Produção de biocompostos com atividade antimicrobiana de Streptomyces sp. ante isolados de mastite caprina

Production of biocompounds with antimicrobial activity of Streptomyces sp. Isolated in face of goat mastitis

MEDICINA VETERINÁRIA

Produção de biocompostos com atividade antimicrobiana de Streptomyces sp. ante isolados de mastite caprina

Production of biocompounds with antimicrobial activity of Streptomyces sp. Isolated in face of goat mastitis

T. Pajeú Nascimento^I; C.S. Porto^I; M.F.S. Teixeira^II; T.S. Porto^III; A.L.F. Porto^I,*

^IUniversidade Federal Rural de Pernambuco - Recife, PE

^IIUniversidade Federal do Amazonas - Coroado Manaus, AM

^IIIUnidade Acadêmica de Garanhuns - Universidade Federal Rural de Pernambuco - Garanhuns, PE

RESUMO

Actinomicetos são um dos principais produtores de enzimas, vitaminas e metabólitos secundários, destacando-se o gênero Streptomyces, o qual tem uma ampla capacidade de produção de antibióticos eficazes no combate a diferentes microrganismos, entre eles o Staphylococcus sp. Em virtude dessa eficiência no combate a patógenos, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de metabólitos com atividade antimicrobiana produzidos por 67 Streptomyces isolados de liquens da região amazônica, ante isolados de mastite caprina (Staphylococcus aureus) do estado de Pernambuco, Brasil. Foi utilizado um planejamento fatorial para avaliar a influência das fontes de carbono (glicose) 0%, 0,5% e 1% e de nitrogênio (farinha de soja) 1%, 2,5% e 4% na produção dos antimicrobianos, bem como das variáveis pH, biomassa e atividade antimicrobiana. Dos Streptomyces estudados, o DPUA 1566 foi o que se destacou por formação de halos de inibição entre 18 e 26mm ante os isolados de mastite caprina. Foi possível verificar que a fonte de carbono inibiu a produção de antimicrobianos quando submetidos a uma concentração de glicose de 1%; com a retirada desta, os Streptomyces apresentaram uma elevada capacidade de produção de metabólitos com atividade antimicrobiana tendo potencial para o tratamento de mastite caprina.

Palavras-chave: cabra, actinomicetos, Staphylococcus aureus, mastite

ABSTRACT

Actinomycetes are a leading producer of enzymes, vitamins and secondary metabolites, especially the genus Streptomyces, which have a large capacity for the production of natural antibiotics and are effective against various micro-organisms including Staphylococcus sp. Due to this efficiency in combating micro-organisms, the aim of this study was to evaluate the production of metabolites with antimicrobial activity produced by Streptomyces isolated from lichens 67 in the Amazonia, compared to isolates from goat mastitis (Staphylococcus aureus) in the state of Pernambuco, Brazil. We used a complete factorial design to evaluate the influence of concentrations of carbon sources (glucose) at 0%, 0.5% and 1% and nitrogen (soybean flour) at 1%, 2.5% and 4% in the production of antimicrobial metabolites, and the influence of the pH, microbial biomass and activity variables. Of the studied Streptomyces DPUA 1566 what stood out was the formation of inhibition halos between 18 to 26 mm compared to the isolates from goats mastitis. It was noted that the carbon source inhibited the production of antimicrobial metabolites when subjected to a glucose concentration of 1%. However, after the discontinuation, Streptomyces showed a high capacity to produce metabolites with antimicrobial activity, which has an excellent potential for the treatment of mastitis in goats.

Keywords: goat, Actinomycetes, Staphylococcus aureus, mastitis

INTRODUÇÃO

O Streptomyces é o principal gênero utilizado para a produção de antibióticos.O número de compostos antimicrobianos declarados oriundos de espécies desse gênero por ano aumentou quase exponencialmente em cerca de três décadas, demonstrando, assim, que esse grupo de microrganismos permanece sendo uma fonte promissora para a produção de novos agentes antimicrobianos. Devido a sua alta capacidade de produzir uma grande variedade de metabólitos (antibióticos, vitaminas e enzimas), os Streptomyces e outros actinomicetos são responsáveis por cerca de três quartos de todos os produtos conhecidos (Vijayakumar et al., 2011; Gama et al., 2012; Pacheco da Rosa et al., 2013).

O desenvolvimento de fármacos eficientes no combate a infecções bacterianas revolucionou o tratamento médico, ocasionando a redução drástica da mortalidade causada por doenças microbianas (Rang et al., 2003; Silveira et al., 2006). Entretanto, o uso inadequado e excessivo desses antimicrobianos leva ao desenvolvimento de microrganismos resistentes, tornando-se uma ameaça para a saúde pública.

