Atividade funcional neutrofílica em cabras com mastite induzida experimentalmente por Staphylococcus aureus e suplementadas com vitamina E (acetato DL-a-tocoferol)

Neutrophilic function activity in goats with mastitis experimentally induced by Staphylococcus aureus and supplemented with vitamin E (acetate DL-a-tocopherol)

Resumos

Avaliou-se a função neutrofílica em cabras com mastite por Staphylococcus aureus, induzida experimentalmente, suplementadas com vitamina E (acetato DL-a-tocoferol). Foram utilizadas 14 cabras gestantes da raça Saanen, com idades entre 8 e 12 meses e com cultura bacteriológica do leite negativa. Sete cabras receberam 2000UI de vitamina E, via intramuscular, no dia do parto e no sétimo dia pós-parto. As outras sete não foram medicadas. No 10º dia pós-parto, os dois grupos foram inoculados com 300 unidades formadoras de colônias de Staphylococcus aureus, cepa ATCC 25923, diluídas em 10ml de solução fisiológica, na glândula mamária esquerda. A função de neutrófilos sangüíneos foi medida pelo teste nitroazul tetrazólio (NBT), antes da inoculação, no momento da infecção e 12, 24, 48 e 72 horas pós-infecção, quando foi instituído o tratamento intramamário com antimicrobiano, por três dias consecutivos. A colheita final de sangue foi realizada 48 horas após a última aplicação do medicamento. Amostras de sangue para determinação da vitamina E foram colhidas no dia do parto, no momento da infecção, 48 horas pós-infecção e 48 horas pós-tratamento e analisadas por cromatografia líquida de alta performance. Na prova não estimulada do NBT não foram verificadas diferenças entre grupos e entre momentos. Na prova estimulada do NBT (NBT-E) houve diferença entre tratamentos às 12 e 72 horas pós-infecção, com valores mais elevados de NBT-E nos animais sem suplementação. Conclui-se que a suplementação com vitamina E reduz o percentual de neutrófilos NBT-E positivos.

vitamina E; função de neutrófilo; NBT; cabras


Neutrophil function in experimentally induced mastitis in goats, inoculated with Staphylococcus aureus supplemented and not supplemented with vitamin E (acetate DL-a-tocopherol) was evaluated. Fourteen pregnant Saanen goats, between 8 and 12 months of age all negative in bacteriological milk cultures, were used. Seven goats were treated with 2,000 IU of vitamin E, by intramuscular injection, on the day of the parturition and seven days later, and seven goats were not tested. On the 10th day the two groups were inoculated with 300 colony forming units of Staphylococcus aureus (ATCC 25923), diluted in 10ml of physiologic saline, by injection in the left mammary gland through ductus papillari. Blood samples were evaluated for neutrophil function by the nitroblue tetrazoliun test (NBT), before infection and at zero, 12, 24, 48 and 72 hours post-infection. At this moment, intra-mammary antimicrobial treatment was instituted, and a final assessment of neutrophil function was made 48 hours after the last treatment. Blood samples for vitamin E concentration were collected on the day of the parturition, at the day of infection, 48 hours post-infection and 48 hours post-treatment. The vitamin E concentration was determined by high performance liquid chromatography. The results of NBT-NE (not stimulated) did not detect chronological or group differences. However, by the test of NBT-E (stimulated) a significant difference between treatments on 12 and 72 hours post-infection, with higher values in the animals without supplementation of vitamin E was detected. It is concluded that the supplementation with vitamin E reduced the percentage of positive NBT-E neutrophils.

vitamin E; neutrophil function; NBT; goats


MEDICINA VETERINÁRIA

Atividade funcional neutrofílica em cabras com mastite induzida experimentalmente por Staphylococcus aureus e suplementadas com vitamina E (acetato DL-a-tocoferol)

Neutrophilic function activity in goats with mastitis experimentally induced by Staphylococcus aureus and supplemented with vitamin E (acetate DL-a-tocopherol)

S.T.A. LopesI; P.R.O. PaesII; A. KohayagawaIII; R.S. LopesIII; H. LangoniIII; C. BullaIV; L. LangrafeIV

IDepartamento de Clínica de Pequenos Animais - Hospital Veterinário Universidade Federal de Santa Maria - UFSM Faixa do Camobi, km 9 97105 900 - Santa Maria, RS

