Propriedades probióticas in vitro de Lactobacillus spp. isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra - MG

In vitro probiotic properties of Lactobacillus spp. isolated from Minas artisanal cheese from Serra da Canastra - MG

C.R.G. Andrade M.R. Souza C.F.A.M. Penna L.B. Acurcio F.M. Sant'Anna R.D. Castro D.L.S. Oliveira Sobre os autores

Resumos

O objetivo deste estudo foi determinar o potencial probiótico in vitro de Lactobacillus spp. isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra, considerando-se o antagonismo entre amostras isoladas frente a microrganismos indicadores, a susceptibilidade a antimicrobianos, a sensibilidade ao ácido gástrico e a sensibilidade a sais biliares. Todas as bactérias ácido-lácticas testadas apresentaram resistência ao ácido gástrico (pH 2,0) e aos sais biliares (0,3%), bem como atividade antagonista contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica var. Typhimurium, Enterococcus faecalis e bactérias ácido-lácticas isoladas dos próprios queijos - Lactobacillus plantarum (D27) e Lactobacillus rhamnosus (B25). Todas as amostras foram sensíveis à eritromicina e tetraciclina e resistentes à ciprofloxacina, gentamicina, oxacilina, estreptomicina e vancomicina. L. plantarum (B17) apresentou melhor potencial probiótico, pois obteve resultados satisfatórios em todas as propriedades avaliadas. Mais estudos são necessários para verificar a presença e a capacidade de transmissão de genes de resistência antimicrobiana a outros microrganismos e para avaliar o potencial dos microrganismos in vivo. As bactérias selecionadas poderão ser utilizadas na elaboração de queijos em que sejam mantidos o sabor e a tradição do queijo minas artesanal do estado de Minas Gerais.

queijo minas artesanal; bactérias ácido-lácticas; potencial probiótico


The aim of this study was to determine some in vitro probiotic features of Lactobacillus spp. isolated from Minas artisanal cheese from Serra da Canastra in order to select some bacteria for future production of safer cheeses keeping their natural flavor and tradition. The evaluated properties were antagonism against indicator microorganisms, antimicrobial susceptibility and also sensitivity to gastric acid and to bile salts. All lactic acid bacteria tested were resistant to gastric acid (pH 2.0) and bile salts (0.3%). Antagonistic activities were detected against Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella entericavar. Typhimurium, Enterococcus faecalis and other lactic bacteria isolated from the same cheese - Lactobacillus plantarum (D27) and Lactobacillus rhamnosus (B25). All samples were sensitive to the antimicrobials erythromycin, tetracycline and resistant to ciprofloxacin, gentamycin, oxacillin, streptomycin and vancomycin. L.plantarum (B17) presented the best probiotic potential. Further studies are needed to verify the presence and the capacity of transmission of antimicrobial resistance genes to other microorganisms and evaluate the in vivo probiotic potential of the selected microorganisms.

artisanal Minas cheese; lactic acid bacteria; probiotic potential


INTRODUÇÃO

O queijo minas artesanal é um dos mais antigos e tradicionais queijos produzidos no Brasil, sendo responsável pela geração de renda de um grande número de pequenos produtores rurais (Dores e Ferreira, 2012DORES, M.T.; FERREIRA, C.L.L.F. Queijo Minas Artesanal, tradição centenária: ameaças e desafios. Rev. Bras. Agro.Sust., v.2, p.26-34, 2012.). Sua produção, na maioria das vezes, é feita de maneira tradicional nas fazendas, a partir de leite cru e, por isso, apresenta grande variabilidade na sua microbiota (Costa et al., 2013COSTA, H.H.S.; SOUZA, M.R.; ACURCIO, L.B. et al. Potencial probiótico in vitro de bactérias ácido-láticas isoladas de queijo-de-minas artesanal da Serra da Canastra, MG. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.65, p.1858-1866, 2013.). As informações sobre o queijo minas artesanal da Serra da Canastra, principalmente a respeito de sua microbiota endógena, e os fatores que podem determinar variações nessa microbiota ainda são limitados (Resende et al., 2011RESENDE, M.F.S.; COSTA, H.H.S.; ANDRADE, E.H.P. et al. Queijo de minas artesanal da Serra da Canastra: influência da altitude das queijarias nas populações de bactérias acido-lácticas. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.63, p.1563-1573, 2011.). A seleção de microrganismos probióticos a partir desses queijos torna-se relevante para a formação de um banco de culturas lácticas desejáveis as quais possam futuramente ser utilizadas para proporcionar segurança na produção, bem como sabor aos queijos, e, assim, preservar esse patrimônio cultural.

