In vitro inhibition and inactivation activity of Salmonella spp. by plant extracts with spicy or medicinal ethnographic indicative

abmvz Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 0102-0935 1678-4162 Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinária Belo Horizonte, MG, Brazil The in vitro intensity of bacterial inhibition activity of diverse extracts (aquous, alcoholic, or hydroalcoholic) from 86 plants with medicinal and spicy ethnographic indicative, from Porto Alegre City, Rio Grande do Sul State, Brazil, were determinated in Salmonella spp. (S. enteritidis ATCC n.13076, S. cholera-suis ATCC n. 10708, or S. gallinarum CPVDF-SAA/RS/BR) in challenge dose <10(7)CFU.mL-1. Extracts of fifty plants presented some anti-Salmonella selective activity, while the other 36 extracts presented no activity. It is discussed the validity of ethnographic search instruments in the prospection of anti-bacterial protection factors in plants, as well the influence of inhibition/inactivation results in the predictivity of bacteriological diagnostic. MEDICINA VETERINÁRIA Inibição e inativação in vitro de Salmonella spp. com extratos de plantas com indicativo etnográfico medicinal ou condimentar In vitro inhibition and inactivation activity of Salmonella spp. by plant extracts with spicy or medicinal ethnographic indicative J.M. WiestI; H.H.C. CarvalhoI; C.A.M. AvanciniII; A.R. GonçalvesII IInstituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos - UFRGS Caixa Postal 15090 91501-970 - Porto Alegre, RS IIFaculdade de Veterinária - UFRGS - Porto Alegre, RS IIIFaculdade de Veterinária - UFPel - Pelotas, RS RESUMO Determinou-se in vitro a intensidade de atividade de inibição bacteriana e a intensidade de atividade de inativação bacteriana, por meio de testes de diluição e suspensão em sistema de tubos múltiplos, de diferentes extratos, aquosos ou alcoólicos/hidroalcoólicos, de 86 plantas com indicativo etnográfico medicinal ou condimentar acessadas na região metropolitana de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, frente a Salmonella spp., ou S. enteritidis ATCC nº 13076, ou S. cholera-suis ATCC nº10708, ou S. gallinarum CPVDF-SAA/RS/BR, em doses-desafio de <107UFC.mL-1. Cinquenta plantas apresentaram alguma atividade seletiva antissalmonela, e 37 nenhuma atividade. Discute-se a validade da ferramenta etnográfica na prospecção de fatores de proteção antibacteriana em plantas, bem como a influência da inibição/inativação na preditividade do diagnóstico bacteriológico. Palavras-chave: planta medicinal, atividade antibacteriana, inibição, inativação, Salmonella spp. ABSTRACT The in vitro intensity of bacterial inhibition activity of diverse extracts (aquous, alcoholic, or hydroalcoholic) from 86 plants with medicinal and spicy ethnographic indicative, from Porto Alegre City, Rio Grande do Sul State, Brazil, were determinated in Salmonella spp. (S. enteritidis ATCC n.13076, S. cholera-suis ATCC n. 10708, or S. gallinarum CPVDF-SAA/RS/BR) in challenge dose <107CFU.mL-1. Extracts of fifty plants presented some anti-Salmonella selective activity, while the other 36 extracts presented no activity. It is discussed the validity of ethnographic search instruments in the prospection of anti-bacterial protection factors in plants, as well the influence of inhibition/inactivation results in the predictivity of bacteriological diagnostic. Keywords: medicinal plant, antibacterial activity, inhibition, inactivation, Salmonella spp. INTRODUÇäO A importância do gênero Salmonella em saúde coletiva permanece em evidência, considerando sua resistência no meio externo, mais especificamente em resíduos, dejetos, alimentos para consumo humano e animal, solo e águas de abastecimento, manifestando-se tanto individualmente como em centenas de indivíduos por meio de surtos. Sua verdadeira incidência é difícil de ser avaliada, considerando as deficiências da vigilância epidemiológica e de sua relação com a notificação, o que não impede o aumento significativo do número de focos constatados (Acha e Szyfres, 2003). Nesse