Resumos
Foram utilizados 46 animais da raça Gir, registrados na Associação Brasileira de Criadores de Zebu, provenientes de cinco fazendas situadas no Estado de Minas Gerais, com o objetivo de avaliar a eficiência dos microssatélites BM2113, ILSTS005, ILSTS008, ETH131 e RM88 em testes de verificação de parentesco. Os locos BM2113, ILSTS005, ETH131 e RM88 mostraram-se eficientes, apresentando valores de PE2 (probabilidade de exclusão quando os dois progenitores são genotipados) entre 0,62 e 0,69 e PIC2 (conteúdo de informação polimórfica quando os dois progenitores são genotipados) entre 0,78 e 0,83. O mesmo não ocorreu para o loco ILSTS008, o qual apresentou baixos valores de PE2 (0,24) e PIC2 (0,41).
Bovino; microssatélite; DNA
Forty six animals of the Gir breed, registered at the Brazilian Association of Zebu Breeders, coming from five farms located in Minas Gerais State, were used to analyze the efficiency of the microsatellites BM2113, ILSTS005, ILSTS008, ETH131 and RM88 in parentage tests. The loci BM2113, ILSTS005, ETH131 and RM88 showed to be efficient, presenting values of PE2 (exclusion probability when both parents are genotiped) between 0.62 and 0.69 and PIC2 (polymorphic information contents when both parents are genotiped) between 0.78 and 0.83. The same was not observed for the locus ILSTS008 that showed low values of PE2 (0.24) and PIC2 (0.41)
Cattle; microsatellite; DNA
Microssatélites BM2113, ILSTS005, ILSTS008, ETH131 e RM88 em testes de verificação de parentesco para bovinos da raça Gir
[Microsatellites BM2113, ILSTS005, ILSTS008, ETH131 and RM88 for parentage tests in bovines of Gir breed]
S.G. Rodrigues, D.A.A. Oliveira, C.S. Teixeira, P.F. Oliveira, E.G.A. Coelho, C. Alves, A.P.S. Velloso, J.C.C. Pereira
Escola de Veterinária da UFMG - Laboratório de Genética
Caixa Postal 567
30123-970 - Belo Horizonte, MG
Recebido para publicação em 19 de julho de 2001
Recebido para publicação, após modificações, em 10 de maio de 2002
E-mail: denise@vet.ufmg.br
RESUMO
Foram utilizados 46 animais da raça Gir, registrados na Associação Brasileira de Criadores de Zebu, provenientes de cinco fazendas situadas no Estado de Minas Gerais, com o objetivo de avaliar a eficiência dos microssatélites BM2113, ILSTS005, ILSTS008, ETH131 e RM88 em testes de verificação de parentesco. Os locos BM2113, ILSTS005, ETH131 e RM88 mostraram-se eficientes, apresentando valores de PE2 (probabilidade de exclusão quando os dois progenitores são genotipados) entre 0,62 e 0,69 e PIC2 (conteúdo de informação polimórfica quando os dois progenitores são genotipados) entre 0,78 e 0,83. O mesmo não ocorreu para o loco ILSTS008, o qual apresentou baixos valores de PE2 (0,24) e PIC2 (0,41).
Palavras-chave: Bovino, microssatélite, DNA.
ABSTRACT
Forty six animals of the Gir breed, registered at the Brazilian Association of Zebu Breeders, coming from five farms located in Minas Gerais State, were used to analyze the efficiency of the microsatellites BM2113, ILSTS005, ILSTS008, ETH131 and RM88 in parentage tests. The loci BM2113, ILSTS005, ETH131 and RM88 showed to be efficient, presenting values of PE2 (exclusion probability when both parents are genotiped) between 0.62 and 0.69 and PIC2 (polymorphic information contents when both parents are genotiped) between 0.78 and 0.83. The same was not observed for the locus ILSTS008 that showed low values of PE2 (0.24) and PIC2 (0.41).
Keywords: Cattle, microsatellite, DNA
INTRODUÇÃO
O principal objetivo dos programas de melhoramento animal é identificar e multiplicar os indivíduos considerados superiores, visando o aprimoramento dos rebanhos. Para tanto, é importante contar com informações corretas nos pedigrees. Com o intuito de preservar a fidedignidade dos registros genealógicos as associações de criadores (sob regulamento do Ministério da Agricultura) passaram a exigir, sob determinadas circunstâncias, testes para confirmação de parentesco, sendo o teste de tipagem sangüínea o mais utilizado em se tratando de bovinos. No entanto, a necessidade da colheita de amostras de sangue, as quais devem ser enviadas imediatamente ao laboratório sob refrigeração, constitui um dos principais empecilhos para a realização do teste. Uma alternativa para contornar esse problema é a análise de DNA pelo emprego de microssatélites, a qual pode apresentar eficácia igual ou superior à da tipagem sangüínea na exclusão de falso parentesco. Esse teste é feito por meio do uso da reação em cadeia da polimerase (PCR), seguido de corrida eletroforética em gel de poliacrilamida para visualização das bandas correspondentes aos fragmentos do DNA. Os microssatélites são amplamente utilizados por serem abundantes, estáveis, fáceis de serem detectados e polimórficos. Outra grande vantagem do teste de DNA, segundo Oliveira & Kuabara (2001), está na obtenção do material para análise, permitindo que se utilize sangue, sêmen, pêlos e outros tecidos corporais, inclusive ossos (no caso de animais mortos).
