Enterotoxigenicidade de cepas de Aeromonas sp. isoladas em diferentes pontos do fluxograma de abate bovino

Enterotoxigenicity of Aeromonas sp. strains isolated from differents points in the cattle slaughtering processing line

O.D. Rossi Júnior L.A. Amaral A. Nader Filho R.P. Schocken-Iturrino Sobre os autores

Resumos

Com o objetivo de verificar a capacidade enterotoxigênica de cepas de Aeromonas sp. isoladas em diferentes produtos e locais no fluxograma de abate bovino, foram testadas 102 cepas (18 da espécie A. hydrophila, 65 da espécie A. caviae e 19 atípicas) ante os testes de inoculação intragástrica em camundongo lactente e em alça intestinal ligada de coelho. Revelaram-se como produtoras de enterotoxinas três (16,7%) cepas da espécie A. hydrophila, originárias das mãos do manipulador antes que ele iniciasse seus trabalhos e da carne desossada pronta para o consumo, e uma (1,5%) da espécie A. caviae, também isolada das mãos. Os resultados são preocupantes pela presença de cepas enterotoxigênicas de bactérias do gênero Aeromonas em indústria de alto nível higiênico-sanitário.

Aeromonas hydrophila; Aeromonas caviae; enterotoxigenicidade; abate bovino


With the objective of verifying the enterotoxigenic level of Aeromonas sp. strains, isolated from several products and points in the cattle slaughtering processing line, 102 strains were tested (18 from A. hydrophila, 65 from A. caviae and 19 atypical), using suckling-mouse intragastric inoculation test and rabbit bond ileal loop assay. Producers of enterotoxins were found in three (16.7%) strains of A. hydrophila, originated from meat handlers hands, before the person begin working, and from ready to consume deboned meat, and in one (1.5%) strain of A. caviae, which was also isolated from the hands. The results are worrisome based on the presence of Aeromonas enterotoxigenic strains on the hands of workers as well as in the meat sampled from an extremely hygienic processing plant. Such facilities may act as a transmitting vehicle of this important and relatively new food poisoning agent.

Aeromonas hydrophila; A. caviae; enterotoxigenicity; cattle slaughtering


Enterotoxigenicidade de cepas de Aeromonas sp. isoladas em diferentes pontos do fluxograma de abate bovino

[Enterotoxigenicity of Aeromonas sp. strains isolated from differents points in the cattle slaughtering processing line]

O.D. Rossi Júnior1, L.A. Amaral, A. Nader Filho, R.P. Schocken-Iturrino

1Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da UNESP

Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castelani, s/n

14884-900 – Jaboticabal, SP

Recebido para publicação em 27 de outubro de 2000.

Recebido para publicação, após modificações, em 27 de junho de 2001.

E-mail: rossijr@fcav.unesp.br

RESUMO

Com o objetivo de verificar a capacidade enterotoxigênica de cepas de Aeromonas sp. isoladas em diferentes produtos e locais no fluxograma de abate bovino, foram testadas 102 cepas (18 da espécie A. hydrophila, 65 da espécie A. caviae e 19 atípicas) ante os testes de inoculação intragástrica em camundongo lactente e em alça intestinal ligada de coelho. Revelaram-se como produtoras de enterotoxinas três (16,7%) cepas da espécie A. hydrophila, originárias das mãos do manipulador antes que ele iniciasse seus trabalhos e da carne desossada pronta para o consumo, e uma (1,5%) da espécie A. caviae, também isolada das mãos. Os resultados são preocupantes pela presença de cepas enterotoxigênicas de bactérias do gênero Aeromonas em indústria de alto nível higiênico-sanitário.

Palavras-chave: Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae, enterotoxigenicidade, abate bovino

ABSTRACT

With the objective of verifying the enterotoxigenic level of Aeromonas sp. strains, isolated from several products and points in the cattle slaughtering processing line, 102 strains were tested (18 from A. hydrophila, 65 from A. caviae and 19 atypical), using suckling-mouse intragastric inoculation test and rabbit bond ileal loop assay. Producers of enterotoxins were found in three (16.7%) strains of A. hydrophila, originated from meat handlers hands, before the person begin working, and from ready to consume deboned meat, and in one (1.5%) strain of A. caviae, which was also isolated from the hands. The results are worrisome based on the presence of Aeromonas enterotoxigenic strains on the hands of workers as well as in the meat sampled from an extremely hygienic processing plant. Such facilities may act as a transmitting vehicle of this important and relatively new food poisoning agent.

