Comparação de métodos "in vitro" para determinação da biodisponibilidade de fósforo

Comparison between "in vitro" methods to determine the bioavaiability of phosphorus

Comparação de métodos "in vitro" para determinação da biodisponibilidade de fósforo

[Comparison between "in vitro" methods to determine the bioavaiability of phosphorus]

H.C. Duarte^I; D.S. Graça^II; F.M.O. Borges^III; O.J. Di Paula^I

^IMédico Veterinário

^IIEscola de Veterinária da UFMG Caixa Posta 567 30123-970, Belo Horizonte, MG

^IIIInstituto Mineiro de Agropecuária (IMA)

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Avaliou-se a solubilidade do fósforo presente em seis fontes por meio da utilização de sete extratores. As fontes de fósforo foram: fosfato bicálcico (FB), fosfato monoamônico (MAP), fosfato supertriplo (FST), fosfato de rocha de Araxá (FRA), farinha de ossos calcinada (FOC) e farinha de ossos autoclavada (FOA). Os extratores foram: água, ácido cítrico nas concentrações de 2% (AC2), 10% (AC10), 20% (AC20) e 30% (AC30), ácido clorídrico na concentração de 0,5% (HCl) e o citrato neutro de amônio (CNA). O procedimento de laboratório foi padronizado independente do extrator utilizado. O fósforo presente no FB foi pouco solubilizado pela água (33,8%), além disso, o fósforo da FOC, da FOA e do FRA foi praticamente insolúvel nesse extrator. O HCl solubilizou o fósforo contido na FOC e no FRA da mesma forma e em níveis abaixo de 50% (42,7% e 42,9% respectivamente). O CNA solubilizou apenas 47,1% do fósforo presente na FOA e o fósforo da FOC e do FRA foi praticamente insolúvel nesse extrator. O AC2 solubilizou o fósforo presente na FOC e no FRA em níveis abaixo de 50% (38,7% e 20,8% respectivamente). Tanto o AC20 quanto o AC30 solubilizaram o fósforo presente no FRA acima de 50% (53,2% e 59,5%, respectivamente). O AC10 apresentou os resultados mais promissores como extrator para determinação indireta do valor biológico de fontes de fósforo de variadas origens, pois solubilizou o fósforo do FRA em um nível inferior a 50% (44,6%) e o fósforo das demais fontes em níveis que variaram de 82,2% a 100%.

Palavras-chave: fósforo, extrator, solubilidade, ácido cítrico

ABSTRACT

Dicalcium phosphate (FB), monoammonium phosphate (MAP), monocalcium phosphate (FST), rock phosphate from Araxá (FRA), calcinated bone meal (FOC) and steamed bone meal (FOA) were used to study phosphorus solubility by the following extractors: water, citric acid at concentrations of 2% (AC2), 10% (AC10), 20% (AC20) and 30% (AC30), hydrochloric acid at 0.5% (HCL) and ammonium neutral citrate (CAN) in standardized laboratory condition. The FB phosphorus water solubility was 33.8% while the FOC, FOA and FRA phosphorus were practically insoluble in water. The FOC and FRA phosphorus HCL solubility was respectively 42.7 and 42.9%. The FOA phosphorus solubility in CAN was 47.1% but the FOC and FRA were not soluble. The FOC and FRA phosphorus solubility in AC2 extractor were 38.7 and 20.8% while those for FRA phosphorus were 53.2 and 59.5%, respectively. The best results were observed for phosphorus solubility using AC extractors. They can be used as a guide for the biological value of phosphorus from the studied sources based on the FRA phosphorus solubility (44.6) and the 82.2%-100% phosphorus solubility from the other studied sources.

Keywords: phosphorus, solubility, extractor, citric acid

INTRODUÇÃO

Biodisponibilidade de um nutriente é a proporção ou porcentagem do nutriente consumido que pode ser absorvida pelo intestino, tornando-se disponível para uso no metabolismo ou para estocagem nos tecidos animais. A biodisponibilidade também é definida como a proporção do nutriente que pode ser utilizada para garantir os processos fisiológicos do animal (Veloso, 1991). nenhum composto fosfatado apresenta o fósforo completamente disponível (Calcium..., 1978), assim, supõe-se que a biodisponibilidade varia entre as diversas fontes de fósforo e que essas diferenças podem ser medidas para comparação das fontes de fósforo no suplemento mineral (Veloso, 1991).