O objetivo deste estudo foi determinar o potencial probiótico in vitro de Lactobacillus spp. isolados de queijos minas artesanais produzidos na região da Serra da Canastra, considerando-se o antagonismo entre amostras isoladas frente a microrganismos indicadores, a susceptibilidade a antimicrobianos, a sensibilidade ao ácido gástrico e a sensibilidade a sais biliares.

MATERIAL E MÉTODOS

O presente trabalho foi executado nos laboratórios de Genética Molecular de Protozoários Parasitas do Instituto de Ciências Biológicas e de Microbiologia de Alimentos do Departamento de Tecnologia e Inspeção de Produtos de Origem Animal da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais. Os Lactobacillus spp. empregados nas análises foram previamente isolados e identificados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra por Resende et al. (2011)RESENDE, M.F.S.; COSTA, H.H.S.; ANDRADE, E.H.P. et al. Queijo de minas artesanal da Serra da Canastra: influência da altitude das queijarias nas populações de bactérias acido-lácticas. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.63, p.1563-1573, 2011..

O teste de antagonismo foi realizado em triplicata, com duas repetições para cada amostra, conforme a técnica adaptada relatada por Tagg et al. (1976)TAGG, J.R.; DAJANI, A.S.; WANNAMAKER, L.W. Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Bact. Rev., v.40, p.722-756, 1976.. Foram selecionadas sete amostras de Lactobacillus spp., denominadas culturas produtoras, isto é, as que foram testadas quanto à capacidade antagonista contra outros microrganismos, denominados de culturas reveladoras. Como culturas reveladoras, foram utilizadas cinco bactérias patogênicas de referência (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica var. Typhimurium e Enterococcus faecalis), gentilmente cedidas pelo professor Jacques Robert Nicoli, do Laboratório de Ecologia e Fisiologia de Microrganismos do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, e duas amostras isoladas dos mesmos queijos minas artesanais da Serra da Canastra (Lactobacillus plantarum e Lactobacillus rhamnosus), isolados e identificados por Resende et al. (2011)RESENDE, M.F.S.; COSTA, H.H.S.; ANDRADE, E.H.P. et al. Queijo de minas artesanal da Serra da Canastra: influência da altitude das queijarias nas populações de bactérias acido-lácticas. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.63, p.1563-1573, 2011., com o intuito de examinar atividade inibitória entre bactérias presentes no próprio ambiente de onde foram isoladas.

O antibiograma foi realizado em duplicata, com duas repetições para cada amostra, de acordo com o método adaptado de susceptibilidade a antimicrobianos proposto por Charteris et al. (1998)CHARTERIS, W.P.; KELLY, P.; MORELLI, L. et al. Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Lactobacillus species. Jour. Food Protect., v.61, p.1636-1643, 1998.. O teste de sensibilidade ao pH gástrico foi realizado em triplicata, com duas repetições para cada amostra, de acordo com a técnica adaptada de Neumann (1991)NEUMANN, E. Comportamento "in vitro" de estirpes de Lactobacillus acidophilus sensível e resistente à bacteriocina sob condições do trato digestivo. 1991. 86f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) - Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa..

O teste de sensibilidade aos sais biliares foi realizado em triplicata, com duas repetições para cada amostra, de acordo com o protocolo de Costa et al. (2013)COSTA, H.H.S.; SOUZA, M.R.; ACURCIO, L.B. et al. Potencial probiótico in vitro de bactérias ácido-láticas isoladas de queijo-de-minas artesanal da Serra da Canastra, MG. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.65, p.1858-1866, 2013.. Os resultados foram submetidos às análises estatísticas descritivas e não paramétricas (Sampaio, 2002SAMPAIO, I.B.M. Estatística aplicada à experimentação animal. Belo Horizonte: FEPMVZ, 2002. 265p. ). A comparação entre as médias dos diferentes tratamentos realizados no teste de antagonismo foi feita de acordo com o teste de Kruskal-Wallis (Baja, 2004BAJA, R. Programa SAEG 8.1 - Manual do usuário. Viçosa: Fundação Artur Bernardes, 2004. 114 p.).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Tab. 1 mostra que L. plantarum (B17), além de inibir as outras bactérias reveladoras, foi a única capaz de inibir S. enterica var. Typhimurium.