Keywords: Aeromonas hydrophila, A. caviae, enterotoxigenicity, cattle slaughtering

INTRODUÇÃO

O gênero Aeromonas pertence à família Vibrionaceae e caracteriza-se pela presença de bactérias em forma de bastonetes Gram negativos, capazes de utilizar diferentes carboidratos que produzam ácido ou ácido e gás (Popoff, 1984). São microrganismos de ocorrência amplamente difundida no meio ambiente (Cunliffe & Adcock, 1989), membros importantes da microbiota normal da água (Palumbo et al., 1996), com relatos de isolamento a partir de águas utilizadas para os mais diversos fins (Gavriel et al., 1998; Rossi Júnior et al., 1996b), e de diferentes tipos de alimentos de origem animal (Majeed et al., 1989; Rossi Júnior et al., 1996a,b; Khurana & Kumar, 1997; Singh, 1997; Yadav & Verma, 1998).

As bactérias do gênero Aeromonas são consideradas agentes emergentes de toxinfecções alimentares e oportunistas para o homem e animais (Havelaar et al., 1992), sendo a espécie A. hydrophila sabidamente patogênica para anfíbios (De Figueiredo & Plumb, 1977), répteis (Pasquale et al., 1994) e peixes (Haley et al., 1967), provocando principalmente septicemia, e para bovinos, provocando aborto (Wohlegemuth et al., 1972).

Para o homem, as aeromonas móveis determinam patogenias classificadas como de nível não intestinal e gastrentéricas (Ko & Chuang, 1995). Já foram atribuídos a elas quadros como meningites (Ellison & Mostow, 1984), artrites (Dean & Post, 1967), endocardites (Davis et al., 1978), osteomielites (Lopez et al., 1968), peritonites (Janda, 1991) e infecções cutâneas (Joseph et al., 1979) e oculares (Lee et al., 1997). Elas são responsabilizadas por quadros que vão de amenas diarréias a casos graves de disenteria (Ko & Chuang, 1995).

Alguns autores consideram que o mecanismo pelo qual as aeromonas móveis produzem gastrenterite ainda não está totalmente elucidado (Majeed et al., 1989). Outros (Janda, 1991; Kirov, 1993; Schiavano et al., 1998) demonstram que cepas de aeromonas envolvidas em processos patogênicos usualmente possuem virulência associada à capacidade de produzir enterotoxinas, citotoxinas, hemolisinas, proteases e poder de aderência e invasão em células da mucosa intestinal.

Na determinação dos fatores de virulência produzidos pelas Aeromonas sp. têm sido empregadas técnicas in vivo e in vitro. Assim, na pesquisa de enterotoxinas a partir de extratos de cultura são usados ensaios em camundongos lactentes (Burke et al., 1982; Gautam et al., 1992; Freitas et al., 1993), em coelhos, por meio da inoculação em alça intestinal ligada (Kaper et al., 1981; Singh & Sanyal, 1992), em ratos, por meio de perfusão intestinal (Burke et al., 1981), em cultivos celulares, quando se usa principalmente células CHO, e por meio do teste de ELISA (Haque et al., 1996).

O objetivo deste trabalho foi o de verificar, in vivo, a capacidade enterotoxigênica de cepas de bactérias do gênero Aeromonas isoladas em diferentes produtos e locais no fluxograma de abate bovino, compreendendo desde a chegada dos animais até a carne desossada e pronta para a comercialização.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram testadas 102 cepas de Aeromonas sp. (18 da espécie A. hydrophila, 65 da espécie A. caviae e 19 atípicas) isoladas de diferentes produtos e locais em um matadouro frigorífico de bovinos, envolvendo a água utilizada nos currais, os suabes da superfície das mãos de manipuladores antes e durante a jornada de trabalho, das superfícies da pele e muscular das partes dianteira e traseira da carcaça e da superfície de facas, a água residuária da lavagem de carcaças, o ambiente da sala de matança, a carne desossada e o conteúdo intestinal.