De acordo com Guéguen (1995b), a diversidade de métodos e formas de expressão da biodisponibilidade de fósforo é motivo de discussão pelos técnicos e pela indústria de rações. Este problema deve ser resolvido como primeiro passo para se regularem as ofertas alimentares à necessidade do animal (Jackson et al., 1988). Ultimamente tem-se dispensado atenção ao desenvolvimento de técnicas de laboratório que sejam apropriadas para a mensuração da qualidade de fosfatos usados na alimentação. Os métodos para avaliação da biodisponibilidade de fósforo nos alimentos e nas fontes de suplementação podem, segundo Guéguen (1995b) e Nicodemo et al. (1998), ser classificados genericamente em métodos in vivo e in vitro. Os estudos sobre o valor biológico in vivo não são usados como provas de rotina na indústria de suplementos minerais. Assim, são tomados valores comparativos com base na reatividade e solubilidade de diferentes fosfatos usados na alimentação animal. Essa percentagem de solubilidade não deve ser confundida com o potencial de absorção. É simplesmente um método de classificação de fosfatos com valor biológico de médio a baixo e não identifica diferenças entre fosfatos de alta qualidade.

Existe na literatura discordância em relação à correlação entre os valores de solubilidade e biodisponibilidade (Gillis et al.,1962; Sullivan et al., 1992). Além disso, manuais de fertilizantes como o do LANARV (Laboratório Nacional de Referência Vegetal; Análise..., 1983) apresentam para cada extrator uma rotina diferente quanto à diluição e ao tempo de extração, entre outras. Por isso, torna-se incorreto comparar a eficiência de um extrator quando existem tantas variáveis envolvidas. Os objetivos deste trabalho foram comparar diferentes extratores comumente usados em testes de solubilidade de fósforo e propor novas substâncias que possam fornecer valores de solubilidade de fósforo mais próximos aos valores de disponibilidade obtidos in vivo na literatura. Também foi objetivo padronizar a rotina usada para avaliar a solubilidade do fósforo das fontes estudadas nos extratores propostos.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados no experimento seis fontes de fósforo: fosfato bicálcico (FB), fosfato monoamônico (MAP), fosfato supertriplo (FST), farinha de ossos calcinada (FOC), farinha de ossos autoclavada (FOA) e fosfato de rocha de Araxá (FRA). Os extratores usados foram: água, ácido cítrico nas concentrações de 2% (AC2), 10% (AC10), 20% (AC20) e 30% (AC30), ácido clorídrico na concentração de 0,5% (HCl) e citrato neutro de amônio (CNA). Todas as fontes foram avaliadas em triplicata dentro de cada extrator.

Em função da granulometria das amostras dos fosfatos, todos os suplementos foram macerados até peneira de 42 Tyler. Tansferiu-se um grama do material homogeneizado para garrafa de Stohlman de 500ml, onde foram adicionados 100ml do extrator. O material foi submetido ao agitador de Wagner (40rpm) por 30 minutos e em seguida filtrado (papel faixa preta), do qual retirou-se uma alíquota que continha de 10 a 25mg de pentóxido de fósforo (P₂O₅). Para evitar saturação da capacidade de precipitação do agente usado na análise, no momento do cálculo da alíquota considerou-se o fósforo total das fontes, independentemente de sua solubilidade nos diferentes extratores. A alíquota foi transferida para Erlenmeyer de 500ml e o meio foi acidificado com 10ml de ácido nítrico (HNO₃) 1:1. O volume foi completado até 100ml com água destilada e o recipiente levado à fervura. Após a fervura foram adicionados 50ml de reagente Quimosiac em agitação e os frascos retornados à fervura. Após a fervura, foi feita pausa de um minuto antes de se retirar o material da placa aquecedora. Durante o resfriamento à temperatura ambiente, cada recipiente foi agitado três vezes. O material foi filtrado em cadinho de vidro sinterizado de 30ml com porosidade fina adaptado a sistema de vácuo. Cada Erlenmeyer foi lavado com água destilada até estar limpo e o conteúdo do cadinho foi ainda lavado com três porções de água destilada. O material foi pesado após ser seco em estufa a 250ºC por 30 minutos.