Tabela 1
Médias dos halos de inibição (mm), de duas repetições em triplicata, do teste de antagonismo in vitro de amostras de Lactobacillus spp., isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra, contra bactérias reveladoras

Notou-se que houve inibição, mas em menor proporção, contra as bactérias reveladoras do próprio queijo, L. plantarum (D27) e L. rhamnosus (B25). Entretanto, a amostra produtora L. plantarum (D16) não inibiu a reveladora L. rhamnosus (B25). Segundo Guedes Neto (2005)GUEDES NETO, L.G.; SOUZA, M.R.; NUNES, A.C. et al. Atividade antimicrobiana de bactérias ácido-lácticas isoladas de queijos de coalho artesanal e industrial frente amicroorganismos indicadores. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.57, p.245-250, 2005., a inibição de outros microrganismos é desejável para a sobrevivência das bactérias ácido-lácticas em ambientes que apresentam microbiota diversificada e complexa, como é o caso dos queijos.

As médias dos halos de inibição para cada bactéria reveladora, das amostras de Lactobacillus spp., isoladas de queijos minas artesanais da Serra da Canastra, foram mais expressivas sobre Escherichia coli e Staphylococcus aureus.

Pode ser observado na Tab. 2 que houve diferença nas inibições no teste de antagonismo in vitro. Lactobacillus spp. isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra apresentaram diferentes antagonismos contra cada bactéria reveladora.

Tabela 2
Médias dos halos de inibição (mm), de duas repetições em triplicata, do teste de antagonismo in vitro de amostras de Lactobacillus spp., isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra, para cada bactéria reveladora

O coeficiente de variação da bactéria reveladora S. enterica var. Typhimurium foi alto (313%), pois a única bactéria que a inibiu foi Lactobacillus plantarum (B17).

As médias dos halos de inibição para cada bactéria reveladora, das amostras de Lactobacillus spp. isoladas de queijos minas artesanais da Serra da Canastra, foram mais expressivas (P<0,05) sobre Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Esse fato é importante, pois essas bactérias são associadas a problemas de saúde pública no consumo de queijos minas artesanais contaminados (ICMSF, 1998ICMSF. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. Microorganisms in food: Characteristics of microbial pathogens. London: Blackie Acad. Prof., 1998.). Tais resultados mostram o possível potencial de utilização de Lactobacillus spp. testados para minimizar ou controlar problemas causados por bactérias patogênicas em queijos, visando melhorar a qualidade sanitária do produto.

Na Tab. 2, a média do halo de inibição também foi expressiva contra Listeria monocytogenes. As inibições de Enterococcus faecalis e Lactobacillus plantarum (D27) foram superiores à inibição contra Lactobacillus rhamnosus (B25) e S. enterica var. Typhimurium.

A média dos halos de inibição de todos os Lactobacillus spp. isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra (Tab. 3) frente às bactérias reveladoras, patogênicas ou do próprio queijo, apresentou valores entre 17,22 e 28,39mm, e não houve variação (P>0,05) entre a capacidade inibitória das diferentes espécies.

Tabela 3
Médias dos halos de inibição (mm), de duas repetições em triplicata, do teste de antagonismo in vitro de cada amostra de Lactobacillus spp., isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra, frente às bactérias reveladoras