IIPós-graduando da FMVZ/UNESP-Botucatu

IIIUniversidade Estadual Paulista/UNESP - Botucatu

IVResidente do Laboratório Clínico Veterinário/UNESP - Botucatu

RESUMO

Avaliou-se a função neutrofílica em cabras com mastite por Staphylococcus aureus, induzida experimentalmente, suplementadas com vitamina E (acetato DL-a-tocoferol). Foram utilizadas 14 cabras gestantes da raça Saanen, com idades entre 8 e 12 meses e com cultura bacteriológica do leite negativa. Sete cabras receberam 2000UI de vitamina E, via intramuscular, no dia do parto e no sétimo dia pós-parto. As outras sete não foram medicadas. No 10º dia pós-parto, os dois grupos foram inoculados com 300 unidades formadoras de colônias de Staphylococcus aureus, cepa ATCC 25923, diluídas em 10ml de solução fisiológica, na glândula mamária esquerda. A função de neutrófilos sangüíneos foi medida pelo teste nitroazul tetrazólio (NBT), antes da inoculação, no momento da infecção e 12, 24, 48 e 72 horas pós-infecção, quando foi instituído o tratamento intramamário com antimicrobiano, por três dias consecutivos. A colheita final de sangue foi realizada 48 horas após a última aplicação do medicamento. Amostras de sangue para determinação da vitamina E foram colhidas no dia do parto, no momento da infecção, 48 horas pós-infecção e 48 horas pós-tratamento e analisadas por cromatografia líquida de alta performance. Na prova não estimulada do NBT não foram verificadas diferenças entre grupos e entre momentos. Na prova estimulada do NBT (NBT-E) houve diferença entre tratamentos às 12 e 72 horas pós-infecção, com valores mais elevados de NBT-E nos animais sem suplementação. Conclui-se que a suplementação com vitamina E reduz o percentual de neutrófilos NBT-E positivos.

Palavras-chave: vitamina E, função de neutrófilo, NBT, cabras

ABSTRACT

Neutrophil function in experimentally induced mastitis in goats, inoculated with Staphylococcus aureus supplemented and not supplemented with vitamin E (acetate DL-a -tocopherol) was evaluated. Fourteen pregnant Saanen goats, between 8 and 12 months of age all negative in bacteriological milk cultures, were used. Seven goats were treated with 2,000 IU of vitamin E, by intramuscular injection, on the day of the parturition and seven days later, and seven goats were not tested. On the 10th day the two groups were inoculated with 300 colony forming units of Staphylococcus aureus (ATCC 25923), diluted in 10ml of physiologic saline, by injection in the left mammary gland through ductus papillari. Blood samples were evaluated for neutrophil function by the nitroblue tetrazoliun test (NBT), before infection and at zero, 12, 24, 48 and 72 hours post-infection. At this moment, intra-mammary antimicrobial treatment was instituted, and a final assessment of neutrophil function was made 48 hours after the last treatment. Blood samples for vitamin E concentration were collected on the day of the parturition, at the day of infection, 48 hours post-infection and 48 hours post-treatment. The vitamin E concentration was determined by high performance liquid chromatography. The results of NBT-NE (not stimulated) did not detect chronological or group differences. However, by the test of NBT-E (stimulated) a significant difference between treatments on 12 and 72 hours post-infection, with higher values in the animals without supplementation of vitamin E was detected. It is concluded that the supplementation with vitamin E reduced the percentage of positive NBT-E neutrophils.

Keywords: vitamin E, neutrophil function, NBT, goats

INTRODUÇÃO

A avaliação do metabolismo oxidativo dos neutrófilos geralmente é feita observando sua capacidade de reduzir espontaneamente nitroazul tetrazólio (NBT) formando depósitos citoplasmáticos de formazan. Essa prova é denominada de não estimulada (NBT-NE). Para descartar resultados falso negativos, Park e Good (1970) desenvolveram uma técnica que avalia a capacidade dos neutrófilos reduzirem o NBT na presença de um estimulante à base de extrato bacteriano inativado. Essa é conhecida como prova estimulada de redução do NBT (NBT-E).

Feigin et al. (1971), ao compararem pacientes com infecções bacterianas e indivíduos sadios ou com outras enfermidades de origem não bacteriana, constataram que os pacientes com infecções bacterianas apresentaram maior número de células com depósito de formazan.

Poli e Mantelli (1974) estudaram em várias espécies a capacidade dos neutrófilos reduzirem o NBT em animais considerados clinicamente sadios. Nesse estudo, em 10 cabras adultas da raça Tibetana, observaram que o percentual de neutrófilos redutores de NBT variava de 0 a 3%, com média de 1,5%. Sara e Dwaraknath (1977) verificaram que em oito vacas com mastite, seis apresentavam depósitos de formazan típico ou 15-21% de neutrófilos positivos. Os mesmos autores encontraram 23 a 35% de neutrófilos NBT-positivos em cabras com pleuropneumonia contagiosa dos caprinos.