Como o material foi pesado na forma de (C₉H₇N)3H₃[PO₄.12MoO₃], o cálculo da % de P₂O₅ solúvel foi:

O fator (F) para a relação de um grama de amostra em 100ml de extrator é 320,7. Para obter o fósforo solúvel, o teor de P₂O₅ solúvel foi dividido por 2,14.

O delineamento utilizado foi o inteiramente ao acaso e os dados foram submetidos à análise de variância, com as médias sendo comparadas pelo teste SNK (P<0,05; SAS, 1985).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os dados da Tab. 1 mostram a solubilidade dos seis fosfatos nos sete extratores estudados.

A solubilidade em água, que não é necessária para absorção, não é aceita como indicador da disponibilidade dos fosfatos, uma vez que muitos fosfatos insolúveis em água estão bem disponíveis aos animais (Rosa, 1991). No experimento foi verificado que a solubilidade em água do fosfato monoamônico e do fosfato supertriplo foi praticamente total. Em relação ao fosfato bicálcico, de valor biológico alto, tomado como padrão (100% disponível) na maior parte dos estudos de biodisponibilidade in vivo, a solubilidade em água foi baixa. Fontes como a farinha de ossos calcinada e a farinha de ossos autoclavada, com valor biológico variando de 65 a 100% (Cromwel, Coffey, 1993), são praticamente insolúveis em água, conseqüentemente ela é de pouco valor para predição da disponibilidade biológica dessas fontes de fósforo.

A solubilidade em ácido clorídrico foi superior a 96% para fosfato bicálcico, fosfato monoamônico e fosfato supertriplo, que não diferiram entre si (P<0,05). A solubilidade da farinha de ossos autoclavada foi de 73,8% e diferiu (P<0,05) das solubilidades apresentadas pela farinha de ossos calcinada e pelo fosfato de rocha de Araxá (42,7% e 42,9%, respectivamente) estas iguais entre si (P<0,05). De acordo com Lima (1995), os fosfatos de rocha, como o fosfato de rocha de Araxá, têm disponibilidade biológica inferior a 50%, dessa forma essa prova in vitro não foi capaz de separar, em relação à solubilidade, uma fonte de valor biológico relativamente inferior de outra de valor biológico de médio a alto como a farinha de ossos calcinada.

A solubilidade em citrato de amônio é utilizada como método de laboratório para fosfatos alimentícios. Resultados comparativos mostram correlação positiva entre solubilidade em citrato de amônio neutro e parâmetros ósseos ou respostas de ganho de peso em aves (Rostagno, 1990; Guéguen, 1995b; Nicodemo, Barrocas, 1995; Rostagno, 1995). O fósforo contido nos fosfatos tricálcicos básicos, caso da hidroxiapatita dos ossos, é praticamente insolúvel nesse extrator. Como o fósforo contido na farinha de ossos e no fosfato desfluorizado têm alta biodisponibilidade (Borges et al., 1997; Veloso et al., 1996), esse teste não é um bom indicador de valor biológico relativo. Essas afirmações são coerentes com os resultados encontrados nesse experimento que mostram as solubilidades do fosfato bicálcico, do fosfato monoamônico e do fosfato supertriplo superiores a 95% e iguais entre si (P>0,05). As solubilidades da farinha de ossos autoclavada e da farinha de ossos calcinada foram inferiores aos valores biológicos relatados na literatura para essas fontes por meio de testes in vivo. O fosfato de rocha de Araxá foi praticamente insolúvel em citrato neutro de amônio, o que indica a não aplicabilidade desse teste se se considerar a literatura, a qual mostra que os fosfatos de rochas podem alcançar biodisponibilidades de até 50% (Maia, 1983).