Um grande número de microssatélites já está caracterizado e mapeado em bovinos, facilitando o uso desses marcadores nos testes de verificação de parentesco. No entanto, os estudos de polimorfismos de DNA estão mais avançados em raças bovinas européias, havendo somente dois estudos feitos em zebuínos no Brasil, um na raça Nelore (Rosa, 1997), envolvendo 63 animais, e outro na raça Gir (Curi, 2000), avaliando 40 famílias. Essa deficiência de dados sobre a raça Gir serviu de motivação para a condução deste estudo, empregando microssatélites diferentes dos utilizados por outros pesquisadores.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram analisadas amostras de pêlo e sangue de 46 animais da raça Gir, constituindo grupos distintos de indivíduos não aparentados e aparentados, provenientes de cinco diferentes fazendas localizadas no Estado de Minas Gerais. A avaliação de indivíduos não aparentados, segundo Vankan & Faddy (1999), é importante para a estimativa das probabilidades de exclusão (PEs), enquanto que a análise de famílias favorece a avaliação da transmissão alélica de pai para filho. Os microssatélites avaliados foram: BM2113 (Bishop et al., 1994), ILSTS005 (Brezinsky et al., 1993), ILSTS008 (Kemp et al.,1993), ETH131 (Steffen et al.,1993) e RM88 (Kossarek et al., 1995).
Para a extração de DNA de sangue foi utilizada a metodologia descrita por Lewis & Stewart - Haynes (1992). Para a extração de DNA dos bulbos capilares optou-se pelo método usado no laboratório de genética veterinária da Universidade da Califórnia- Davis, modificada por Yves Amigues, INRA, Jouy-en-Josas.
As amostras de DNA extraídas foram amplificadas pela PCR em termociclo da marca MJ Research, modelo PTC 100TM. O mix para PCR foi preparado de modo a conter 10ml volume final para cada amostra, sendo 8ml de reagentes (50mM KCl; 10mM Tris HCl pH 8,3; 1,5mM MgCl2; 0,2mM dNTPs; 0,2mM de cada primer; 0,5U Taq DNA polimerase) e 2ml de DNA genômico. O programa de amplificação utilizado foi: 60s para desnaturação a 94ºC, 60s para anelamento a 54ºC para o microssatélite ETH131, 55ºC para os microssatélites BM2113 e RM88 e 56ºC para os microssatélites ILSTS005 e ILSTS008, 60s para extensão a 72ºC por 24 ciclos para o microssatélite ETH131 e 28 ciclos para os microssatélites BM2113, ILSTS005, ILSTS008 e RM88.
Os produtos das amplificações foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida a 8% a 100V por três ou quatro horas, dependendo do tamanho do microssatélite (BM2113, RM88 e ETH131 - três horas, ILSTS005 e ILSTS008 - quatro horas). Após a corrida eletroforética os géis foram corados pelo método do nitrato de prata para visualização das bandas de DNA. A análise dos fragmentos foi feita com auxílio do programa Total Lab, no aparelho VDS - Image System Pharmacia Biotechnics.
A análise dos dados foi feita com o emprego, sob licença, de programa (Programa desenvolvido para o Stormont Laboratories, Inc - Woodland - CA EUA) desenvolvido por Domenico Bernoco (Professor emérito de estatística e genética da UCDavis - CA - EUA.) em 1997. O programa estima a probabilidade de exclusão de falso parentesco (PE), o conteúdo de informação polimórfica (PIC), a heterozigosidade (Het), a probabilidade de exclusão de falso parentesco combinada para o conjunto de microssatélites (PEC) e o conteúdo de informação polimórfica combinado para o conjunto de microssatélites (PICC). O programa foi desenvolvido a partir dos trabalhos elaborados por Fisher (1951), Botstein et al. (1980), Jamieson (1994), Da & Lewin (1995), Fredholm & Wintero (1996) e Jamieson & Taylor (1997).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram observados sete diferentes alelos para o microssatélite BM2113, cujos tamanhos variaram entre 125 e 141 pares de bases (pb). Todos os alelos observados já haviam sido descritos anteriormente em bovinos de raças européias (Bishop et al., 1994; Peelman et al., 1998).
A análise com o microssatélite ILSTS005 revelou também sete diferentes alelos, com tamanhos que variaram entre 181 e 208 pares de bases. Com exceção dos fragmentos de 204 e 208pb, todos os demais já haviam sido identificados em estudos anteriores em Bos taurus taurus (Brezinsky et al., 1993; Bishop et al., 1994). O fragmento de 204pb foi observado em dois animais não aparentados e o de 208pb em seis (quatro irmãos completos e outros dois indivíduos não aparentados). Tais evidências deverão ser confirmadas em estudos posteriores, analisando-se maior número de indivíduos.