Resultados similares do antagonismo in vitro de bactérias ácido-lácticas isoladas de queijos artesanais frente a bactérias reveladoras também foram encontrados por outros autores. Alexandre et al. (2002)ALEXANDRE, D.P.; SILVA, M.R.; SOUZA, M.R. et al. Atividade antimicrobiana de bactérias lácticas isoladas de queijo-de-minas artesanal do Serro (MG) frente a microrganismos indicadores. Arq. Bras. Med.Vet. Zootec., v.54, p.424-428, 2002. demonstraram atividade antagonista de bactérias lácticas contra S. aureus e L. monocytogenes. Guedes Neto et al. (2005)GUEDES NETO, L.G.; SOUZA, M.R.; NUNES, A.C. et al. Atividade antimicrobiana de bactérias ácido-lácticas isoladas de queijos de coalho artesanal e industrial frente amicroorganismos indicadores. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.57, p.245-250, 2005. verificaram inibição de Lactobacillus spp. contra Staphylococcus spp. e E.coli, e fraca inibição contra as bactérias isoladas do próprio queijo, L. acidophilus, L. raffinolactis L. lactis. Chioda et al. (2006)CHIODA, T.P.; SCHOCKEN-ITURRINO, R.P.; GARCIA, G.R. et al. Inibição do crescimento de Listeria monocytogenes em queijo Minas Frescal elaborado com cultura de Lactobacillus acidophilus. Rev. Port. Clin.Vet., v.101, p.121-124, 2006. indicaram que L. acidophilus foi capaz de inibir o crescimento de L. monocytogenes. Costa et al. (2013)COSTA, H.H.S.; SOUZA, M.R.; ACURCIO, L.B. et al. Potencial probiótico in vitro de bactérias ácido-láticas isoladas de queijo-de-minas artesanal da Serra da Canastra, MG. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.65, p.1858-1866, 2013. relataram atividade antagonista de Lactobacillus spp. isolados de queijos minas artesanais contra Staphylococcus spp., E.coli e L. monocytogenes, e pouca inibição contra microrganismos do próprio queijo, L. rhamnosus e L. fermentum. Kos et al. (2011)KOS, B.; BEGANOVIC, J.; JURASIC, L. et al. Coculture-inducible bacteriocin biosynthesis of different probiotic strains by dairy starter culture Lactococcus lactis. Mljekarstvo, v.61, p.273-282, 2011. relataram atividade antagonista de L. lactis frente a Staphylococcus spp. e E.coli.

Todas as amostras de Lactobacillus spp. isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra apresentaram resistência aos antimicrobianos vancomicina, estreptomicina, oxacilina, gentamicina e ciprofloxacina (Tab. 4).

Tabela 4
Médias dos halos de inibição (mm) da sensibilidade a antimicrobianos, de duas repetições em duplicata, de amostras de Lactobacillus spp., isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra

A resistência de Lactobacillus spp. à vancomicina é uma característica comum, sendo associada a esse gênero, portanto pode haver resistência intrínseca a esse antimicrobiano (Zhou, 2005ZHOU, J.S. Antibiotic susceptibility profiles of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains. Inter. J. Food Microbiol., v.98, p.211-217, 2005.). Outros trabalhos (Herreroset al., 2005HERREROS, M.A.; SANDOVAL H.; GONZÁLEZ, L. Antimicrobial activity and antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated form Armada cheese (a Spanish goat's milk cheese). Jour. Food Microbiol., v.22, p.455-459, 2005.; Acúrcio, 2011ACÚRCIO, L.B. Isolamento, enumeração, identificação molecular eavaliação de propriedades probióticas de Enterococcus isolados de leite de ovelha. 2011. 79f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) - Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte. ; Costa et al., 2013COSTA, H.H.S.; SOUZA, M.R.; ACURCIO, L.B. et al. Potencial probiótico in vitro de bactérias ácido-láticas isoladas de queijo-de-minas artesanal da Serra da Canastra, MG. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.65, p.1858-1866, 2013.) também relataram alta resistência de Lactobacillus à vancomicina.

Todas as amostras de Lactobacillus spp. isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra analisadas neste trabalho foram sensíveis ao antimicrobiano eritromicina. L. plantarum (A21) foi a única amostra que não foi sensível ao antimicrobiano clindamicina, tendo sido moderadamente sensível, e apenas L. plantarum (A21) não foi sensível ao antimicrobiano tetraciclina, sendo moderadamente sensível.