A solubilidade em ácido cítrico a 2,0%, de acordo com o método convencional (1g de amostra em 200ml de solução de ácido cítrico, em agitação por 2h), é amplamente utilizada na França desde 1975 para predizer o valor biológico de fosfatos (Guéguen, 1995b). O regulamento vigente no Brasil determina que os rótulos dos suplementos de minerais mencionem a solubilidade do fósforo em ácido cítrico a 2%, relação 1:1, para as fontes de fósforos utilizadas nas misturas de minerais, sendo de 90% o valor mínimo aceitável. Sullivan et al. (1992) verificaram alta correlação entre o teste e o valor biológico. Yoshida et al. (1979), ao testarem várias diluições do ácido cítrico, encontraram correlação de 0,763 entre solubilidade em ácido cítrico na concentração de 0,5% e disponibilidade biológica de várias fontes de fósforo. De acordo com Guéguen (1995a), a solubilidade em ácido cítrico é maior que 85% para todos os fosfatos com disponibilidade biológica alta e menor que 50% para fosfatos de disponibilidade baixa.

Diferentes concentrações de ácido cítrico foram empregadas no presente experimento para se obter uma prova capaz de separar de forma adequada os fosfatos nessas duas categorias, independente de sua origem. Quando foi testado o ácido cítrico a 2% como extrator, fosfato bicálcico, fosfato supertriplo, fosfato monoamônico e farinha de ossos autoclavada apresentaram solubilidades superiores a 95% e não diferiram entre si (P<0,05). Entretanto, a solubilidade da farinha de ossos calcinada, que de acordo com a literatura apresenta valor biológico de médio a alto, foi inferior a 40%. Para concentrações de ácido cítrico entre 10 e 30%, verificou-se que fosfato bicálcico, fosfato monoamônico e farinha de ossos autoclavada apresentaram solubilidades superiores a 99%. A solubilidade do fosfato supertriplo foi superior a 97% quando a concentração de ácido cítrico no extrator variou de 10 a 30%, porém foi significativamente diferente (P<0,05) das fontes anteriores. A farinha de ossos calcinada apresentou solubilidade superior a 80% tanto em ácido cítrico a 10% quanto em ácido cítrico a 20% e foi completamente solúvel em ácido cítrico a 30%. O fosfato de rocha de Araxá apresentou solubilidade superior a 50% em ácido cítrico nas concentrações de 20% e 30%. Quando se utilizou o ácido cítrico como extrator na concentração de 10% a solubilidade do fosfato de rocha de Araxá foi inferior a 50%.

CONCLUSÕES

Como a água solubilizou menos de 50% do fósforo presente no fosfato bicálcico, não é indicada como extrator para testes in vitro. O citrato neutro de amônio solubilizou menos de 50% do fósforo presente na farinha de ossos autoclavada não sendo indicado como extrator para testes in vitro. O ácido clorídrico a 0,5% e o ácido cítrico a 2% não são indicados como extratores pois solubilizaram menos de 50% do fósforo presente na farinha de ossos calcinada. O ácido cítrico, nas concentrações de 20 e 30%, não é recomendado como extrator para testes in vitro porque solubilizou mais de 50% do fósforo contido no fosfato de Araxá. O ácido cítrico na concentração de 10% é o extrator mais indicado, pois solubilizou acima de 80% do fósforo das fontes de média a alta biodisponibilidade e menos de 50% da fonte cujo fósforo é reconhecidamente de baixo valor biológico.

GUÉGUEN, L. Determination of availability. Feed mix, p. 12- 15, special issue, 1995b.

Recebido para publicação em 1 de fevereiro de 2002

Recebido para publicação, após modificações, em 7 de outubro de 2002

Projeto financiado pela FAPEMIG/CNPq

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Abr 2003
• Data do Fascículo
  Fev 2003

Histórico

• Aceito
  07 Out 2002
• Recebido
  01 Fev 2002