sentido, em saúde e produção animal, com consequente repercussão na cadeia alimentar, Castagna et al. (2004) demonstraram a presença de Salmonella sp. no trato intestinal e em tonsilas/linfonodos submandibulares de suínos, em 79% das amostras utilizadas no preparo de embutidos, constituindo importante fator de risco para a contaminação de carcaças utilizadas na fabricação desses produtos. Silva et al. (2006) descreveram a difusão da infecção em um rebanho suíno por Salmonella sp. por meio de isolamentos e sorologia, desde a fase de maternidade, creche e terminação, comprovando a crescente contaminação dos animais, inclusive em amostras de ração alimentar, concluindo que a terminação constitui o ponto crítico de contaminação e a ração uma importante fonte de infecção. Na epidemiologia e profilaxia de doenças transmissíveis, a pesquisa de fatores de proteção sustentáveis, alternativos, dirigida a recursos naturais renováveis, como plantas com indicativo medicinal, condimentar ou aromático, constitui prioridade segundo a Organização Mundial da Saúde/Conferências Mundiais de Saúde (Akerele, 1988, 1993; Cultura..., 1984, 1985, 1990), com ênfase aos aspectos culturais tradicionais envolvidos e sua relação com a atenção básica em saúde coletiva, em alimentos/alimentação e em saúde e produção animal. No Brasil, a pesquisa da atividade antimicrobiana em plantas com indicativo medicinal, condimentar ou aromático vem merecendo ênfase, como demonstram os trabalhos desenvolvidos por Lemos et al. (2000) e Avancini e Wiest (2008a), que pesquisaram especificamente a atividade bactericida de macela (Achyrocline satureoides, Lam. DC - Compositae) e de escadinha ou sinapismo (Hypericum caprifoliatum, Cham. Schlecht - Guttiferae), respectivamente, relacionada com mastites bovinas; Avancini e Wiest (2008b), que estudaram 36 plantas com indicativo etnográfico medicinal da Mata Atlântica residual em Porto Alegre, com ênfase à etnomedicina veterinária, etnosotaxia e etnoterapêutica de doenças de pele como referência para a seleção e avaliação preliminar da atividade antibacteriana; Carvalho et al. (2005), que avaliaram situações envolvendo bacteriostasia e bactericidia de 32 plantas com indicativo etnográfico condimentar, incluindo Salmonella sp., indicando 12 plantas com efetiva e seletiva atividade antibacteriana; Sousa e Wiest (2007), que pesquisaram especificamente bacteriostasia e bactericidia em diferentes extratos de garupá (Aloysia gratissima), também incluindo Samonella sp. Na área de patologia humana, Alvarenga et al. (2007) testaram extratos aquosos e etanólicos de diferentes plantas sobre bactérias patogênicas, entre elas Salmonella cholera-suis. O Grupo de Pesquisa Alimentos de Origem Animal/CNPq/MCT/Brasil vem se dedicando, desde 1995, à prospecção preliminar, dentro do princípio da triagem com droga crua, de atividade antibacteriana em extratos de plantas com indicativo etnográfico medicinal, condimentar ou aromático. O presente trabalho teve por objetivo sintetizar resultados relativos a Salmonella spp., oriundos de trabalhos acadêmicos do grupo, discutir a probabilidade de interveniência da inibição/inativação constatadas no diagnóstico preditivo dessa bactéria em alimentos, bem como a validação da ferramenta etnográfica na prospecção de recursos em saúde. MATERIAL E MÉTODOS Foram testadas três sorotipos de Salmonella, dois padrões American Type Culture Collection (ATCC), respectivamente S. enteritidis (ATCC 13076) e S. cholera-suis (ATCC 10708), e um isolado de campo de S. gallinarum, cedida pelo Laboratório de Patologia Animal/Bacteriologia do Centro de Pesquisa Veterinárias Desidério Finamor da Secretaria de Agricultura e Abastecimento, RS. As amostras foram mantidas em bacterioteca, ativadas em meio Brain Heart Infusion (BHI-B)1 a 37ºC em aerobiose, atingindo os inóculos no mínimo >107UFC.mL-1, entre 18 e 24 horas. Por meio do método qualitativo de etnografia rápida (Etkin, 1993), fez-se o resgate de saberes e fazeres relacionados às 86 plantas com a participação de 16 informantes (remanescentes quilombolas, ameríndios, imigrantes