Estudo morfométrico do efeito do tenoxicam com água bidestilada ou com cloreto de sódio a 0,9% no endotélio venoso, em coelhos

Morphometric study on the effect of tenoxicam with bidistilled water or with 0.9% sodium chloride in the venous endothelium, in rabbits

7 – ARTIGO ORIGINAL

ESTUDO MORFOMÉTRICO DO EFEITO DO TENOXICAM COM ÁGUA BIDESTILADA OU COM CLORETO DE SÓDIO A 0,9% NO ENDOTÉLIO VENOSO, EM COELHOS¹

Taylor Brandão Schnaider²

Alcino Lázaro da Silva³

Miriam de Fátima Brasil Engelman⁴

Yara Juliano⁵

Neil Ferreira Novo⁶

Gabrielle Sormanti Schnaider⁷

Caroline Sormanti Schnaider⁸

Schnaider TB, Silva AL, Engelman MFB, Juliano Y, Novo NF, Schnaider GS, Schnaider CS. Estudo morfométrico do efeito do tenoxicam com água bidestilada ou com cloreto de sódio a 0,9% no endotélio venoso, em coelhos. Acta Cir Bras [serial online] 2002 Mar-Abr;17(2). Disponível em URL: http://www.scielo.br/acb.

RESUMO:Objetivo: Avaliar, pela morfometria, se o tenoxicam com água bidestilada (diluente) ou com cloreto de sódio a 0,9% (NaCl 0,9%) provoca alterações no endotélio venoso. Métodos: Foram utilizados 90 coelhos (Oryctolagus cuniculus), brancos, da linhagem Nova Zelândia, machos, com idade acima de 10 semanas, com peso variando entre 2000 e 3500 gramas, divididos em dois grupos denominados Experimento e Controle, que foram observados nos tempos de 6h, 12h e 24h. Administrou-se nas venae auriculares dextra e sinistra, tenoxicam com seu diluente ou com NaCl 0,9% no grupo Experimento e NaCl 0,9% no grupo Controle. Para análise estatística dos resultados foi aplicada a análise de variância a um critério: a) em separado para cada grupo (Tenoxicam/NaCl 0,9%, Tenoxicam/Diluente e NaCl 0,9%), para comparar as medidas médias dos diâmetros dos núcleos das células endoteliais obtidas nos períodos de observação de 6h, 12h e 24h. Resultados: Observou-se que não ocorreram diferenças significantes entre as medidas médias dos diâmetros nucleares encontradas nos períodos de eutanásia de 6, 12 e 24h, em separado para cada grupo. As medidas médias dos diâmetros nucleares do grupo Controle foram significantemente maiores do que as observadas no grupo Experimento. Conclusão: O tenoxicam, com água bidestilada ou com cloreto de sódio a 0,9%, reduziu os diâmetros dos núcleos das células endoteliais nas venae em que foi injetado.

DESCRITORES: Endotélio. Antiinflamatórios não-esteróides. Coelhos.

INTRODUÇÃO

Em virtude de, na nossa clínica anestesiológica, terem sido encontrados pacientes que relataram sinais e sintomas de vasculite (dor, calor e rubor), após administração endovenosa direta do tenoxicam com água bidestilada (seu diluente comercial), pesquisamos e, na literatura consultada, verificamos a inexistência de estudos relativos a essa ocorrência em seres humanos.

Na seqüência patológica da enteropatia induzida por indometacina em ratos, a infiltração de neutrófilos é precedida por diminuição das vilosidades, possivelmente resultante da contração do músculo liso e alterações microvasculares (ANTHONY et al.¹; NYGARD et al.²). A lesão microvascular observada inclui aumento de volume celular e picnose do endotélio viloso, com deposição de fibrina intravascular e perivascular, em adição à aderência plaquetária (TARNAWSKI et al.³; ANTHONY et al.¹; NYGARD et al.²). Os possíveis mecanismos que podem explicar essa agressão, incluem um efeito lesivo direto dos antiinflamatórios não-esteróides no endotélio, assim como um dano das células endoteliais indiretamente induzido por endotoxina, após um aumento da permeabilidade da mucosa às bactérias, ou à combinação de ambos (NYGARD et al.⁴).

SCHNAIDER et al.⁵, em estudos experimentais realizados nas venae auriculares caudales de coelhos (Oryctolagus cuniculus), observaram que as médias das medidas dos diâmetros nucleares após administração do tenoxicam com seu diluente comercial foram menores do que as encontradas após a injeção de cloreto de sódio a 0,9%, nos tempos de 6h, 12h e 24h.

O objetivo desta pesquisa foi avaliar, pela morfometria, se o tenoxicam com água bidestilada ou com NaCl 0,9% provoca alterações no endotélio venoso de coelhos.