Nagahata et al. (1988) e Kehrli et al. (1989) observaram aumento do metabolismo oxidativo dos neutrófilos de vacas nas duas semanas que precederam ao parto e acentuada diminuição na primeira semana de lactação. Para Kehrli et al. (1989), o aumento da atividade do neutrófilo próximo ao parto pode ser atribuído ao aumento de estrógenos, prolactina, hormônio do crescimento e/ou insulina antes do parto. A diminuição da função oxidativa na primeira semana pós-parto pode estar ligada ao balanço negativo de proteína e energia, comum no início da lactação. Segundo Gilbert et al. (1993), a produção de ânion superóxido diminui na primeira semana pós-parto e aumenta logo após, até a sexta semana de lactação.

Smith (1986) considera que a dieta suplementada com vitamina E e selênio é importante para manter os mecanismos de defesa do organismo, incluindo a produção de anticorpos, proliferação celular, produção de citocinas, metabolismo das prostaglandinas e função dos neutrófilos. A vitamina E melhora a função dos neutrófilos por sua ação como antioxidante. Logo após a fagocitose da bactéria pelo neutrófilo ocorre aumento do conteúdo de radicais livres, especialmente superóxido dentro do lisossoma (Babior, 1984), e a proteção das membranas celulares contra esses radicais é dada pela vitamina E. Segundo Hogan et al. (1989) e Weiss et al. (1992), durante o periparto a concentração de vitamina E, em vacas leiteiras, normalmente é baixa. Coincidentemente a taxa de infecção intramamária é alta e a função dos neutrófilos está suprimida. A redução do a-tocoferol no plasma durante o periparto parece estar relacionada com a mudança no consumo de vitamina E, o que compromete a capacidade de transporte da vitamina.

Chan et al. (1989) consideram que durante infecções e períodos de inflamação há aumento da destruição do tocoferol pelos fagócitos e que o tratamento com altas doses de vitamina E pode ter efeito benéfico. Isso sugere que a vitamina E parenteral melhora os efeitos adversos do aumento de cortisol por aumentar o conteúdo de vitamina E no neutrófilo.

Este estudo teve como objetivo determinar a ação de vitamina E, administrada via intramuscular, na prevenção da supressão da função de neutrófilos em cabras com mastite experimental.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizadas 14 cabras da raça Saanen, gestantes, com cultura bacteriológica do leite negativa, idades entre 8 e 12 meses e provenientes de Botucatu e Itapeva, no Estado de São Paulo e Londrina Estado do Paraná. Os animais foram mantidos em baias do Hospital Veterinário, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP - Campus de Botucatu, desde os 60 dias antes do início do experimento até o fim do período experimental. A dieta durante todo o experimento era constituída de concentrado, feno de coast-cross, sal mineral e água ad libitum.

Antes do início do experimento os animais foram submetidos a exames clínico, de sangue (hemograma) e parasitológico de fezes. O leite foi avaliado pelo Califórnia mastitis test (CMT), pela contagem de células somáticas (CCS) e por cultura bacteriológica. Os animais vermifugados com moxidectin (Cidectin - Fort Dodge Animal Healt - Iowa 50501 - USA) (1ml/50kg), apresentaram após a vermifugação menos de 300 ovos por grama de fezes. Todos foram negativos para o vírus da artrite encefalite caprina.

Foram constituídos dois grupos experimentais de sete animais: grupo I com animais suplementados com 2000UI de vitamina E (Monovin E - Laboratório BRAVET Ltda. Rio de Janeiro, Brasil) (acetato de DL-a-tocoferol), via intramuscular, no dia do parto e no sétimo dia após o parto; e grupo II - com animais sem suplementação. O controle foi constituído pelos próprios animais por meio de exames de laboratório no oitavo, nono e décimo dias após o parto.

No 10º dia pós-parto, todos os animais foram inoculados com 300 unidades formadoras de colônias (UFC) (Harmon, Heald, 1982) da cepa de Staphylococcus aureus (Nupemas - FMVZ - UNESP. Botucatu) ATCC 25923, diluídas em 10ml de salina estéril na glândula mamária esquerda. O acompanhamento diário dos animais era feito pela manhã e à tarde, com tomada da temperatura retal e avaliação clínica.

