Proliferação de linfócitos e apoptose de células CD5+ de bovinos infectados pelo vírus da leucose enzoótica bovina

Apoptosis of CD5+ cells and lymphocyte proliferation in bovine leukemia virus-infected dairy cows

MEDICINA VETERINÁRIA

Proliferação de linfócitos e apoptose de células CD5⁺ de bovinos infectados pelo vírus da leucose enzoótica bovina

Apoptosis of CD5⁺ cells and lymphocyte proliferation in bovine leukemia virus-infected dairy cows

F.N. Souza^I; A.O. Latorre^II; B.D. Caniceiro^II; M. Sakai^II; K. Kieling^II; M.G. Blagitz^I; A.M.M.P. Della Libera^I

^ILaboratório de Imunodiagnóstico - Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - Universidade de São Paulo. Av. Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva, 87 - 05508-270 - São Paulo, SP

^IILaboratório de Farmacologia e Toxicologia - Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - Universidade de São Paulo - São Paulo, SP

RESUMO

Avaliaram-se a proliferação de linfócitos e a apoptose de células CD5⁺ de bovinos naturalmente infectados pelo vírus da leucose enzoótica bovina. Para tal, 100 vacas da raça Holandesa, em lactação, foram triadas quanto ao sorodiagnóstico para a leucose enzoótica bovina e o perfil hematológico, e 15 foram escolhidos e distribuídos uniformemente entre os três grupos, a saber: animais negativos, animais positivos alinfocitóticos e animais positivos e que manifestaram linfocitose persistente (LP). Para a avaliação da proliferação de linfócitos, procedeu-se ao isolamento das células mononucleares por gradiente de centrifugação, em que 2x10⁶ linfócitos por mL foram plaqueados por poço e analisados por citometria de fluxo utilizando-se o fluorocromo CFSE-DA. A apoptose do sangue periférico deu-se utilizando a anexina V-FITC, e para a identificação das células CD5⁺, utilizaram-se anticorpos monoclonais. Ocorreu menor proliferação de linfócitos nos animais infectados e que manifestavam LP, e menor apoptose de células CD5⁺ do sangue periférico. Pode-se sugerir que o desenvolvimento da LP, resultante do aumento de linfócitos B, deve-se à redução do processo apoptótico das células CD5+, principal população infectada, e que a maior proliferação linfocitária pode se restringir apenas ao estádio inicial do desenvolvimento da LP.

Palavras-chave: leucose enzoótica bovina, proliferação de linfócito, apoptose

ABSTRACT

The purpose of the present trail was to evaluate the lymphocyte proliferation and the apoptosis rates of CD5⁺ cells in dairy cows infected with bovine leukemia virus (BLV) with distinct lymphocyte profiles in infected animals known as alymphocytotic (AL) and persistent lymphocytosis (PL). A total of 100 Holstein cows were sera tested for bovine leukemia virus through agar gel immunodiffusion (AGID) and enzyme-linked immunosorbent-assay (ELISA). From these animals, 15 cows were selected and divided uniformly in 3 groups (negative, AL, LP). The lymphocyte proliferation was performed using flow cytometric measurement of CFSE-DA dye, where 2x10⁶/mL lymphocytes were plated per well. The apoptosis of CD5⁺ cells from peripheral blood was performed using the annexin V-FITC to measure the apoptosis rates and the identification of CD5⁺ was accessed using monoclonal antibodies. Animals from the LP group showed lower lymphocyte proliferation and also lower apoptosis rates of CD5⁺ cells compared with negative and AL animals. The development of PL which resulted from an increase in B cell count, is due to the decrease in the apoptosis rates of CD5⁺ cells, and the higher lymphocyte proliferation appears to be limited only in the initial stages of development of LP.