Acredita-se que uma grande parte da virulência do S. aureus se deve à atuação das exotoxinas, enterotoxinas e enterotoxinas como proteínas, além de essa infecção induzir a ativação aberrante das células T, suprimindo a resposta imune (Foster, 2005; Park et al., 2006; Mork et al., 2010).

Muitas infecções hospitalares, comunitárias e intoxicações são causadas principalmente por bactérias do gênero Staphylococcus, além de algumas doenças de importância veterinária, como a mastite. É a principal doença contagiosa em diversos rebanhos, como caprinos e bovinos, a qual constitui uma inflamação da glândula mamária, que aumenta a contagem de células somáticas (CSS) e diminui a produção e a qualidade do leite (Peixoto et al., 2013). A mastite é a principal doença dos rebanhos leiteiros no mundo inteiro, causando prejuízos econômicos tanto aos pequenos produtores de leite quanto à indústria de lacticínios, afetando toda a cadeia produtiva (Tozzeti et al., 2008; Mota et al., 2012).

A mastite pode reduzir a quantidade e a qualidade do leite produzido; o seu agravamento pode levar à perda total da capacidade secretora da glândula mamária (Ribeiro et al., 2003), somando-se a isso prejuízos ocasionados com gastos com medicamentos e assistência veterinária, inutilização de leite contaminado após tratamento, descarte precoce de animais doentes, o que pode prejudicar a cultura desses animais (Freitas et al., 2005; Cunha et al., 2006). A mastite clínica caprina é causada por S. coagulase positiva (S. aureus), e a mastite subclínica, sobretudo, por S. coagulase negativa (SCN), sendo os principais SCN: S. epidermidis, S. chromogenes e S. simulans, S. caprae e S. agalactiae (Contreras et al., 2003 e Neves et al., 2010). A literatura evidencia que o S. aureus é o maior causador de mastite em ruminantes incluindo cabras leiteiras, acarretando casos mais severos de mastite (Taponen e Pyorala, 2009; França et al., 2012).

Em face da necessidade de desenvolvimento de agentes antimicrobianos eficientes ante agentes patogênicos resistentes, o presente trabalho tem como objetivo selecionar um Streptomyces isolado de liquens da região amazônica, produtor de biocompostos com atividade antimicrobiana, ante isolados de mastite caprina do estado de Pernambuco.

MATERIAL E MÉTODOS

As amostras de Streptomyces foram isoladas de liquens da região amazônica, pertencentes à coleção de culturas DPUA (Departamento de Parasitologia da Universidade Federal do Amazonas), totalizando 67 isolados. Os isolados foram mantidos no meio ISP-2 (Pridham et al., 1957), semeados em placas de Petri incubadas a 30ºC por 168 horas e preservados pelo método de Castellani (Castellani, 1939). Para a esporulação, foi utilizado meio ISP-2 modificado pela retirada de glicose.

Os microrganismos teste foram Staphylococcus aureus isolados de mastite caprina pertencente a rebanhos de fazendas da região agreste do estado de Pernambuco-Brasil. O ágar nutriente (AN) foi utilizado como o meio de manutenção, e os microrganismos foram preservados como cultura estoque em criotubos utilizando-se glicerol 10% (v/v), mantidos a -20ºC.

A produção de metabólitos foi estimada por meio da técnica de bloco de gelose (Brown et al., 1976), utilizando-se Staphylococcus aureus como microrganismo teste. Foi usado o meio de cultura ágar Müeller Hinton em placas de Petri (90x15mm de diâmetro). A superfície foi semeada em uma suspensão das células de S. aureus crescido previamente em TSB (Tryptic Soy Broth) por 24 horas, na concentração de 10⁸ UFC/mL.

Em cada placa teste foram sobrepostos fragmentos de 6mm, retirados da área central das culturas dos actinomicetos crescidos em meio ISP-2 sólido, que foi modificado pela retirada da glicose a 30ºC por 168 horas, e incubados por 24 horas a 37ºC. A produção de biocompostos com atividade antimicrobiana foi verificada pela formação de halos claros de inibição do crescimento microbiano e expressos em milímetros (mm). O efeito inibitório ante os microrganismos testados foi classificado de acordo com Sahin e Ugur (2003), sendo o tamanho da zona de inibição dividido em quatro grupos distintos: grupo passivo - zona de inibição menor que 10mm; grupo ligeiramente ativo - zona de inibição entre 11 e 20mm; grupo moderadamente ativo - zona de inibição entre 21 e 30 mm; e grupo altamente ativo, cuja zona de inibição é maior que 31mm.