Alterações evidentes da glândula mamária, identificadas por meio de exames clínicos e de laboratório, foram usadas para caracterizar mastite clínica, com as seguintes interpretações: contagem de células somáticas igual ou superior a 1000´103 de células/ml de leite (Poutrel, Lerondelle, 1983) e exame microbiológico positivo, com pelo menos cinco ou mais UFC de S. aureus/ml de leite (Postle et al., 1978). A contagem de células somáticas foi feita de acordo com a técnica descrita por Preescot e Breed (1910). As colheitas de sangue e de leite foram feitas nos seguintes momentos (M): M1 - controle; M2 - 24 ou 48 horas pós-inoculação (infecção); M3 - 12 horas pós-infecção; M4 - 24 horas pós-infecção; M5 - 48 horas pós-infecção; M6 - 72 horas pós-infecção e início do tratamento; M7 - 48 horas pós-tratamento.

As colheitas de sangue para determinação da vitamina E foram realizadas nos seguintes momentos: M1 - controle (no dia do parto); M2 - momento da infecção; M3 - 48 horas pós-infecção e M4 - 48 horas pós-tratamento.

Instituiu-se o tratamento no M6 (72 horas após diagnóstico microbiológico positivo). Por três dias consecutivos, infundiram-se 10ml de formulação intramamária de cefaprina sódica (Cefa-lak - Fort Dodge Animal Health - Iowa 50501 - USA), sempre após a ordenha matinal.

Para a avaliação do metabolismo oxidativo dos neutrófilos foram utilizados os métodos estimulado (NBT-E) e não estimulado (NBT-NE), realizados simultaneamente e no máximo 30 minutos após a colheita do sangue. Seguiu-se o método citoquímico descrito por Park e Good (1970) com algumas modificações, conforme indicação do fabricante. Foram contados 100 neutrófilos para cada prova, discriminando-se o percentual de células NBT positivas e negativas, conforme a presença ou não de formazan (NBT reduzido) intracitoplasmático.

A determinação da concentração plasmática de vitamina E foi realizada no laboratório de nutrição da Faculdade de Medicina da UNESP, Campus de Botucatu, por meio de cromatografia líquida de alta performace (HPLC), seguindo as recomendações de Arnaud (1991).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As manifestações clínicas características da mastite como edema do úbere, calor, rubor e dor, citados por Smith e Sherman (1994) e Birgel (1998), foram mais intensas nos animais do grupo II.

No momento-controle (M1), a CCS foi inferior a 278×103 células/ml de leite tanto para a mama esquerda a ser inoculada como para a glândula direita (Tab. 1). Quando chegou-se ao diagnóstico de mastite às 24 e 48 horas após a inoculação, todos os animais apresentaram CCS acima de 1×106 células/ml de leite na mama inoculada, coincidindo com o reisolamento do agente. A diferença na CCS entre as duas metades da glândula mamária foi descrita por Lerondelle e Poutrel (1984) e considerada como critério de avaliação no diagnóstico laboratorial da mastite em cabras.

Tabela 1
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Embora Smith e Roguinsky (1977) e Nesbakken (1978) considerem a contagem de 1×106 células/ml de leite como de glândulas normais ou com pequenas irritações mecânicas, neste experimento o agente foi novamente isolado e as manifestações clínicas de mastite já estavam presentes.

Houve diferença da CCS em todos os momentos (Tab.1), com exceção de M1, entre as mamas direita e esquerda, nos dois grupos. Entretanto, os animais do grupo I apresentaram valores de CCS menores, coincidente com os achados de Smith et al. (1985). Considerando apenas a mama esquerda, houve diferença (P<0,05) em ambos os grupos, em todos os momentos (M2 a M7) em relação a M1. Diferença também foi encontrada entre os grupos mas apenas entre M4 a M7, com valores de CCS menores no grupo I, mas superior a 1 milhão de células/ml de leite, com predominância de neutrófilos. Dados semelhantes foram encontrados por Smith et al. (1985) em novilhas de primeira lactação, suplementadas com 1000UI de vitamina E 60 dias antes do parto.

No grupo II (sem vitamina E) os valores médios da CCS foram superiores a 3×106 células/ml para a glândula mamária esquerda com predominância de neutrófilos, caracterizando um processo inflamatório (Smith, Roguinsky, 1977; Hinckley, 1883). Esses valores mais baixos de CCS para a glândula mamária esquerda comprova o efeito da suplementação com vitamina E, que diminui a severidade da mastite, também comprovado em vacas por Smith et al. (1984), Politis et al. (1995) e Smith et al. (1997).