Em geral, as amostras de bactérias ácido-lácticas foram resistentes a vários antimicrobianos analisados. As amostras que obtiveram menor número de resistência a antimicrobianos foram L. plantarum (B13) e L. plantarum (B17), pois apresentaram sensibilidade aos antimicrobianos ceftazidima, clindamicina, eritromicina, tetraciclina. As amostras que obtiveram maior número de resistência a antimicrobianos foram L. casei (A1), L. plantarum (B21) e L. plantarum (D16), pois apresentaram sensibilidade somente aos antimicrobianos clindamicina, eritromicina e tetraciclina.

Amostras de Lactobacillus spp. resistentes à tetraciclina e à eritromicina foram descritas anteriormente (Azevedo et al., 2000AZEVEDO, P.A.; PERIN, C.; BECKER, F.L. et al. Isolamento e caracterização de Lactococcus garvieae. Rev. AMRIGS, v.44, p.81-84, 2000.; Temmerman et al., 2002TEMMERMAN, R.; POT, B.; HUYS, G. et al. Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products. Inter. J. Food Microbiol., v.81, p.1-10, 2002.; Klare et al., 2007KLARE, I.; KONSTABEL, C.; WERNER, G. et al. Antimicrobial susceptibilities of Lactobacillus, Pediococcus and Lactococcus human isolates and cultures intended for probiotic or nutritional use. Jour. Antimicro. Chemother., v.59, p.900-912, 2007.), contrapondo com os resultados do presente experimento.Em concordância com esses dados, Charteris et al. (1998)CHARTERIS, W.P.; KELLY, P.; MORELLI, L. et al. Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Lactobacillus species. Jour. Food Protect., v.61, p.1636-1643, 1998. relataram que 100% das amostras de Lactobacillus spp. foram sensíveis à tetraciclina, 97,82% foram sensíveis à eritromicina, e a maioria das amostras foram resistentes à gentamicina, estreptomicina e ciprofloxacina. Temmerman et al. (2002)TEMMERMAN, R.; POT, B.; HUYS, G. et al. Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products. Inter. J. Food Microbiol., v.81, p.1-10, 2002. observaram resistência das amostras de Lactobacillus spp. à penicilina. Hummel et al. (2007)HUMMEL, A.S.; HERTEL, C.; HOLZAPFEL, W.H. et al. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol., v.73, p.730-739, 2007. verificaram a resistência a antimicrobianos em 40 culturas de fermento láctico e cinco culturas probióticas. As culturas foram sensíveis à tetraciclina e eritromicina, e resistentes à gentamicina, estreptomicina e ciprofloxacina. Herreros et al. (2005)HERREROS, M.A.; SANDOVAL H.; GONZÁLEZ, L. Antimicrobial activity and antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated form Armada cheese (a Spanish goat's milk cheese). Jour. Food Microbiol., v.22, p.455-459, 2005. também encontraram altas taxas de resistência à vancomicina e à oxacilina em cepas isoladas de queijo artesanal espanhol. Zhou (2005)ZHOU, J.S. Antibiotic susceptibility profiles of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains. Inter. J. Food Microbiol., v.98, p.211-217, 2005. demonstrou que bactérias ácido-lácticas foram sensíveis aos antimicrobianos eritromicina e tetraciclina, e resistentes à vancomicina, gentamicina e estreptomicina. Belletti et al. (2009)BELLETTI, N.; GATTI, M.; BOTTARI, B. et al. Antibiotic Resistance of Lactobacilli isolated from two Italian hard cheeses. Jour. Food Protect., v.72, p.2162-2169, 2009. encontraram alta porcentagem de Lactobacillus spp. resistentes à gentamicina, penicilina, oxacilina e vancomicina e sensíveis à clindamicina, eritromicina e tetraciclina. Um dos critérios de seleção para culturas probióticas é ser resistente ao pH baixo (Quwehand et al., 1999QUWEHAND, A.C.; KIRJAVAINEN, P.V.; SHORTT, C. et al. Probiotics: Mechanisms and established effects. Inter. DairyJour., v.9, p.43-52, 1999.), uma vez que, para atingir o intestino delgado, os microrganismos precisam resistir às condições ácidas no estômago (Chou e Weimer, 1999CHOU, L.S.; WEIMER, B. Isolation and characterization of acid and bile tolerant isolates from strains of Lactobacillus acidophilus. J. Dairy Sci., v.82, p.23-31, 1999.).

