Anticorpos em bovinos (Bos indicus e Bos taurus) e bubalinos (Bubalus bubalis) inoculados com oocistos de Toxoplasma gondii. Estudo comparativo

Antibody response in bovines (Bos indicus and Bos taurus) and buffalo (Bubalus bubalis) inoculated with oocysts of Toxoplasma gondii. Comparative study

Resumos

Três animais de cada espécie (Bos indicus, Bos taurus e Bubalus bubalis) foram inoculados, via oral, com 2×10(5) oocistos de Toxoplasma gondii. Seis outros animais, dois de cada espécie, foram mantidos como testemunhas. A resposta de anticorpos avaliada por meio da reação de imunofluorescência indireta iniciou-se a partir do quinto dia pós-inoculação (DPI) nos zebuínos e bubalinos, e no sétimo DPI nos taurinos. Os títulos sorológicos nos taurinos permaneceram elevados até o final do experimento (70º DPI), alcançando níveis máximos (1:16.384) entre o 42º e 49º DPI. Nos zebuínos e bubalinos o maior título de anticorpos anti-Toxoplasma foi de 1:256. A resposta de anticorpos mais ou menos acentuada não está necessariamente relacionada à sensibilidade ao T. gondii.

Bovino; bubalino; Toxoplasma gondii; anticorpo

Bos indicus e

Bos taurus) e bubalinos (

Bubalus bubalis) inoculados com oocistos de

Toxoplasma gondii. Estudo comparativo

[Antibody response in bovines (Bos indicus and Bos taurus) and buffalo (Bubalus bubalis) inoculated with oocysts of Toxoplasma gondii. Comparative study]

F.C.R. Oliveira¹, A.J. Costa², G.A. Sabatini²

1Pós-Graduando em Medicina Veterinária

Instituto de Biologia da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

BR 465, km 7

23890-000 – Seropédica, RJ

²Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária da UNESP - Jaboticabal, SP

Recebido para publicação, após modificações, em 4 de abril de 2000.

E-mail: oliveira@ufrrj-br

RESUMO

Três animais de cada espécie (Bos indicus, Bos taurus e Bubalus bubalis) foram inoculados, via oral, com 2´10⁵ oocistos de Toxoplasma gondii. Seis outros animais, dois de cada espécie, foram mantidos como testemunhas. A resposta de anticorpos avaliada por meio da reação de imunofluorescência indireta iniciou-se a partir do quinto dia pós-inoculação (DPI) nos zebuínos e bubalinos, e no sétimo DPI nos taurinos. Os títulos sorológicos nos taurinos permaneceram elevados até o final do experimento (70^o DPI), alcançando níveis máximos (1:16.384) entre o 42^o e 49^o DPI. Nos zebuínos e bubalinos o maior título de anticorpos anti-Toxoplasma foi de 1:256. A resposta de anticorpos mais ou menos acentuada não está necessariamente relacionada à sensibilidade ao T. gondii.

Palavras-chave: Bovino, bubalino, Toxoplasma gondii, anticorpo

ABSTRACT

Three animals of each species (Bos indicus, Bos taurus and Bubalus bubalis) were oral inoculated with 2.0´10⁵ sporulated Toxoplasma gondii oocysts. Six other animals, two of each species, were kept as control. The antibody response by indirect fluorescent antibody test begun on day fifth after inoculation in B. indicus and B. bubalis and on day seventh after inoculation in B. taurus. The serological titles maintained high up to the final of the experiment on day 70^th after inoculation in B. taurus and reached the maximum levels (1:16,384) between the 42^nd and 49^th day after inoculation. In zebu and buffalo, the highest title of anti-Toxoplasma was 1:256. Higher or lower antibody response is not related to T. gondii sensitivity.

Keywords: Cattle, bufallo, Toxoplasma gondii, indirect fluorescent

INTRODUÇÃO

Toxoplasma gondii Nicolle & Manceux 1909 é o agente etiológico da toxoplasmose humana e animal. Em indivíduos imunocompetentes a infecção pelo T. gondii induz possivelmente uma proteção imunitária contra a reinfecção (Johnson et al., 1983; Sharma et al., 1984; Sibley & Sharma, 1987). Os avanços nas técnicas de diagnóstico associados ao conhecimento dos clínicos e patologistas têm mostrado a vasta distribuição e ocorrência da toxoplasmose humana e animal (Ishizuka, 1974). Os determinantes antigênicos do T. gondii incluem componentes moleculares os quais são relacionados à biologia celular do parasito, à indução de resposta imune e aos estágios da doença (Kasper et al., 1983; Decoster et al., 1988).