Keywords: bovine leukemia virus, lymphocyte proliferation, apoptosis

INTRODUÇÃO

O vírus da leucose enzoótica bovina (VLEB) é um dos mais prevalentes patógenos em vários países, principalmente em rebanhos leiteiros. É um deltaretrovírus oncogênico associado ao desenvolvimento da linfocitose persistente (LP) e dos linfossarcomas em bovinos. A LP é caracterizada por elevação crônica do número de linfócitos circulantes, no caso linfócitos B, sendo encontrada em aproximadamente 20 a 30% dos animais infectados (Gillet et al., 2007). Tumores nos órgãos linfoides são encontrados em cerca de 0,1 a 10% dos animais infectados, enquanto a maioria dos animais infectados permanecem assintomáticos ou alinfocitóticos (AL) (Gillet et al., 2007).

A homeostase de linfócitos é resultado do balanço crítico entre a proliferação e a morte celular. A ruptura deste equilíbrio pode levar à manifestação da LP (Debacq et al., 2002). Assim, a modulação do processo apoptótico associado ou não ao aumento da proliferação celular pode refletir no aumento dos linfócitos B circulantes, que geralmente coexpressam a molécula CD5 e a integrina CD11b, nos animais infectados pelo VLEB manifestando LP (Debacq et al., 2003). Tal modulação pode ser responsável pela persistência da infecção e/ou pela progressão da enfermidade, enquanto células infectadas que apresentam antígenos virais são reconhecidas e eliminadas pelo hospedeiro (Gillet et al., 2007).

O presente estudo buscou avaliar a proliferação de linfócitos e a apoptose de células CD5+ em vacas da raça Holandesa, em lactação, infectadas pelo VLEB e que manifestavam ou não LP.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram coletadas amostras de sangue de 100 fêmeas bovinas adultas da raça Holandesa, oriundas de rebanhos destinados à produção de leite, localizados no estado de São Paulo. Dentre estes, 15 foram escolhidos e distribuídos uniformemente em três grupos, conforme o resultado do sorodiagnóstico e do leucograma, em: animais com sorodiagnóstico negativo (grupo-negativo), animais com sorodiagnóstico positivo alinfocitóticos (grupo AL) - em que foram escolhidos animais sem alterações hematológicas conforme critérios estabelecidos para a espécie (Divers e Pike, 2008) e sem alterações clínicas evidentes - e animais com sorodiagnóstico positivo e que apresentavam LP (grupo LP). A persistência da linfocitose deu-se após período de 72 dias, sendo considerados animais com LP aqueles com contagem total de linfócitos acima de a 10x103/µL e contagem total de leucócitos acima de 15x103/µL, conforme critérios estabelecidos por Brenner et al. (2007).

A análise hematológica foi realizada por meio da mensuração pelo aparelho ABX^® (Horiba ABX Diagnostics, Montpellier, França), em que se obteve a contagem total de leucócitos por microlitro, que foi complementada pela contagem diferencial em esfregaços sanguíneos.

O sorodiagnóstico da leucose enzoótica bovina (LEB) foi realizado por kit comercial de IDGA (Tecpar^®, Curitiba, Brasil), e por kit comercial de ELISA (VRMD, Pullman, EUA, nº. cat. 284-5), mediante a detecção da glicoproteína gp51 do VLEB, conforme recomendações do fabricante.

As células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foram isoladas por gradiente de densidade Ficoll-Paque^TM Plus^® (GEHeathcare, EUA, nº. cat. 17-1440-03) (densidade 1,077g/cm³) em fluxo laminar. Resumidamente, 10mL de sangue periférico foram adicionados a 10mL de meio de cultura celular RPMI-1640^® (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA, nº. cat. R7638) contendo 2mM de L-glutamina (GIBCOTM Invitrogen, Grand Island, EUA, nº. cat. 21051-024) e 5 x 10^-2mM de 2-mercaptoetanol (Invitrogen, Grand Island, EUA, nº. cat. 21985-023). A solução celular resultante foi, então, cuidadosamente colocada sobre a fase de Ficoll e submetida à centrifugação (700g) por 40 minutos a 18ºC. Após a centrifugação, a camada de células mononucleares, localizada na interfase entre a camada de Ficoll e constituintes do plasma, foi coletada e transferida para tubo cônico de 15mL, que foi completado com RPMI-1640^®, e submetido à centrifugação (250g) por oito minutos. Posteriormente, procedeu-se à lise das hemácias utilizando-se 10mL de solução de cloreto de amônio (0,8% de NH₄Cl, 0,1mM EDTA). Realizada nova centrifugação (250g por 8 minutos), o botão celular resultante foi ressuspendido em 4mL de RPMI-1640^®.

