne, 1988).

Os estudos histológicos realizados por Najjar et al. (1991) evidenciaram atividade osteoblástica com formação de osso imaturo duas semanas após o implante. Com quatro semanas, notou-se tecido ósseo circundando partículas de HAP e início de remodelação óssea.

Geesink & Hoefnagels (1995), em implantes de hidroxiapatita colocados no fêmur de cães, observaram após seis semanas de pós-operatório tecido periosteal, osteoblastos e osteócitos maduros em contato com a hidroxiapatita, sem interferência de tecido fibroso. Heikkilla et al. (1993) relataram reação inflamatória branda ao redor do implante, estando presente apenas linfócitos e macrófagos, à semelhança do que era observado no grupo-controle. Ainda, observaram que em torno de três semanas havia fibrose ao redor do implante, e que de seis a 12 semanas havia osso lamelar recobrindo-o. Callan & Rohrer (1993) acreditam que o tecido ósseo formado em contato com a hidroxiapatita seja originário do tecido fibroso circunvizinho às partículas de HAP.

Nos estudos de Borges (1998), tecido fibrovascular circundando a HAP e tecido ósseo novo na região endosteal foi observado aos oito dias após o implante, tanto no grupo-controle como no tratado. Observou-se evolução da reparação óssea e aos 120 dias o defeito possuía característica de osso normal. O exame histológico revelou, em alguns casos, reação tipo corpo estranho caracterizada por células gigantes, macrófagos e presença de tecido conjuntivo ao redor da HAP.

Pissiotis & Spangberg (1990), em um estudo de implantação da HAP e HAP associada ao colágeno na mandíbula de cobaias, não observaram alteração da biocompatibilidade em nenhum dos dois tratamentos. Esses autores observaram que no período de oito semanas de pós-operatório o grupo implantado com HAP associada ao colágeno não apresentava indícios de reparação óssea, ao contrário do grupo tratado somente com HAP. Bell & Beirne (1988) descreveram tecido fibroso, ocasionais macrófagos e células gigantes circundando implantes de HAP e HAP associada ao colágeno, sugerindo uma resposta inflamatória mínima. As observações foram feitas com quatro e 12 semanas, sem alterações no padrão de reparação óssea em ambos os grupos.

O objetivo deste trabalho foi comparar histologicamente o efeito da hidroxiapatita sintética pura (HAP-91), associada ao colágeno (COL.HAP-91) e associada ao lipossoma (INT.HAP-91) na reparação de defeitos ósseos provocados na diáfise proximal da tíbia de cães.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados três tipos de hidroxiapatita, produzidas segundo Andrade et al. (1997): hidroxiapatita sintética pura (HAP-91) (HAP-91 JHS Laboratório Químico Ltda) que foi acondicionada em frascos de vidro e esterilizada em autoclave; INT.HAP-91 (INT.HAP-91 JHS Laboratório Químico Ltda) (98,7% de HAP-91 e 1,3% de lipossoma) e COL.HAP-91 (COL.HAP-91 JHS Laboratório Químico Ltda) (75% de HAP-91 e 25% de colágeno), as quais foram esterilizadas em óxido de etileno.

O estudo experimental foi realizado em 40 cães adultos, clinicamente sadios, sem raça definida, com média de peso corporal de 15kg, provenientes do canil experimental do Departamento de Veterinária da UFV. Foram constituídos quatro grupos, cada um com 10 animais. Os animais do grupo 1 foram tratados com HAP-91, os do grupo 2 com COL.HAP-91, os do grupo 3 receberam INT.HAP-91 e os do grupo 4 não receberam nenhum tratamento, sendo utilizados como controle.