Gilliland et al. (1984)GILLILAND, S.E.; STANLEY, T.E.; BUSH, L.J. Importance of bile tolerance of Lactobacillus acidophilus used as a dietary adjunct. Jour. Dairy Sci., v.67, p.3045-3051, 1984. preconizaram que, para uma bactéria ácido-láctica ser resistente ao ácido gástrico, essa teria que alcançar absorbância de 0,3 após duas horas de incubação, em valores de pH na faixa de 1,5 a 4,0.

Conforme a Tab. 5, considerando-se somente a absorbância máxima alcançada, todas as amostras de bactérias ácido-lácticas isoladas de queijos minas artesanais da Serra da Canastra foram tolerantes ao ácido gástrico em pH 2,0 (Costa et al., 2013COSTA, H.H.S.; SOUZA, M.R.; ACURCIO, L.B. et al. Potencial probiótico in vitro de bactérias ácido-láticas isoladas de queijo-de-minas artesanal da Serra da Canastra, MG. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.65, p.1858-1866, 2013.), pois apresentaram absorbância maior que 0,3.

Tabela 5
Absorbância máxima alcançada, em duas repetições em triplicata, por amostras de Lactobacillus spp., isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra, após três horas de incubação a 37°C em pH 7,0 (controle) e pH 2,0 (ácido gástrico)

Segundo Dunne et al. (1999)DUNNE, C.; MURPHY, L.; FLYNN, S. et al. Probiotics: from myth to reality. Demonstration of functionality in animal models of disease and in human clinical trials. Anton. Van Leeuw., v.76, p.279-292, 1999., Lactobacillus spp. são mais tolerantes a condições ácidas que outras bactérias lácticas. Os resultados da Tab. 6 indicam que as amostras de Lactobacillus spp. suportaram o ácido gástrico ao pH 2,0.

Tabela 6
Percentual de inibição por ácido gástrico (pH 2,0), de duas repetições em triplicata, sobre amostras de Lactobacillus spp., isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra, após três horas de incubação a 37ºC em ácido gástrico (pH 2,0)

Como as bactérias ácido-lácticas testadas no presente trabalho foram isoladas de um ambiente em que predomina a acidez, pois em todo o processo de produção de queijos o pH baixo é frequente, era esperado que esses microrganismos fossem adaptados às condições de estresse gerado pela elevada acidez (Resende et al., 2011RESENDE, M.F.S.; COSTA, H.H.S.; ANDRADE, E.H.P. et al. Queijo de minas artesanal da Serra da Canastra: influência da altitude das queijarias nas populações de bactérias acido-lácticas. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.63, p.1563-1573, 2011.; Costa et al., 2013COSTA, H.H.S.; SOUZA, M.R.; ACURCIO, L.B. et al. Potencial probiótico in vitro de bactérias ácido-láticas isoladas de queijo-de-minas artesanal da Serra da Canastra, MG. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.65, p.1858-1866, 2013.).

Resultados similares da sensibilidade in vitro ao pH gástrico de bactérias ácido-lácticas também foram encontrados por outros autores. Chou e Weimer (1999)CHOU, L.S.; WEIMER, B. Isolation and characterization of acid and bile tolerant isolates from strains of Lactobacillus acidophilus. J. Dairy Sci., v.82, p.23-31, 1999. relataram tolerância de amostras de L. acidophilus ao pH 3,5. Araújo et al. (2009)ARAÚJO, E.A.; CARVALHO, A.; LEANDRO, E.S. et al. Produção de queijo tipo cottage simbiótico e estudo de sobrevivência das células probióticas quando expostas a diferentes estresses. Pesq. Agropec. Trop., v.39, p.11-118, 2009. indicaram que as culturas de Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 extraídas de queijo tipo cottage exibiram resistência a baixos valores de pH. Costa et al. (2013)COSTA, H.H.S.; SOUZA, M.R.; ACURCIO, L.B. et al. Potencial probiótico in vitro de bactérias ácido-láticas isoladas de queijo-de-minas artesanal da Serra da Canastra, MG. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.65, p.1858-1866, 2013. relataram tolerância ao pH 2,0 por todas as amostras de Lactobacillus spp. isoladas de queijos artesanais da Serra da Canastra. Meira (2010)MEIRA, S.M.M.; HELFER, V.E.; VELHO, R.V. et al. Identificação e resistência a barreiras biológicas de bactérias lácticas isoladas de leite e queijo de ovelha. Braz. Jour. Food Technol., n.12, p.75-80, 2010. relatou tolerância ao pH 3,0 e ao pH 4,0 de bactérias ácido-lácticas isoladas de leite e queijo de ovelha. Tambekar e Bhutada (2010)TAMBEKAR, D.H.; BHUTADA, S.A. Acid and bile tolerance, antibacterial activity, antibiotic resistance and bacteriocins activity of probiotic Lactobacillus species. Rec. Res. Sci. Technol., v.2, p.94-98, 2010. observaram Lactobacillus spp. tolerantes ao ácido gástrico (pH 2,0). Shruthy et al. (2011)SHRUTHY, V.V.; PAVITHRA, M.; GOWRI, S. et al. Probiotic potentials among lactic acid bacteria isolated from curd. Inter. J. Res. Ayurveda Pharm., v.2, p.602-609, 2011. verificaram tolerância ao ácido gástrico (pH 3,5) da maioria dos Lactobacillus spp. de amostra de coalhada.