Para a produção de metabólitos com atividade antimicrobiana pelo actinomiceto selecionado, foi utilizado o meio MS-2 (Porto et al., 1996); para a produção dos metabólitos com atividade antimicrobiana, este foi composto por: 2,0% (p/v) de farinha de soja, 0,06% (p/v) de MgSO₄.7H₂O, 0,1% (p/v) deNH₄Cl, 0,435% (p/v) de K₂HPO₄ e 0,1mL de solução mineral (100mg de FeSO₄, MnCl₂. 4H₂O, ZnSO₄, CaCl₂. H₂O em 100mL de água destilada, com pH inicial 7,0) modificado pela retirada da glicose.

Foram utilizados Erlenmeyers (250mL) contendo 60mL de meio de cultura, o inóculo de 10⁸UFC/mL foi incubado em agitador orbital (200rpm) a 28ºC. O crescimento celular, a curva de pH e a determinação da atividade antimicrobiana foram determinados após 24, 48, 72, 96 e 120 horas de fermentação.

A atividade antimicrobiana foi estimada empregando-se o método da difusão em disco descrito por Ericsson e Sherris (1971) utilizando-se S. aureus, isolado de mastite caprina do estado de Pernambuco. Os sobrenadantes aliquotados a cada 24h durante a fermentação em MS-2 do isolado de Streptomyces sp. DPUA 1566 previamente selecionado foram utilizados para impregnar os discos de papel-filtro (com 5mm) e aplicados na superfície da placa teste (24h a 37ºC).

Os ensaios foram realizados como recomendado pelas normas da NCCLS (National..., 2003), com o meio de cultura ágar Müeller Hinton, onde foi inoculada, com auxílio de um swab estéril, uma suspensão dos microrganismos teste (10⁸UFC/mL) crescidos em TSB por 24 horas. A atividade antimicrobiana foi detectada pela presença de zonas de inibição expressa em milímetros, considerando-se os valores médios das duas repetições.

Os estudos de produção foram realizados com um auxílio de um planejamento fatorial 22 com quatro pontos centrais, avaliando-se as concentrações de fontes de nitrogênio e de carbono (Tab. 1). As variáveis respostas foram crescimento da biomassa, pH e atividade antimicrobian. Todos os resultados foram analisados com auxílio do software Statistica 8.0 (Statsoft Inc, 2008).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram analisados 67 isolados de Streptomyces para produção de metabólitos com atividade antimicrobiana, dos quais 10 apresentaram produção de biocompostos com atividade antimicrobian ante os S. aureus isolados de mastite caprina, correspondendo a aproximadamente 17% do total de isolados. As atividades foram verificadas com a presença de halos de inibição, os quais variaram de 10 a 26mm.

O espectro de ação das biomoléculas obtidas a partir de Streptomyces ante os isolados de mastite caprina apresentou perfil de inibição semelhante às atividades antimicrobianas dos Streptomyces, sendo estas classificadas em diversos grupos, de acordo com a Tab. 2.

Resultados obtidos por Sahin e Ugur (2003) corroboram os resultados relatados neste estudo, em que classificaram o Streptomyces isolates como moderadamente ativo ante os Staphylococcus xylosus (MU29), S. epidermidis (MU30), S. aureus (ATCC6538/P) e S. aureus (MU38), os quais formaram zonas de inibição maiores que 20mm. Mitra et al. (2011), ao estudarem 11 actinomicetos isolados de solo de estuário da ilha de Sagar, Índia, obtiveram, assim como os resultados apresentados neste trabalho, uma atividade antimicrobiana ante os S. aureus (MTCC 96) de 11 a 23mm de zona de inibição, confirmando os resultados encontrados na literatura.

Entre os actinomicetos estudados, o que apresentou melhor atividade antimicrobiana após 24 horas foi o Streptomyces sp. DPUA 1566, o qual obteve halos de inibição de 26mm ante os isolados de mastite caprina. O tamanho do halo de inibição de 26mm, obtido (DPUA 1566) encontra-se dentro dos padrões já descritos pela literatura. Al-Zahrani (2007) e colaboradores estudaram Streptomyces sp., isolado de Jazan (J12) ante os S. aureus e Bacillus subtilis, e obtiveram halos de inibição de 26mm e 25mm.

Os metabólitos secundários, como, por exemplo, os antibióticos, são sintetizados por várias vias metabólicas e também por espécies geneticamente distintas, sendo sua produção afetada por diferentes condições ambientais.

Parâmetros da fermentação, tais como: tempo, temperatura, pH e nutrientes, podem ser modificados visando ampliar a quantidade dos metabólitos secundários produzidos (Pfefferle et al., 2000). Em virtude desses parâmetros, foram estudados os componentes do meio de cultivo, ou seja, foram modificadas as concentrações da fonte de carbono (glicose) e da fonte de nitrogênio (farinha de soja) na produção de antibiótico por Streptomyces sp. DPUA 1566, sendo utilizado um planejamento fatorial completo para avaliação da influência desses componentes na produção do metabólito antimicrobiano (Tab. 1).