Utilizou-se o mesmo protocolo anestésico, que constou de sedação com acepromazina (0,1mg/kg/IV) e anestesia geral com pentobarbital sódico (15mg/kg/IV). No membro pélvico esquerdo, devidamente preparado para cirurgia, foi realizada uma incisão de pele na face medial do terço proximal da tíbia esquerda, segundo Piermattei & Greeley (1988). Em seguida a musculatura foi afastada e o periósteo incisado e descolado do osso. Posteriormente, com o auxílio de perfurador ortopédico e brocas de 1,5mm, foi delimitado um fragmento ósseo retangular de aproximadamente 10 x 6mm de tamanho, até atingir o canal medular. Este fragmento foi retirado da tíbia com o auxílio de osteótomo, e a falha preenchida ou não com o substituto ósseo correspondente. Não foram utilizados antibióticos e antiinflamatórios em nenhuma fase do experimento.

Para as análises histológicas, dois animais de cada grupo foram sacrificados aos 8, 30, 60, 120 e 180 dias de pós-operatório e amostras transversais do defeito ósseo foram colhidas, fixadas em formol neutro a 10% durante 48 horas e em seguida descalcificadas (ácido fórmico a 10% em tampão citrato). Após total descalcificação, os fragmentos foram lavados em água corrente durante 24 horas, processados pela técnica rotineira de inclusão em parafina e cortados em micrótomo de rotação para obtenção de cortes histológicos com 5m m de espessura, os quais foram corados pela técnica de hematoxilina e eosina e observados ao microscópio de luz transmitida (Luna, 1968). Nas secções histológicas foi feita uma análise qualitativa descritiva, avaliando-se o padrão de regeneração do tecido.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados obtidos com o uso de hidroxiapatita sintética pura ou associada em procedimentos ortopédicos e em diferentes espécies indicam-na como substituto ósseo, considerando-se suas características vantajosas, como a biocompatibilidade (Saalfeld et al., 1994; Arakaki et al., 1995; Geesink & Hoefnagels, 1995; Kveton et al., 1995; Yamaguchi et al., 1995; Rezende et al., 1998). Atribuem-se os resultados positivos ainda à capacidade osteocondutora da hiodroxiapatita sintética, o que é um fator importante em ortopedia.

Pela histologia de secções descalcificadas, mesmo que não se consiga visualizar o estágio inicial da reparação óssea (Nelson et al., 1993), o uso dessas secções neste estudo permitiu análise detalhada do processo de reparação óssea, principalmente com relação à resposta celular.

Aos oito dias de pós-operatório, as análises histológicas do defeito ósseo dos animais dos grupos tratados mostraram um material amorfo, acelular e bem delimitado, correspondendo aos produtos utilizados para preenchimento do defeito, o que está de acordo com os resultados descritos por Heikkilla et al. (1993) e Borges (1998). Ainda, observou-se presença de tecido de granulação preenchendo o defeito ósseo, que nos animais dos grupos tratados com HAP-91 e INT.HAP-91 foi mais exuberante, caracterizado principalmente por maior número de vasos sangüíneos. Apesar de não terem sido encontrados dados na literatura que descrevessem resultado semelhante, provavelmente sugere-se um efeito angiogênico desses materiais.

Nos animais que receberam INT.HAP-91 observou-se formação de osso trabecular ao redor do implante, com numerosos osteoblastos na superfície trabecular e ostéocitos aparentemente viáveis (Fig.1). Najjar et al. (1991) descreveram tecido ósseo circundando as partículas de HAP a partir de quatro semanas, e Heikkilla (1993) e Geesink & Hoefnagels (1995), depois de seis semanas de pós-operatório. A presença desse tecido aos oito dias neste grupo sugere maior capacidade osteocondutora da INT.HAP-91, provavelmente por ação quimiotática do lipossoma sobre osteoblastos e angioblastos.

Aos 30 dias após implantação, os animais do grupo controle e os que foram tratados com HAP-91 e com INT.HAP-91 mostraram tecido ósseo trabecular preenchendo toda a falha, como descrito por Najjar et al. (1991) e Borges (1998), não observado nos animais do grupo tratado com COL.HAP-91. Estes somente mostraram formação de osso novo a partir das bordas da falha (Fig.2) e o centro do defeito manteve-se com presença de tecido fibro-vascular, o que caracteriza um retardo no processo de cicatrização óssea quando comparado aos de outros grupos.