A avaliação da proliferação celular deu-se pela utilização do CFSE-DA (5-(6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) - 5mM/mL - (Invitrogen, Carlsbad, EUA, nº. cat. C1157), como descrito por Lyons e Parish (1994), Lyons (2000) e Hawkins et al. (2007). Os ensaios de proliferação linfocitária também foram induzidos por concavalina-A tipo III (10µg/mL) (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA, nº. cat. C2631) e por lipopolissacárides (LPS) de Escherichia coli (cepa O127:B8) (25µg/mL) (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA, nº. cat. L3129).

Para as avaliações da proliferação dos linfócitos, o sangue periférico foi inicialmente submetido à separação de mononucleares por gradiente de densidade Ficoll, como anteriormente descrito. As células foram, então, contadas em câmara de Neubauer com azul de Trypan (EMD Chemicals Inc., Gibbstown, EUA, cat. nº 368-12), o que permitiu verificar a viabilidade dos linfócitos, bem como o ajuste do número de células para 1x10⁷ células/mL.

Mediante a obtenção e o ajuste do número de linfócitos, adicionou-se às amostras 1µL do fluorocromo CSFE-DA, que foi incubado por 20 minutos em estufa a 37ºC, 5% CO₂. Posteriormente, centrifugaram-se e ressuspenderam-se as amostras em RPMI-1640^® estéril contendo 10% de soro fetal bovino (Vitrocell, Campinas, Brasil), 2mM de L-glutamina, 5 x 10²mM de 2-mercapoetanol. Realizou-se o reajuste celular para 2,2x10⁶ células/mL, com o objetivo de ter 2x10⁵ células por poço de cultura (90µL). Ajustadas, as suspensões celulares foram plaqueadas em triplicata, juntamente com seus respectivos estímulos (10µL), e mantidas em cultura celular em estufa a 37ºC, 5% de CO₂ por três dias, para posterior avaliação por citometria de fluxo, onde 50.000 eventos foram adquiridos.

O cálculo da proliferação deu-se pela análise da população correspondente aos linfócitos, no software FlowJo, que calcula a progressão geométrica de decaimento do fluorocromo CFSE das células. Considerou-se que cada célula plaqueada continha 100% do CFSE fornecido, ao realizar mitose, e 50% restaria de fluorocromo em cada célula-filha. Estas, à divisão, fornecem 25% a cada célula-filha, cujas filhas, por sua vez, passariam a ter 12,5% do fluorocromo, e assim sucessivamente (Lyons e Parish, 1994; Lyons, 2000).

A expressão da fosfatilserina (FS) na superfície celular é um dos marcadores precoces do processo apoptótico. A identificação da porcentagem de células CD5⁺ sofrendo apoptose foi realizada utilizando-se a anexina V-FITC (APOPTEST^TM-FITC, Dako Cytomation, Finlândia, cat. Number K2350) e analisada por citometria de fluxo, como descrito por Vermes et al. (1995), com algumas modificações.