MÉTODOS

Após aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal, 90 coelhos (Oryctolagus cuniculus), brancos, da linhagem Nova Zelândia, machos, com idade acima de 10 semanas, com peso variando entre 2000 e 3500 gramas, foram distribuídos aleatoriamente em 2 grupos: Experimento e Controle. O grupo Experimento foi subdividido em 3 subgrupos de 24 coelhos cada um, denominados subgrupos E6, E12 e E24, que corresponderam respectivamente aos períodos de observação de 6h, 12h e 24h, tendo sido administrados aleatoriamente, nas venae auriculares caudales dextra ou sinistra de cada animal, tenoxicam/diluente ou tenoxicam/NaCl 0,9%. O grupo Controle foi subdividido também em 3 subgrupos de 6 coelhos cada um, denominados subgrupos C6, C12 e C24, que corresponderam respectivamente aos períodos de observação de 6h, 12h e 24h, tendo sido administrado NaCl 0,9% nas venae auriculares caudales dextra e sinistra de cada animal.

Os animais não sofreram quaisquer restrições com relação à ingestão de alimentos e água até o momento do experimento, sendo então pesados e anestesiados com maleato de acepromazina a 1% na dose de 2 miligramas por quilograma (mg/kg), cloridrato de cetamina na dose de 35 mg/kg e cloridrato de xilazina a 2% na dose de 5 mg/kg, por via intramuscular na regio glutaea.

Passados 10 minutos, após administracão da anestesia, cada animal foi posicionado em decúbito dorsalis sobre a mesa operatória onde os membri thoracica e pelvina foram contidos com barbantes às extremidades da mesa.

Transcorridos 15 minutos, foi testado o plano anestésico, pesquisando-se o reflexo da resposta do membrum pelvinum dextri ao estímulo doloroso na plicaturae cutis entre os digiti II e III.

Em seguida, foi realizada a anti-sepsia com álcool a 70% e colocados os campos operatórios esterilizados. Foram puncionadas as venae auriculares caudales dextra e sinistra com borboleta 27G. Foram injetados, aleatoriamente, tenoxicam/diluente ou tenoxicam/NaCl 0,9% no grupo Experimento e NaCl 0,9% no grupo Controle (Fig. 1). A seguir, foram demarcados os locais de punção com caneta Texta fine line 700. Os 2 mililitros (ml) das substâncias foram acondicionados previamente em seringas de 3 ml e injetados na velocidade de 1 ml por 30 segundos.

Transcorrido o tempo de evolução programado para cada subgrupo (6h, 12h ou 24h), os animais foram novamente anestesiados, pela mesma técnica utilizada no início do experimento e submetidos à eutanásia, com injeção intracardíaca de 3 ml de cloreto de potássio a 10%. A seguir, foi feito um corte triangular na parte rostral das auriculae e colocado um ponto, com fio de algodão 000, na parte distal da auricula dextra. Procedeu-se, então, a exerese das auriculae em sua base, as quais foram fixadas em formol a 10% tamponado, após observação macroscópica das mesmas (Fig. 2). Os recipientes contendo as peças cirúrgicas foram identificados com o grupo, subgrupo e o número do respectivo animal. No Serviço de Anatomia Patológica da Pós-Graduação da Faculdade de Medicina de Pouso Alegre, as peças foram incluídas em parafina, sendo realizados 5 cortes com 5 micrômetros de espessura cada, a partir de 1 cm do local em que foi realizada a punção, em direção à parte proximal da auricula, utilizando-se micrótomo rotativo com navalha descartável. A seguir, os cortes foram colocados nas lâminas, corados por Hematoxilina-Eosina (H-E) e cobertos pelas lamínulas. As lâminas foram analisadas ao microscópio óptico (Lambda LQT-2) com aumentos originais de 40, 100 e 400 vezes, digitalizadas (Câmera Samsung SHC-410 NAD) e gravadas em disquetes de 3 ½ polegadas.

As medidas nucleares foram obtidas medindo-se, em milímetros, seu maior diâmetro transversal, com aumento original de 400 vezes, sendo utilizado o programa computacional de análise de imagem Corel DRAW 9, por um examinador que desconhecia qual fármaco havia sido administrado.