teutos, de curadores tradicionais e de voluntários da Pastoral da Saúde), registrando-se seu consentimento livre e esclarecido (Clotet et al., 2000), como orienta o Decreto nº 4.339 da Política Nacional de Biodoversidade, Diretriz nº 2 (XII), de 22 de agosto de 2002. Todas as plantas foram acessadas na região metropolitana de Porto Alegre, RS, identificadas botanicamente e encaminhadas como exsicatas (Ming, 1996) para registro no Herbário do Departamento de Botânica, do Instituto de Biologia da UFRGS. As diferentes plantas foram utilizadas imediatamente ainda verdes, ou secas à sombra sob ventilação e, assim, armazenadas para uso posterior. Os diferentes extratos vegetais foram obtidos segundo a Farmacopeia Brasileira (Farmacopeia..., 1959), ocorrendo ou não a reposição/reidratação posterior, constituindo decoctos (plantas verdes ou secas), alcoolaturas (plantas verdes) ou hidroalcoolaturas (plantas secas), as duas últimas submetidas à destilação fracionada sob pressão reduzida em aparelho de rota-vapor. Para a avaliação da atividade antibacteriana dos diferentes extratos estudados, expressa como intensidade de atividade de inibição bacteriana (IINIB) e de intensidade de atividade de inativação bacteriana (IINAB), utilizaram-se os testes de diluição e de suspensão (Deutsche..., 1980, citado por Schliesser e Strauch, 1981), com base na técnica do sistema de tubos múltiplos, modificada por Avancini (2002), confrontando os diferentes extratos vegetais com oito diluições seriais logarítmicas (10-1 a 10-8UFC/mL-1) das diferentes salmonelas em teste, controlando por plaqueamento o crescimento bacteriano específico, bem como contaminações intervenientes. Entendeu-se por IINIB o resultado do confronto da salmonela com o extrato vegetal em meio específico, e por IINAB o mesmo resultado, porém sob influência dos desinibidores bacterianos (Deutsche..., 1980, citado por Schliesser e Strauch, 1981). Os resultados de IINIB e de IINAB foram representados por variáveis ordinais arbitrárias, que assumiram valores de oito a zero, indicando a intensidade dessas atividades e de suas correspondentes diluições/doses infectantes dos inóculos de salmonela. Dessa maneira, atribuiuse o valor máximo oito quando a atividade de inibição ou de inativação de uma determinada concentração do extrato vegetal correspondeu a 10-1 ou a 107UFC.mL-1 (partindo de uma cultura ativada com, no mínimo, 108UFC.mL-1), ou valor zero, quando da verificação de nenhuma atividade, tanto de inibição como de inativação, demonstrada pela concentração do extrato vegetal em teste. Em todos os testes, avaliaram-se os resultados de IINIB e de IINAB por meio de análise estatística descritiva e análise de variância, com complementação pelo teste Duncan e teste t. RESULTADOS E DISCUSSÃO Entre 86 plantas com indicativo etnográfico medicinal, condimentar ou aromático acessadas na região metropolitana de Porto Alegre, RS, 50 apresentaram alguma atividade antissalmonela (Tab. 1), enquanto as demais 36 não apresentaram atividade, nas condições dos diferentes experimentos (Tab. 2), embora apresentassem intenso referencial etnográfico de uso em agravos à saúde envolvendo agentes infecciosos, ferimentos/cicatrização, manifestações gastrintestinais, conservação de alimentos, promoção da saúde e da produção animal. Dentre as plantas acessadas, nas condições dos diferentes experimentos, por atingirem valores arbitrários atribuídos em grau máximo, 8, tanto em IINIB como em IINAB sobre Salmonella spp., destacam-se alho-porró (Allium porrum), alho-nirá (Allium tuberosum), macela (Achyrocline satureoides), pimenta-malagueta (Capsicum frutescens), erva-mate (Ilex paraguariensis), orégano (Origanum applii), sálvia (Salvia oficinalis) e o chinchilho (Tagetes minuta), entre outras. Especificamente dentre as plantas com indicativo condimentar destacam-se estragão (Artemísia dracunculus L. var. inodora) e pimenta calabresa (pool de Capsicum sp.) por apresentarem inibição (bacteriostasia) grau máximo oito, porém inativação (bactericidia) grau mínimozero. À luz dessa