Para tal, 100µL de sangue venoso heparinizado foram utilizados. Inicialmente, os eritrócitos, lisados e submetidos à centrifugação, foram ressuspendidos em 1,000µL de tampão de ligação (10mM Hepes/ 150mM NaCl/1mM MgCl₂, 1,8mM CaCl₂). Posteriormente, submeteram-se as amostras à nova centrifugação e ressuspensão em 100µL de tampão de ligação com anexina V-FITC, e, finalmente, incubou-se a suspensão celular por 20 minutos à temperatura ambiente, sob ausência de luminosidade.

A quantificação da população de linfócitos CD5⁺ do sangue total foi realizada utilizando-se anticorpo monoclonal primário: mouse IgG2a anti-bovine CD5 (VRMD, Pullman, EUA, nº. cat. B29A), e anticorpo monoclonal secundário goat anti-mouse IgG2a conjugado ao fluorocromo ficoeritrina (PE) (Invitrogen, Carlsbad, EUA, nº. cat. M32204). Para tal, as amostras, após a realização do ensaio para determinação do processo apoptótico, foram centrifugadas a 250g por oito minutos. O botão celular resultante foi ressuspendido em 100µL de tampão de ligação e, então, incubado com 1µL do anticorpo primário por 30 minutos à temperatura ambiente, sob ausência de luminosidade. Mais uma vez, foi adicionado a cada tubo 1 mL de tampão de ligação e submetido à centrifugação (250g) por oito minutos. Posteriormente, as amostras foram ressuspendidas em 100µL de tampão de ligação e incubadas com 1µL do anticorpo secundário por 30 minutos à temperatura ambiente, sob ausência de luminosidade. Logo após, adicionou-se 1mL de tampão de ligação e submeteu-se à centrifugação. As amostras foram ressuspendidas em 300µL de tampão de ligação e, então, analisadas por citometria de fluxo FACSCalibur^TM (Becton Dickinson Immunocytometry SystemTM, San Diego, EUA), em que 20.000 eventos referentes à população de linfócitos CD5⁺ foram adquiridos.

A distribuição de Gaussian foi confirmada pelo teste de Kolmogorov e Smirnov. Posteriormente, os dados foram submetidos à analíse de variância para se verificar as diferenças entre os grupos. Caso houvesse diferença significativa, procedeu-se ao teste de Tukey-Kramer para comparações múltiplas entre as médias. A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa GraphPad Prisma 5.0 software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA). Foram consideradas significantes as análises que apresentaram P<0,05.

RESULTADOS

Os resultados da sorologia demonstraram 25,0% de animais reagentes ao sorodiagnóstico por IDGA e 87,0% ao sorodiagnóstico por ELISA. Os dados hematológicos dos 15 animais utilizados segundo os grupos são apresentados na Tab. 1.

A proliferação basal de linfócitos dos 15 animais utilizados no presente estudo sob os diferentes mitógenos e/ou estímulos divididos nos seus respectivos grupos está apresentada na Tab. 2.

A porcentagem de linfócitos CD5⁺ do sangue periférico sofrendo apoptose (CD5⁺/annexin V-FITC⁺) foi de 0,56±0,34%ª; 0,60±0,35%ª; e 0,11±0,08%^b (P = 0,031) nos grupos negativo, AL e LP, respectivamente. Como esperado, a viabilidade de células CD5⁺ (CD5⁺/annexin V-FITC-) foi significantemente maior no grupo LP (99,9±0,08%) (P = 0,031) se comparado aos grupos negativos (99,44±0,34%) e AL (99,4±0,35%).

DISCUSSÃO

Verificou-se menor proliferação de linfócitos nos animais do grupo LP associada à redução da apoptose de células CD5⁺. De fato Debacq et al. (2003), Florins et al. (2007) e Florins et al. (2008) relataram menor expansão clonal de linfócitos associado à redução da morte celular nos animais infectados pelo VLEB que manifestaram LP. Debacq et al. (2002), ao avaliarem a proliferação de linfócitos em ovelhas, encontraram maior proliferação de linfócitos nos animais infectados pelo VLEB. Tal fato enfatiza a importância da condição e do modelo experimental envolvidos. Amills et al. (2002) também verificaram redução da expressão de interleucina- 2 (IL-2), que é a principal citocina envolvida com a proliferação linfocitária nestes animais.