As cepas foram inicialmente repicadas em caldo tripticase soja e incubadas a 28°C por 24 horas. Em seguida, volumes de 0,1ml foram inoculados em frascos tipo Erlenmeyer contendo 20ml do mesmo caldo suplementado com 0,6% de extrato de levedura (Burke et al., 1981). Após 24 horas de incubação a 37°C, procedia-se a centrifugação a 8000rpm por 20 minutos a 4°C. Os sobrenadantes obtidos foram esterilizados por filtração em membranas de éster de celulose com poros de 0,45 micrômetros. Os testes foram realizados no mesmo dia da preparação dos extratos.

Para cada uma das cepas foram utilizados três camundongos albinos-suíços, com idade entre três e cinco dias. A cada 1ml de sobrenadante estéril foram adicionadas duas gotas de solução de azul de Evans a 1%, e 0,1ml dessa mistura foram inoculados em cada um dos camundongos. Os animais foram mantidos à 28°C por quatro horas e, em seguida, abertos para a remoção dos intestinos. Tanto os intestinos como as carcaças foram pesados imediatamente. O teste foi considerado positivo quando a relação peso dos intestinos:peso da carcaça era de no mínimo 0,080 em pelo menos dois camundongos. Escherichia coli enterotoxigênica foi usada para o controle positivo e caldo tripticase soja esterilizado para o negativo (Abeyta Junior et al., 1986; Burke et al., 1982; Gautam et al., 1992).

Para o teste em alça intestinal foram utilizados coelhos albinos da raça Norfolk 2000, com peso entre 1500 e 2000 gramas. Após anestesia com cloridrato de ketamina (Vetanarcol – Konig S.A) e cloridrato de xilazina (Kensol – Konig S.A) nas dosagens de 20mg/kg e 2,0mg/kg, respectivamente, as alças intestinais foram expostas por laparotomia e o conteúdo do íleo removido para porções anteriores ou posteriores. Após lavagem com solução fisiológica, as alças foram divididas em segmentos de aproximadamente 5cm, por meio de ligaduras com fio de algodão. Volumes de 1ml dos filtrados foram injetados em segmentos alternados, fechando-se em seguida o abdome. Cada filtrado foi inoculado em pelo menos dois animais diferentes. Após 18 horas, os coelhos foram sacrificados e as alças intestinais examinadas quanto à presença de dilatação e acúmulo de fluido. Para cada um dos segmentos calculava-se a relação volume do líquido: comprimento, sendo o teste considerado positivo quando essa relação se mostrava pelo menos quatro vezes maior que a encontrada no controle negativo. A cepa foi considerada como produtora de enterotoxina quando o teste se mostrava positivo nos dois coelhos. Nos casos de resultados antagônicos o teste foi repetido em pelo menos mais um animal. Utilizou-se cepa de Escherichia coli enterotoxigênica como controle positivo e caldo soja tripticase esterilizado como negativo (Abeyta Junior et al., 1986; Kaper et al., 1981; Singh & Sanyal, 1992) .

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Pelos dados apresentados na Tab. 1 verifica-se que das 102 cepas testadas, três (16,7%) revelaram-se como produtoras de enterotoxinas da espécie A. hydrophila e uma (1,5%) da espécie A. caviae. As cepas da espécie A. hydrophila foram positivas nos dois testes e foram originárias da superfície das mãos de manipuladores, da carne desossada e do conteúdo intestinal, enquanto que a da A. caviae foi positiva somente na prova em alça intestinal de coelho e originária da superfície das mãos.