Aos 60 dias de pós-operatório, nos animais dos grupos controle e tratados com HAP-91 e INT.HAP-91 observou-se início de remodelação do tecido ósseo lamelar que preenchia o defeito, porém nos animais que receberam INT.HAP-91 já era possível observar a formação de ósteons secundários. Nos que receberam COL.HAP-91 observaram-se trabéculas ósseas delgadas e tecido fibrocartilaginoso, a partir do qual iniciava-se a formação de osso novo (Fig.3). Pissiotis & Spangberg (1990) não constataram indícios de reparação óssea no mesmo período de pós-operatório, quando utilizaram a hidroxiapatita associada ao colágeno.

Aos 120 e 180 dias de pós-operatório todos os animais dos grupos controle e que receberam HAP-91 e INT.HAP-91 mostraram tecido ósseo maduro. Aos 180 dias, esse tecido ósseo era semelhante somente entre os animais dos grupos controle e que receberam INT.HAP-91, constituído principalmente por ósteons secundários. Os que receberam HAP-91 ainda mostraram numerosos ósteons primários com atividade de remodelação óssea. Nos animais tratados com COL.HAP-91 observou-se preenchimento incompleto do defeito ósseo, com presença de tecido fibroso. Ao contrário dessa observação, Bell & Berne (1988) não encontraram alterações no padrão de reparação óssea, quando compararam hidroxiapatita pura e hidroxiapatita associada ao colágeno. Pissiotis & Spangberg (1990) constataram que o tecido ósseo de reparação mostrava-se mais imaturo quando o implante se constituía de colágeno associado à hidroxiapatita. Baseado nessas observações pode-se inferir que a associação do colágeno com a hidroxiapatita parece diminuir a capacidade osteocondutora do material na reparação óssea.

Em um animal tratado com HAP-91 após 30 dias de cirurgia observou-se, ainda, presença do material no tecido mole adjacente ao defeito ósseo, rodeado por fina cápsula de tecido fibroso e numerosos mononucleares, sugerindo reação do tipo corpo estranho, como encontrado por Borges (1998). Em outro animal do mesmo grupo, aos 60 dias de pós–operatório, também se observou hidroxiapatita encapsulada no tecido adjacente porém sem reação inflamatória do tipo corpo estranho. Estes achados sugerem, mais uma vez, a biocompatibilidade da HAP-91. Mesmo estando próximo à região periosteal, não houve crescimento de tecido ósseo ao redor do produto localizado no tecido subcutâneo. Este fato sugere que a HAP-91 não tem efeito osteoindutor, estando de acordo com as observações de Callan & Rohrer (1993), Heikkilla et al. (1993), Borges (1998) e Rezende et al. (1998).

Com base nos resultados histológicos observados no experimento conclui-se que o processo de reparação óssea observada nos animais tratados com HAP-91 e INT.HAP-91 foi normal e semelhante ao dos animais do grupo-controle. A hidroxiapatita sintética associada ao lipossoma (INT.HAP-91) teve melhor reparação óssea e a hidroxiapatita associada ao colágeno parece possuir menor capacidade osteocondutora.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos à JHS – Laboratório Químico Ltda, na pessoa da Professora Sheila M. C. Máximo, pela valiosa colaboração científica prestada durante a elaboração deste trabalho e pelo financiamento parcial para a sua execução.

Nota: Os autores por solicitação do Corpo Editorial encaminharam dois documentos, fornecidos pela Sociedade Viçosense de Proteção aos Animais e Prefeitura Municipal de Viçosa, justificando o uso e a adoção de medidas que respeitassem os conceitos de proteção e bem estar dos animais.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Jun 2002
• Data do Fascículo
  Ago 2001

Histórico

• Recebido
  04 Jul 2000
• Revisado
  10 Jul 2001