Utilizando o microssatélite ILSTS008 foram observados apenas três alelos, dos quatro já relatados em raças européias, com tamanhos de 175, 179 e 181pb, também coincidindo com alelos anteriormente descritos para bovinos por Kemp et al. (1993) e Bishop et al. (1994).
Com o microssatélite ETH131 foram observados 10 alelos, cujos tamanhos variaram entre 135 e 157pb, todos já observados anteriormente em raças taurinas.
O microssatélite RM88 também revelou 10 alelos, cujos tamanhos estão entre 118 e 149pb. O fragmento de 118pb só havia sido descrito antes em caprinos (Kossarek et al., 1995) e foi observado em apenas um animal, cujo exame foi repetido para confirmação do resultado. A confirmação da existência de tal alelo só poderá ser feita com a continuidade das pesquisas.
Os alelos observados na amostragem para os cinco microssatélites testados e suas freqüências observadas são mostrados na Tab. 1.
Partindo do número de alelos observados na amostragem para cada microssatélite testado utilizou-se o programa desenvolvido para estimar os valores da probabilidade de exclusão, conteúdo de informação polimórfica e heterozigosidade de cada microssatélite, e também para o conjunto dos cinco microssatélites. Os resultados são mostrados nas Tab. 2 e 3.
Segundo Mommens et al. (1998) um bom microssatélite é aquele que apresenta altos valores de PE e PIC, sendo satisfatórios os valores de PE maiores que 50%. Níveis reduzidos de polimorfismo ou fixação de alelos para alguns marcadores causam baixos valores de PE. Valores de PIC menores que 50% são considerados pouco informativos (Botstein et al., 1980; Da & Lewin, 1995). É preciso ressaltar que o valor de PE é dependente do número de alelos e da distribuição de freqüências desses alelos na população. Assim, conforme exposto na Tab. 2, os valores de PE e PIC observados neste estudo foram satisfatórios para os microssatélites BM2113, ILSTS005, ETH131 e RM88, indicando que eles podem ser utilizados em testes de verificação de parentesco na raça Gir. O mesmo não pode ser concluído para o microssatélite ILSTS008, cujos resultados não foram satisfatórios, obtendo-se valores menores que 50%.
A heterozigosidade estimada indica o número de heterozigotos na população. Segundo Nei & Takezaki (1996), a extensão de polimorfismos dos microssatélites é, geralmente, muito alta, estando em torno de 30 a 80% por loco. Os valores estimados para os microssatélites utilizados nesta avaliação coincidem com essa afirmativa, estando entre 45 e 85%. Isso os caracteriza como bons marcadores para compor o painel de microssatélites a ser empregado em testes de verificação de parentesco.
A probabilidade de exclusão combinada (PEC) indica a eficiência, na exclusão de falso parentesco, do conjunto de microssatélites utilizado. Do mesmo modo, o PIC combinado (PICC) indica o grau de polimorfismo do conjunto de microssatélites. Os valores estimados para a PEC1, PEC2 e PEC3 foram de 94,04 %; 99,03 % e 99,96 %, respectivamente, indicando que o conjunto é eficiente. O PICC estimado, de 99,10 %, indicou que o conjunto é bastante polimórfico, portanto, útil em verificações de parentesco na raça Gir. No entanto, a substituição do microssatélite ILSTS008 por outro, com PE e PIC mais elevados, acarretaria em maior precisão, elevando o valor estimado das PECs. A eficácia do teste de paternidade não depende apenas do número de marcadores genéticos utilizados, mas também do poder informativo que esses marcadores proporcionam. Desse modo, quanto mais informativos forem os microssatélites do conjunto, menor número deles será necessário para que se atinja a PEC de 99%, ou superior. Isso contribui para baratear o custo dos exames, pela diminuição de material e mão-de-obra necessários, podendo tornar o teste de verificação de parentesco por DNA mais acessível aos produtores.
Apesar da pequena amostragem estudada, os resultados indicaram a utilidade dos microssatélites testados em verificações de parentesco em bovinos da raça Gir, servindo como ponto de partida para pesquisas posteriores. Tais estudos devem ser conduzidos porque, segundo Curi (2000), no painel recomendado para bovinos pela ISAG (International Society for Animal Genetics), e padronizado a partir de raças européias, estão alguns microssatélites cujo grau de polimorfismo é muito baixo em zebuínos como o Gir. Assim, novas amostras estão sendo colhidas em mais rebanhos da raça, afim de possibilitar a continuidade das pesquisas.
CONCLUSÕES
Excetuando o ILSTS008, os microssatélites BM2113, ILSTS005, ETH131 e RM88 mostraram-se eficazes em teste de verificação de parentesco para a raça Gir, mostrando-se bastante polimórficos e, conseqüentemente, apresentando valores de PEs satisfatórios. Os valores estimados para as PECs indicaram que o conjunto de microssatélites é eficiente, mesmo incluindo o ILSTS008. Para os microssatélites ILSTS005 e RM88 observou-se, ainda, prováveis novos alelos na raça Gir.
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Datas de Publicação
-
Publicação nesta coleção
16 Dez 2002 -
Data do Fascículo
Jun 2002
Histórico
-
Recebido
10 Maio 2002