Para análise estatística dos resultados foi realizada a análise de variância a um critério (SOKAL e ROHLF⁶), com a finalidade de comparar: a) em separado para cada grupo, os períodos de eutanásia de 6h, 12h e 24h, quanto aos valores das medidas médias dos diâmetros nucleares, calculados a partir de 5 núcleos por veia estudada; b) os grupos Tenoxicam/NaCl 0,9%, Tenoxicam/Diluente e NaCl 0,9%, em relação às medidas médias dos diâmetros nucleares, independente do período da eutanásia; quando ocorreu diferença significante, esta análise foi complementada pelo teste de contrastes de TUKEY (SOKAL e ROHLF⁶). Em todos os testes fixou-se em 0,05 ou 5% (a £ 0,05) o nível para a rejeição da hipótese de nulidade, assinalando-se com um asterisco (*) e em negrito os valores significantes.

RESULTADOS

Com o intuito de comparar as medidas médias, em milímetros, dos diâmetros dos núcleos das células endoteliais, foi realizada a análise de variância a um critério, em duas fases:

a) em separado para cada grupo (Tenoxicam/NaCl 0,9%, Tenoxicam/Diluente e Cloreto de Sódio a 0,9%), para comparar as medidas médias obtidas nos períodos de eutanásia de 6h, 12h e 24h, não se observando diferenças significantes entre as mesmas;

b) independente do período de eutanásia (6h, 12h e 24h), para comparar as medidas médias obtidas, nos grupos Tenoxicam/NaCl 0,9%, Tenoxicam/Diluente e Cloreto de Sódio a 0,9%, tendo sido complementada esta análise pelo teste de contrastes de Tukey. Constatou-se que as medidas médias dos diâmetros nucleares do grupo Cloreto de Sódio a 0,9% foram significantemente maiores do que as observadas nos grupos Tenoxicam/NaCl 0,9% e Tenoxicam/Diluente.

Estes resultados podem ser observados na Tabela 1, expressos nas Figs. 3 e 4 e ilustrados na Fig. 5.

Análise de variância

(6h x 12h x 24h)

F_crítico = 3,32

frm01

Análise de variância

[Tenoxicam/NaCl 0,9% x Tenoxicam/Diluente x Cloreto de Sódio a 0,9%, para (6h+12h+24h)]

F_calculado = 17,54* (p<0,001) F_crítico = 3,15

Teste de contrastes de Tukey

Cloreto de Sódio a 0,9% > Tenoxicam/NaCl 0,9% e Tenoxicam/Diluente

DISCUSSÃO

JUNQUEIRA e CARNEIRO⁷ citam que, como freqüentemente é difícil perceber ao microscópio de luz comum, a forma das células animais, a do núcleo é muito usada para dar uma idéia da forma celular. Por essas razões, neste estudo mediu-se apenas o núcleo.

Os agentes lesivos, ao agirem sobre as células, causam lesões reversíveis ou morte celular, as quais dependem da natureza do agente agressor e da intensidade e duração da agressão. Se a morte celular ocorre no organismo vivo e é seguida de autólise, o processo recebe o nome de necrose e, quando este tecido que sofreu necrose tem capacidade regenerativa, os restos celulares são reabsorvidos e fatores de crescimento são liberados pelas células vizinhas, induzindo multiplicação das células parenquimatosas. Diferentemente da necrose, se a célula é fragmentada e seus fragmentos são endocitados por células vizinhas, sem desencadear quimiotatismo nem ativação de células fagocitárias, o processo recebe o nome de apoptose (PEREIRA⁸).

A multiplicação mitótica para o crescimento e renovação dos tecidos é um processo de significado fisiológico evidente. Este fenômeno só não é observado com os neurônios e as células da musculatura esquelética e cardíaca. As células endoteliais dos vasos sangüíneos normalmente não se dividem, mas podem faze-lo em resposta a estímulos (JUNQUEIRA e CARNEIRO⁹).

As células endoteliais vasculares são capazes de sintetizar e secretar vários mitógenos, um dos quais é um tipo de fator de crescimento derivado de plaquetas (ROSS¹⁰; RANG et al.¹¹).

Nas células animais que estão em proliferação, os fatores de crescimento agem, na interfase, fundamentalmente controlando a progressão de G₁ a S, impulsionando-as a atravessar o ponto de restrição no final de G₁, chamado ponto R, e a continuar, então, o ciclo de divisão celular. No período G₁, fase mais variável em duração da interfase, as células apresentam intensa atividade de síntese de ácido ribonucléico (RNA) e de proteínas, acarretando um marcante aumento do citoplasma das células. No período S ocorre a síntese de ácido desoxirribonucléico (DNA) e, na grande maioria dos casos, é o ponto de não retorno do ciclo, levando necessariamente à divisão celular, ocorrendo simultaneamente a produção de estonas, as únicas proteínas cuja síntese está confinada a este período. No período G₂ ocorre discreta síntese de RNA e de proteínas que são essenciais para a mitose e também ocorre o acúmulo de um complexo protéico citoplasmático denominado fator promotor de maturação (MPF), considerado o regulador geral da transição de G₂ para M, induzindo a entrada em mitose e sendo responsável por quatro eventos típicos desse período: condensação cromossômica, ruptura do envoltório nuclear, montagem do fuso e degradação da proteína ciclina. A mitose é subdividida em quatro etapas: prófase, metáfase, anáfase e telófase, sendo que na metáfase os cromossomos atingem o estado de condensação máxima e, portanto, é o momento em que as duas cromátides se tornam realmente visíveis à microscopia óptica (JUNQUEIRA e CARNEIRO⁷).