Considerando-se somente a absorbância máxima alcançada, todas as amostras de Lactobacillus spp. isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra (Tab. 7) foram tolerantes aos sais biliares com 0,3% de Oxgall (BD), pois apresentaram absorbância maior que 0,3.

Tabela 7
Absorbância máxima alcançada, em duas repetições em triplicata, por amostras de Lactobacillus spp., isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra, após 12h de incubação a 37ºC, na presença de 0,3% de sais biliares

Segundo Gilliland et al. (1984)GILLILAND, S.E.; STANLEY, T.E.; BUSH, L.J. Importance of bile tolerance of Lactobacillus acidophilus used as a dietary adjunct. Jour. Dairy Sci., v.67, p.3045-3051, 1984., quando a absorbância de 0,3 é atingida por uma bactéria ácido-láctica, após oito horas de incubação em meio adicionado de 0,3% de Oxgall, essa pode ser considerada tolerante aos sais biliares.

Como mostra a Tab. 8, todas as amostras de Lactobacillus spp. isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra avaliadas foram tolerantes por apresentarem menos de 40% de inibição ao Oxgall (BD) 0,3%.

Tabela 8
Percentual de inibição por sais biliares (Oxgall, BD, 0,3%), de duas repetições em triplicata, sobre amostras de Lactobacillus spp., isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra, em 12h de incubação a 37ºC

Segundo Acúrcio (2011)ACÚRCIO, L.B. Isolamento, enumeração, identificação molecular eavaliação de propriedades probióticas de Enterococcus isolados de leite de ovelha. 2011. 79f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) - Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte. , uma amostra é considerada tolerante aos sais biliares, Oxgall 0,3%, se houver um percentual de inibição menor que 40%.

Resultados similares da sensibilidade in vitro de bactérias ácido-lácticas aos sais biliares também foram encontrados por outros autores. Chou e Weimer (1999)CHOU, L.S.; WEIMER, B. Isolation and characterization of acid and bile tolerant isolates from strains of Lactobacillus acidophilus. J. Dairy Sci., v.82, p.23-31, 1999. mostraram tolerância de amostras de L. acidophilus aos sais biliares a 0,2%. Araújo et al. (2009)ARAÚJO, E.A.; CARVALHO, A.; LEANDRO, E.S. et al. Produção de queijo tipo cottage simbiótico e estudo de sobrevivência das células probióticas quando expostas a diferentes estresses. Pesq. Agropec. Trop., v.39, p.11-118, 2009. indicaram que culturas Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 extraídas de queijo tipo cottage exibiram resistência satisfatória a altas concentrações de sais biliares. Meira (2010)MEIRA, S.M.M.; HELFER, V.E.; VELHO, R.V. et al. Identificação e resistência a barreiras biológicas de bactérias lácticas isoladas de leite e queijo de ovelha. Braz. Jour. Food Technol., n.12, p.75-80, 2010. revelou tolerância aos sais biliares a 0,3% de bactérias ácido-lácticas de leite e queijo de ovelha. Tambekar e Bhutada (2010)TAMBEKAR, D.H.; BHUTADA, S.A. Acid and bile tolerance, antibacterial activity, antibiotic resistance and bacteriocins activity of probiotic Lactobacillus species. Rec. Res. Sci. Technol., v.2, p.94-98, 2010. demonstraram que Lactobacillus spp. apresentaram tolerância aos sais biliares a 2%. Shruthyet al. (2011)SHRUTHY, V.V.; PAVITHRA, M.; GOWRI, S. et al. Probiotic potentials among lactic acid bacteria isolated from curd. Inter. J. Res. Ayurveda Pharm., v.2, p.602-609, 2011. verificaram tolerância aos sais biliares (0,3%) da maioria dos Lactobacillus spp. pertencentes à coalhada.