Foram observadas a fase característica de crescimento microbiano do Streptomyces DPUA 1566 em meio MS-2, a fase lag de 24 horas, ou seja, o período de adaptação do microrganismo ao meio de cultura, a fase exponencial característica com crescimento microbiano máximo em 72 horas e, em seguida, a fase estacionária e a de declínio com 120 horas de fermentação (Fig. 1).

Apenas foi detectada atividade antimicrobiana no tempo 72 horas, ou seja, no final da fase exponencial e início da estacionária. Estes resultados estão de acordo com os descritos pela literatura. Yu et al. (1999) descreveram que a produção de metabólitos secundários pelos actinomicetos em meio líquido é limitada à fase estacionária, que frequentemente coincide com a escassez dos nutrientes do meio de cultura.

O pH do meio, que inicialmente foi 7,0, elevou-se a 8,0 no final da fermentação, o que corrobora os resultados apresentados por Carneiro da Cunha et al. (2010), que, ao utilizarem Nocardia sp. DPUA 1571, também em meio MS-2, tiveram o pH do meio de cultivo também aumentado de 7,0 para 8,5 ao final da fermentação.

O conteúdo proteico era elevado no início da fermentação, devido ao filtrado de farinha de soja, que é rico em proteínas, porém ocorreu uma diminuição das proteínas totais inicialmente, em razão da utilização dela pelo actinomiceto. Em seguida, foi observado um pequeno aumento no seu valor, possivelmente devido à produção de outros metabólitos microbianos de origem proteica.

Pode-se verificar que os ensaios fermentativos 3 e 4 (Tab. 3) não apresentaram atividade antimicrobiana e ambos possuem como característica comum a concentração de glicose 1%. Esse comportamento foi confirmado por meio da análise estatística dos dados, a qual apresentou como única variável significativa a concentração de glicose, que apresentou um efeito negativo. Isso significa que o maior nível dessa variável foi prejudicial à produção de metabólitos antimicrobianos.

Sanchez e Demain (2002) afirmaram que, apesar de as fontes de carbono, como a glicose, serem comumente utilizadas para o melhor crescimento para produção de enzimas, antibióticos e outros metabólitos secundários, essa produção é frequentemente limitada devido à presença de um mecanismo regulador denominado de regulação do carbono catabólito (RCC). Este cataboliza rapidamente o suprimento de carbono e energia para o crescimento do microrganismo, reprimindo e esgotando o substrato primário, o que, consequentemente, prejudica a produção de enzimas e metabólitos secundários pelo microrganismo.

A Tab. 4 apresenta os efeitos estimados das variáveis e das interações entre elas (concentração de soja e concentração de glicose) sobre as respostas (atividade antimicrobiana, biomassa e pH). Os valores com asterisco foram os efeitos estatisticamente significativos, com nível de confiança de 95%. Fenômeno semelhante ao da atividade antimicrobiana ocorreu para o pH, ou seja, a concentração de glicose influenciou negativamente o pH, apresentando efeito significativo e negativo. Quando a concentração de glicose foi 1%, o pH do meio fermentado se acidificou (pH 5,0), enquanto no meio sem adição de glicose o pH ficou alcalino (pH 8,0). Esse comportamento pode ser explicado pela utilização da glicose pelos Streptomyces para produção de ácidos pela via glicolítica, segundo Dekleva e Strohl (1987).

Análise semelhante foi realizada para a resposta biomassa e verificou-se que também apenas a concentração de glicose apresentou efeito significativo, porém esse efeito foi positivo (Tab. 3), ou seja, a adição de glicose 1% ao meio de cultivo favoreceu o crescimento da biomassa. Tal resultado difere dos estudos realizados por outros autores, como Moreira et al. (2001), que, ao utilizarem o mesmo meio de cultura MS-2 no crescimento de Streptomyces clavuligerus, sem, entretanto, adicionar 1% de glicose ao meio de cultura, obtiveram um decaimento da biomassa após 50 horas de crescimento, o que ressalta a influência da glicose no aumento da biomassa.

CONCLUSÕES

Estes resultados permitem concluir que o Streptomyces sp. DPUA 1566 foi capaz de produzir biocompostos com atividade antimicrobiana capaz de inibir o crescimento de cepas patogênicas de Staphylococcus aureus isolados de caprinos portadores de mastite. A fonte de carbono (glicose) apresentou efeito

negativo na fermentação do actinomiceto para a produção de metabólitos com atividade antimicrobiana, sendo sua ausência essencial para o desenvolvimento do biocomposto.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao auxílio financeiro concedido pelo PNPD/Capes e pelo CNPq.

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Recebido em 5 de julho de 2012

Aceito em 8 de maio de 2013

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Mar 2014
• Data do Fascículo
  Fev 2014

Histórico

• Recebido
  05 Jul 2012
• Aceito
  08 Maio 2013