A doença natural em ruminantes foi diagnosticada pela primeira vez em bovinos, na Alemanha, por Houersdorf & Holtz (1952), citados por Mayer (1965). Várias referências são encontradas na literatura sobre isolamento de T. gondii e de anticorpos anti-Toxoplasma em ruminantes. Os dados concernentes à infecção por T. gondii em ruminantes resumem-se praticamente a estudos sobre frequência e isolamento desse parasita em animais capazes de transmitir a infecção ao homem, quando utilizados como fonte de alimento (Costa et al., 1978; Sogandare-Bernal et al., 1985; Marana et al., 1994; van Knapen et al., 1995; Pita Godin et al., 1999). Em bubalinos, Maronpot & Botros (1972), por meio da reação de imunofluorescência indireta (RIFI), observaram 28% de animais positivos para anticorpos anti-T. gondii em um total de 211 animais examinados. Kalita et al. (1978) concluíram que bezerros bubalinos eram susceptíveis ao T. gondii. Pela reação de hemaglutinação indireta (RHI) foram detectados anticorpos anti-T. gondii a partir do 13º dia com pico da resposta imunológica ao redor do 30º dia. Em outro experimento com oito bezerros bubalinos inoculados com oocistos de T. gondii foi observada resposta de anticorpos (RHI) no 21º dia, com pico no 42º e queda rápida após o 63º dia da infecção (Goutam et al., 1982). Na Índia, Chhabra et al. (1985) observaram 32% de reagentes positivos (RHI) para anticorpos anti-T. gondii em 108 búfalos examinados. Mais recentemente, Pita Gondim et al. (1999) observaram em 104 bubalinos examinados que 3,8% deles estavam positivos para anticorpos anti-T. gondii pelo teste de aglutinação do látex (LAT), com o maior título de 1:512.

Este trabalho teve por objetivos compilar dados de laboratório que permitissem melhor conhecimento da evolução da infecção e avaliar comparativamente a resposta imunitária humoral dos animais infectados, por meio da reação de imunofluorescência indireta (RIFI).

MATERIAL E MÉTODOS

Na presente pesquisa foi utilizada a cepa denominada P, isolada de cães e mantida junto ao Centro de Pesquisas Parasitológicas (CPPAR), da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal (FCAVJ) da UNESP, por meio de sucessivas passagens em camundongos albinos. Para obtenção de oocistos foram utilizados seis gatos sem raça definida, de quatro semanas de idade. Esses animais, quando selecionados, estavam negativos coprológica e sorologicamente quanto à presença do protozoário. Cada felídeo foi inoculado por via oral com aproximadamente 1500 cistos de T. gondii, provenientes de encéfalos de camundongos cronicamente infectados pela cepa P. Para obtenção dos cistos, alguns camundongos foram sacrificados e seus encéfalos removidos e triturados em gral com solução salina a 0,9%. A contagem de cistos foi realizada em alíquotas de 0,1ml de suspensão. Os exames coprológicos, utilizando-se todo o volume de fezes emitido pelos gatos durante 24 horas, foram realizados diariamente, durante 15 dias consecutivos. O material de cada dia foi imerso em frascos individuais contendo ácido sulfúrico a 2% e mantidos em temperatura ambiente durante 15 dias. Os frascos foram agitados diariamente por alguns minutos para acelerar a esporulação (Dubey et al., 1972). Decorrido esse período, os oocistos esporulados foram lavados em água destilada para remoção do ácido sulfúrico, por meio de sucessivas centrifugações, e estocados em geladeira a 4^oC imersos em solução salina a 0,9%.

Antes de os ruminantes serem inoculados, as suspensões de oocisto foram padronizadas em solução salina a 0,9%, sendo o tamanho do inóculo definido mediante a contagem de oocistos em câmara de Neubauer, de acordo com a técnica adotada por Costa (1979). Foram inoculados três animais de cada uma das espécies B. indicus, B. taurus e B. bubalis, machos, na faixa etária de quatro a sete meses. Seis animais com a mesma idade e sexo, dois de cada espécie, foram mantidos como controle. Os animais foram mantidos em baias individuais, protegidos da presença eventual de cães e gatos. Água e alimentação foram fornecidos ad libitum.