constatação, Carvalho et al. (2006) demonstraram a baixa preditividade dos resultados negativos de pesquisa de salmonela em simulação alimentar condimentada com estragão, devendo tais resultados serem interpretados como falso-negativos, permitindo recomendar o acréscimo dos desinibidores bacterianos (Deutsche..., 1980, citado por Schliesser e Strauch, 1981 ) à técnica oficial de pesquisa de salmonela em alimentos em vigor no país, além da inclusão da busca de indicativos epidemiológicos descritivos sobre possíveis condimentações dos alimentos envolvidos nos surtos toxinfectivos sob investigação, fundamentando assim a preditividade dos possíveis resultados negativos por inibição provocada pelos diferentes condimentos vegetais. As técnicas de diluição e de suspensão, por sua vez, por meio de sistema de tubos múltiplos, demonstraram acuidade ao se reproduzirem resultados semelhantes mesmo com diferentes acessos de planta, após três a seis anos de intervalo, no exemplo de alho-nirá ou jiucai (Allium tuberosum) e de macela (Achyrocline satureoides). Por outro lado, analisando especificamente os resultados da baleeira (Cordia curassavica), há evidências de que o tipo de extração influencia a eficácia antibacteriana do extrato, pela possível perda de elementos bioativos na decocção e/ou na pré-secagem da planta antes da confecção de hidroalcoolatura, o que parece não ocorrer na técnica de extração por alcoolatura a partir de plantas verdes, recém-colhidas. A triagem de agentes medicinais ativos em plantas, não obrigatoriamente antimicrobianos, segundo Malone (1983), permite atingir escores de 1:10, ou seja, 10% de plantas com alguma atividade evidenciada, dentre o total de plantas pesquisadas com indicativo etnográfico de uso medicinal tradicional. Nesse sentido, como participantes deste Grupo de Pesquisa, Avancini (2002) alcançou percentual de acertos de 51,4%, Carvalho (2004) atingiu 37,5%, e Gonçalves (2005), 88,8% de acertos. No presente estudo, dentre as 86 plantas testadas no período (1995-2008), atingiu-se escore de 58,1% de acertos específicos em relação à salmonela, sinalizando a validação do resgate etnográfico como ferramenta na prospecção de plantas medicinais como fatores de proteção antibacteriana, com base em de saberes tradicionais compartilhados. Considerando que a seleção dessas plantas fundamentou-se no resgate e na valoração de seus indicativos etnográficos de uso medicinal, condimentar ou aromático junto a diferentes parceiros-informantes tradicionais, considerando, outrossim, a confirmação dessas indicações em 58,1% das plantas por meio dos resultados da triagem apresentados, este trabalho pretende situarse na interface entre diferentes saberes, vinculando o senso comum e o senso científico relativo às plantas medicinais condimentares e aromáticas como recursos antibacterianos naturais renováveis e, possíveis fatores de proteção cientificamente assegurados, socialmente aceitáveis e ecologicamente sustentáveis, nos princípios da atenção básica em saúde (Cultura..., 1984, 1985, 1990). Pretende-se, ainda, oferecer suporte a indagações a respeito dos princípios ativos intervenientes, da sensibilidade de outros microrganismos emergentes, ou mesmo da possibilidade de intervenção em situações-problema específicas na realidade concreta das diferentes cadeias produtivas. AGRADECIMENTO Aos informantes, pela partilha do conhecimento tradicional. Ao CNPq, pelo estímulo e financiamento contínuos. A FAPERGS, pelo financiamento ao projeto. Recebido em 25 de abril de 2008 Aceito em 15 de outubro de 2008 Apoio: CNPq E-mail: [e-mail] 1 Brain-Hearth Infusion Broth - Acumedia -Michigan, EUA. ACHA, P.N.; SZYFRES, B. Zoonosis and communicable diseases common to men and animals: bacteriosis and mycosis. 3.ed. Washington: World Health Organization. 398p. Zoonosis and communicable diseases common to men and animals: bacteriosis and mycosis 398 ACHA P.N SZYFRES B AKERELE, O. Las plantas medicinales: un tesoro que no debemos desperdiciar. Foro Mund. Salud, v.14, p.390395, 1993. 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