Os percentuais de cepas positivas nessas provas mostraram-se inferiores aos verificados por Burke et al. (1981), que encontraram 76,7% de cepas de A. hydrophila enterotoxigênicas, e aos verificados por Majeed et al. (1989), que encontraram 67% de cepas de A. hydrophila e 8% de A. caviae produtoras de enterotoxinas frente à prova de inoculação em camundongos lactentes. São também inferiores aos achados de Gautam et al. (1992), nos quais 97,2% das A. hydrophila e 14,1% das A. caviae isoladas de fontes aquáticas eram enterotoxigênicas, e inferiores aos de Freitas et al. (1993), nos quais 28% das A. hydrophila isoladas de queijo branco no Rio de Janeiro produziram enterotoxinas, determinadas pela prova em camundongo lactente. Os resultados deste estudo mostraram-se superiores aos encontrados por Figura & Marri (1985), em que 13,3% das cepas de A. hydrophila e nenhuma A. caviae isoladas de suínos produziram enterotoxinas e superiores aos de Kirov et al. (1990), que não encontraram cepas enterotoxigênicas dentre as A. hydrophila isoladas de carcaças de aves. Freitas et al. (1993) sugeriram que as discrepâncias nos percentuais de cepas enterotoxigênicas nos diferentes estudos sejam atribuídas às diferenças nas propriedades de virulência das cepas isoladas de diversas regiões geográficas. Gautam et al. (1992) acreditam que cepas de mesma origem e características semelhantes apresentam os mesmos fatores de virulência. Independentemente do percentual de isolamento de cepas enterotoxigênicas, todos os autores citados são unânimes na preocupação quanto à veiculação dessas cepas através de alimentos de origem animal, e alertam os serviços de saúde responsáveis para tal.

A Tab. 2 traz os resultados dos testes de acúmulo de líquido na luz intestinal de coelhos e de inoculação intragástrica em camundongos. No primeiro teste deve ser considerada como produtora de enterotoxina a cepa cuja relação volume:comprimento de alça intestinal se apresentou com valores no mínimo quatro vezes maior do que o controle negativo (Abeyta Junior et al., 1986; Kaper et al., 1981). Assim, deveriam ser considerados positivos valores acima de 0,16. Os valores encontrados são bem superiores (0,78 a 2,10), indicando grande acúmulo de líquido, muito provavelmente dado à patogenicidade da enterotoxina.

Quanto ao teste de inoculação intragástrica em camundongos lactentes, os valores da relação peso dos intestinos:peso da carcaça obtidos em dois camundongos, inoculados com extrato da cultura das cepas de A. hydrophila, foram inferiores aos encontrados por Figura & Marri (1985), de 0,11 e 0,14, para cepas da mesma espécie isoladas de suínos. Os valores foram superiores ao padrão de 0,08, a partir do qual a cepa é considerada positiva (Abeyta Junior et al., 1986; Burke et al., 1982). Segundo Figura & Marri (1985), os suínos podem servir como fontes de origem de aeromonas, especialmente A. hydrophila patogênica, mas alertam para a necessidade de melhor avaliação do papel desses animais como possíveis reservatórios naturais. Essas observações podem ser também estendidas ao bovinos tendo em vista os resultados obtidos, particularmente pela presença de cepas de aeromonas enterotoxigênicas nos intestinos.

Os valores da relação peso dos intestinos: peso da carcaça de camundongos encontrados com a cepa de A. caviae estavam um pouco abaixo de 0,08, indicativo de atividade enterotoxigênica, e foram bastante próximos aos verificados por Haque et al. (1996), que os encontraram no limite de 0,038 a 0,085. Esses autores trabalharam com cepas sabidamente patogênicas, mas que apresentaram resultados negativos tanto na prova de inoculação intragástrica em camundongos como em cultivos celulares e em outras provas in vitro.

Os resultados do presente estudo, no qual ficou demonstrada a presença de cepas enterotoxigênicas em mãos de operários e na carne bovina originária de indústria de alto padrão higiênico-sanitário, são preocupantes pelo risco desse produto constituir-se em veículo de transmissão de aeromonas, importante agente emergente de toxinfecção alimentar.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    18 Jun 2002
  • Data do Fascículo
    Out 2001

Histórico

  • Recebido
    27 Out 2000
  • Revisado
    27 Jun 2001
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