Não foi observada diferença entre momentos, em ambos os grupos, quanto ao número de UFC, mas ocorreu diferença entre grupos de M2 a M6 (Tab. 2). O grupo I apresentou valores mais baixos de UFC, sugerindo o efeito da vitamina E na proteção contra infecções intramamárias (Smith et al., 1997; Weiss et al., 1997).

Tabela 2
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Para o teste não estimulado de redução do NBT não foi observada diferença entre momentos e entre grupos. A Tab. 3 mostra que o percentual médio de neutrófilos sangüíneos positivos foi maior no grupo I do que no grupo II. Entretanto, no momento-controle (M1), nos dois grupos, o percentual médio de neutrófilos positivos foi maior do que os considerados como limites de normalidade (0-3%), citados por Poli e Mantelli (1974). Possivelmente a superação dos limites de normalidade e a diferença com os dados citados por Nagahata et al. (1988) e Kehrli et al. (1989) devem-se ao fato de que as cabras estavam na segunda semana de lactação (Gilbert et al., 1993). Ciarlini (1998) encontrou alto percentual de neutrófilos NBT-NE positivos em ovelhas da raça Ideal na primeira semana de lactação. Ainda é desconhecido o mecanismo de inibição do metabolismo oxidativo dos neutrófilos no início da lactação, mas Kehrli et al. (1989) acreditam que esteja relacionada ao balanço negativo de proteínas e energia que comumente ocorre nas fêmeas no início da lactação. Possivelmente os percentuais mais altos de neutrófilos NBT-NE positivos, encontrados no grupo I, estejam relacionados (Smith, 1986) ao efeito da vitamina E na manutenção dos mecanismos de defesa do organismo, incluindo produção de anticorpos, proliferação celular, produção de citocinas, metabolismo das prostaglandinas e melhora da função dos neutrófilos. Segundo Politis et al. (1995), a vitamina E previne a supressão de produção de superóxidos pelos neutrófilos sangüíneos bovino observados na lactação, o que pode ter ocorrido no presente experimento, comprovado pelo aumento da concentração sérica de vitamina E no grupo suplementado.

Tabela 3
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Os neutrófilos das cabras com e sem suplementação com vitamina E, quando estimulados, aumentaram a sua capacidade de reduzir o NBT (Tab. 3). Entretanto, essa capacidade de redução foi menor no grupo que recebeu suplementação com vitamina E, havendo diferença significativa (P<0,05) entre M2, M3, M4 e M6. Ao contrário do que se verificou para o percentual de redução espontânea do NBT-NE, o grupo I apresentou percentual de redução do NBT-E inferior ao do grupo II, comprovando o efeito protetor da vitamina E na função dos neutrófilos.

Os resultados demonstram que o processo inflamatório foi mais intenso no grupo II quando a CCs era mais elevada. Também o percentual de neutrófilos NBT-E positivos foi mais elevado nesse grupo. Segundo Kitagawa (1988), durante a reação inflamatória os monócitos e/ou linfócitos T ativados produzem várias citocinas, tais como IL-1, TNF e interferon-gama, que estimulam as células endoteliais e/ou fibroblastos a secretarem os fatores endoteliais estimuladores de colônias (G-CSF e GM-CSF) que ativam os neutrófilos, fato que pode justificar o aumento do percentual de neutrófilos positivos nesse grupo.

O aumento do número de células com depósito de formazan no grupo II, justamente que apresentou resposta inflamatória mais intensa, está de acordo com Feigin et al. (1971) que relataram ser uma característica de pacientes com infecções bacterianas ou com enfermidades não bacterianas.

O mecanismo pelo qual a vitamina E aumenta a defesa do organismo nas infecções é atribuído ao seu efeito antioxidante que protege as células fagocíticas e os tecidos ao seu redor dos ataques oxidativos dos radicais livres, produzidos pela explosão respiratória dos neutrófilos e macrófagos, durante a fagocitose (Baehner et al., 1977; Babior, 1984). Os dados do presente experimento corroboram com isso.

Diante dos resultados é possível concluir que a suplementação com vitamina E diminui a gravidade da mastite, com redução no percentual de neutrófilos NBT-E positivos; os níveis plasmáticos de vitamina E refletem a suplementação com a vitamina.

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Trabalho realizado com recursos da FAPESP

Recebido para publicação em 23 de outubro de 2002

Recebido para publicação, após modificações, em 1º de abril de 2003

E-mail: somia@hcv.ufsm.br

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    13 Jan 2004
  • Data do Fascículo
    Out 2003

Histórico

  • Revisado
    01 Abr 2003
  • Recebido
    23 Out 2002
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