Foi proposto, entretanto, que a proliferação de linfócitos pudesse ocorrer em outros sítios - linfonodos, placas de payer ou medula óssea, e subsequentemente, Debacq et al. (2006) confirmaram este fato em ovelhas. Apesar de as ovelhas se apresentarem como modelo para o estudo da manifestação da LP na infecção pelo VLEB, esta espécie não é hospedeira natural do vírus, visto que a transmissão não ocorre entre ovinos e bovinos. Adicionalmente a isto, a patogênese da infecção pelo VLEB apresenta-se mais aguda em ovinos, resultado do menor período de latência anterior ao desenvolvimento da LP. Além disso, quase todos os ovinos infectados sucumbem em decorrência da infecção pelo VLEB, o que ocorre em apenas cerca de 5% dos bovinos. Uma das principais diferenças refere-se á carga viral, em que a maioria dos bovinos que permanece clinicamente saudável apresenta apenas 1% ou menos dos leucócitos infectados e a carga viral permanece relativamente constante por longo período. Em ovinos, o número de células infectadas aumenta gradualmente até o início da leucemia; desse modo, essas observações ilustram a diferença da indução da patogênese pelo VLEB nessas espécies (Florins et al., 2007).

Debacq et al. (2004) também demonstraram que o pico da proliferação de linfócitos ocorre logo anterior à soroconversão e à alta carga viral em ovinos. Dessa forma, pode-se sugerir que a maior proliferação linfocitária em bovinos infectados pelo VLEB pode restringir-se apenas aos estágios iniciais da infecção, e que a LP persiste pela modulação do processo apoptótico pelo vírus, como descrito por Schwartz-Cornil et al. (1997), Cantor et al. (2001), Florins et al. (2007) e Gillet et al. (2007).

Cantor et al. (2001) encontraram, em bovinos infectados, redução do processo apoptótico em animais infectados que manifestaram LP, sugerindo que, embora a magnitude dessa redução seja relativamente pequena in vitro, os efeitos biológicos poderiam ser altos. Takahashi et al. (2004) relataram que células B infectadas que não expressavam o VLEB eram menos propensas a sofrer apoptose ex-vivo.

Sabe-se que a persistência da infecção ocorre possivelmente associada à diferença da expressão de antígenos virais nas células infectadas, o que resulta na eliminação das células que os expressam (Florins et al., 2007; Gillet et al., 2007). Este fato é de extrema importância, visto que, logo após a infecção, a atividade da resposta humoral e citotóxica é capaz de abolir a replicação viral, permitindo apenas a expansão clonal das células portadoras do provírus, o que poderia justificar a maior proliferação de linfócitos em se restringir apenas aos estágios iniciais da infecção.

A supressão viral in vitro por anticorpos anti-VLEB e por inibidores da proteína quinase C reduz a proliferação celular (Stone et al., 2000). A expressão de proteínas virais é detectada em 5 a 15% das células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de animais com LP, sendo a maioria dessas células correlacionadas com a inibição do processo apoptótico, corroborados pelo fato de a expansão clonal ocorrer em apenas 3% dos linfócitos que expressam o vírus (Stone et al., 2000).

CONCLUSÕES

O desenvolvimento da LP deve-se à redução do processo apoptótico pelas células CD5⁺, principal população infectada pelo VLEB, e a maior proliferação linfocitária pode restringir-se apenas ao estágio inicial do desenvolvimento da LP.

AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro concedido (projeto 07/56069-8).

Recebido em 19 de abril de 2010

Aceito em 13 de abril de 2011

E-mail: [e-mail]

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Nov 2011
• Data do Fascículo
  Out 2011

Histórico

• Aceito
  13 Abr 2011
• Recebido
  19 Abr 2010