Considerando-se todos os testes in vitro realizados para seleção de culturas potencialmente probióticas, percebe-se que houve grande resistência dos Lactobacillus spp. isolados de queijos minas artesanais da Serra da Canastra frente aos antimicrobianos testados. Entretanto, ainda é necessário testar a presença e a capacidade de transmissão dos genes de resistência aos antimicrobianos para uma caracterização probiótica mais completa das bactérias candidatas a probióticos.

A amostra L. plantarum (B17) chama atenção, pois foi a única que inibiu a bactéria reveladora patogênica S. enterica var. Thyphimurium (Tab. 1); além disso, obteve o menor valor de inibição por ácido gástrico ao pH 2,0 (Tab. 7) e o terceiro menor valor de inibição por sais biliares 0,3% (Tab. 8).

No teste de antagonismo in vitro entre amostras de Lactobacillus spp. contra bactérias reveladoras, no teste de sensibilidade ao pH gástrico (2,0) e no teste de sensibilidade aos sais biliares (0,3% de Oxgall), todos os Lactobacillus spp. testados apresentaram comportamento favorável.

Os microrganismos probióticos devem ser resistentes ou tolerantes aos desafios ao longo do trato gastrintestinal, como o pH ácido do estômago e a secreção de sais biliares ao longo do intestino delgado, para que possam persistir e se estabelecer ao longo do trato digestivo, além de apresentarem uma forte atividade antagonista contra bactérias enteropatogênicas.

Nesse sentido, embora todas as amostras de Lactobacillus spp. analisadas neste trabalho tenham apresentado capacidade de inibir todas ou quase todas as bactérias patogênicas no teste de antagonismo, bem como boa tolerância aos sais biliares e ao ácido gástrico, a amostra L. plantarum (B17) demonstrou ser a bactéria testada que obteve o melhor potencial probiótico; assim, é candidata a compor novas culturas lácticas ou fermentos lácticos a serem utilizados para produção de produtos contendo microrganismos probióticos, de forma a auxiliar na segurança alimentar e na preservação da microbiota original de queijos artesanais de Minas Gerais. No entanto, para que essa amostra seja considerada probiótica, testes in vivo ainda são necessários.

CONCLUSÕES

As amostras de Lactobacillus spp. isoladas de queijos minas artesanais da Serra da Canastra atenderam a alguns critérios de seleção in vitro de probióticos. Elas apresentaram atividade antagonista in vitro contra bactérias de interesse em saúde pública, tolerância ao ácido gástrico e aos sais biliares e sensibilidade a antimicrobianos. De todos os microrganismos analisados neste trabalho, L. plantarum (B17) demonstrou melhor potencial probiótico in vitro, pois obteve resultados satisfatórios em todas as propriedades avaliadas, embora as outras bactérias avaliadas também tenham apresentado características desejáveis. Os resultados do presente trabalho indicam a possibilidade de as bactérias ácido-lácticas adquirirem resistência a antimicrobianos, o que causa uma grande preocupação, tendo em vista que os genes que conferem resistência podem ser transferidos de uma bactéria a outra. Mais estudos devem ser feitos para confirmar a presença e a capacidade de transmissão dos genes de resistência a antimicrobianos e verificar o potencial dos microrganismos probióticos in vivo.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    Sep-Oct 2014

Histórico

  • Recebido
    17 Mar 2013
  • Aceito
    11 Fev 2014
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