Os oocistos (2´10⁵) foram administrados por via oral por meio de uma seringa de 10ml acoplada a uma sonda de metal e depositados diretamente no esôfago. Em seguida à administração do inóculo, com o objetivo de remover os oocistos eventualmente presos às paredes da seringa e da sonda administraram-se 20ml de solução salina estéril.

Nos soros de todos os animais, obtidos nos dois dias anteriores à inoculação e nos dias 1, 3, 5 e 7 após a infecção e semanalmente até o final do experimento, foram pesquisados anticorpos anti-Toxoplasma. Para tal, todas as amostras de soro colhidas foram estocadas no laboratório a –20^oC e posteriormente analisadas por meio da reação de imunofluorescência indireta (RIFI), conforme técnica preconizada por Camargo (1964). Foram utilizados como antígeno taquizoítos de T. gondii (cepa P), obtidos de lavagem peritoneal de camundongos previamente infectados, e submetidos à centrifugação diferencial (Lycke & Lunde, 1964), para separação das formas parasitárias do T. gondii de outros constituintes (leucócitos e hemácias). Inicialmente, os soros foram analisados nas diluições 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024 e 1:2048. Os soros que apresentaram reação positiva na ultima diluição foram analisados nas diluições 1:4096, 1:8192 e 1:16384. Somente os que apresentaram reação positiva 1:16384 foram analisados diluídos a 1:32768. Em todos os testes foram utilizados conjugado anti-IgG bovina marcada com isotiacianato de fluoresceína (FITC) SIGMA, diluída a 1:320 e como diluente tampão salino fosfato (PBS).

Utilizou-se um delineamento inteiramente ao acaso em esquema de parcelas subdivididas no tempo, tendo nas parcelas um esquema fatorial com seis tratamentos (três espécies animais e duas condições) e nas subparcelas avaliações no tempo, utilizando-se o teste F segundo Pimentel Gomes (1985).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A escolha da RIFI para pesquisa de anticorpos anti-Toxoplasma originou-se das observações de Ishizuka (1974), segundo as quais essa prova sorológica detecta níveis de anticorpos ligeiramente superiores à reação de Sabin e Feldman. Outros autores em inquéritos epidemiológicos, em ruminantes, utilizaram esse tipo de reação (Maronpot & Botros, 1972; Costa & Costa, 1978; Costa et al., 1978; Kutkene, 1993) e estabeleceram que títulos iguais ou acima de 1:16 são indicativos de contato prévio com T. gondii. Por essa razão adotou-se esse limiar sorológico na avaliação de resposta humoral dos animais.

Os resultados e análise dos dados obtidos pela RIFI encontram-se nas Tab. 1 e 2. Todos os animais infectados responderam ao estímulo antigênico, produzindo anticorpos anti-Toxoplasma a partir do quinto-sétimo DPI e permaneceram com título igual ou superior a 1:64 até o 70º DPI. Esses resultados são semelhantes aos de Costa et al. (1977) que observaram um período negativo de anticorpos antes do sexto dia e persistência de título positivo após o 70º DPI em B. taurus experimentalmente infectados com oocistos de T. gondii. A interação espécie´tempo, apesar de significativa (P<0,01), não permite especulações sobre a significância na espécie animal e no tempo isoladamente. Entretanto, a Fig. 1 mostra o comportamento dessa variável, na qual observa-se que os títulos sorológicos de B. taurus foram maiores do que os de B. indicus e B. bubalis, estes últimos com comportamento semelhante entre si no período estudado. Chama a atenção (Tab. 1) os baixos títulos sorológicos decrescentes dos zebuínos e bubalinos à medida que se aproximava o final do experimento, semelhante ao observado em bubalinos por Goutam et al. (1982). A evolução da resposta humoral em taurinos pode ser parcialmente explicada pela persistência de picos parasitêmicos, fato não observado nas outras espécies (Oliveira, 1997). Tais resultados demonstram que zebuínos e bubalinos têm menor produção de anticorpos frente à infecção toxoplásmica.

CONCLUSÃO

A infecção experimental de B. indicus, B. taurus e B. bubalis com oocistos de T. gondii possibilitam concluir que todas as três espécies respondem ao estímulo antigênico, produzindo anticorpos anti-Toxoplasma detectados pela RIFI, com títulos sorológicos mais elevados em taurinos.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Set 2000
• Data do Fascículo
  Ago 2000

Histórico

• Recebido
  04 Abr 2000