As células morrem não só como resultado de lesões, mas principalmente por um processo fisiológico normal, conhecido como apoptose, a morte celular programada. Por esse meio, durante a morfogênese, o organismo controla e mantém constante o número de células dos tecidos e dos órgãos, livra-se de células danificadas e elimina células indesejáveis e não permanentes dos tecidos em desenvolvimento (JUNQUEIRA e CARNEIRO⁹).

Na apoptose, a célula e seu núcleo se tornam compactos, diminuindo de tamanho. Nesta fase, a célula apoptótica é facilmente identificada na microscopia óptica de luz, porque apresenta o núcleo com a cromatina muito condensada e corando-se fortemente (núcleo picnótico). Em seguida, a cromatina é cortada em pedaços por endonucleases do DNA, envoltos pela membrana nuclear. A própria célula se contrai e se fragmenta, estando os fragmentos recobertos por membrana plasmática modificada e denominados corpos apoptóticos. Todo o processo é mediado por vias intracelulares complexas, exigindo a produção de proteínas a partir do material gênico. Os corpos apoptóticos são fagocitados pelos macrófagos. É estimado que o processo dure cerca de 2 horas, desde as primeiras mudanças estruturais até a ingestão pelos fagócitos. Esses corpos apoptóticos não induzem os macrófagos a produzir as moléculas sinalizadoras que desencadeiam a resposta inflamatória nos tecidos vizinhos (JUNQUEIRA e CARNEIRO⁷; SPENCER NETTO e FERRAZ¹²).

TARNAWSKI et al.³, ANTHONY et al.¹ e NYGARD et al.², em estudos em ratos, observaram lesão microvascular provocada pela indometacina, incluindo aumento de volume celular e picnose no endotélio viloso.

SCHNAIDER et al.⁵, em estudos realizados nas venae auriculares de coelhos (Oryctolagus cuniculus), observaram que as médias das medidas dos diâmetros nucleares após administração do tenoxicam com seu diluente comercial foram menores do que as encontradas após a injeção de cloreto de sódio a 0,9%, nos tempos de 6h, 12h e 24h.

A redução do diâmetro nuclear sugere provável lesão do endotélio venoso e conseqüente morte celular, provocada pelo antiinflamatório não-esteróide. Devido ao pH alcalino das soluções, tenoxicam com água bidestilada (8,49) e tenoxicam com cloreto de sódio a 0,9% (8,40), supõe-se que o fármaco, independente do veículo utilizado, penetraria na membrana da célula endotelial provavelmente auxiliado por uma proteína transmembrana, induzindo alterações celulares, com diminuição das medidas dos diâmetros nucleares. Somente pelo estudo morfométrico, não se pode afirmar se o decréscimo destas medidas foi decorrente do processo denominado ciclo de divisão celular ou do conhecido como apoptose, resultante das lesões causadas.

Na presente experiência, constatou-se que: a) não ocorreram diferenças significantes entre as medidas médias dos diâmetros nucleares encontradas nos períodos de eutanásia de 6h, 12h e 24h, em separado para cada grupo (Tenoxicam/Diluente, Tenoxicam/NaCl 0,9% e Cloreto de Sódio a 0,9%); b) as medidas médias dos diâmetros nucleares do grupo Controle em que foi injetado cloreto de sódio a 0,9% foram significantemente maiores do que as observadas no grupo Experimento, tanto após a administração do tenoxicam com seu diluente comercial quanto após a administração do tenoxicam com cloreto de sódio a 0,9%. Estes resultados podem ser observados na Tabela 1.

CONCLUSÃO

O tenoxicam, com água bidestilada ou com cloreto de sódio a 0,9%, reduziu os diâmetros dos núcleos das células endoteliais nas venae em que foi injetado.

REFERÊNCIAS

Schnaider TB, Silva AL, Engelman MFB, Juliano Y, Novo NF, Schnaider GS, Schnaider CS. Morphometric study on the effect of tenoxicam with bidistilled water or with 0.9% sodium chloride in the venous endothelium, in rabbits. Acta Cir Bras [serial online] 2002 Mar-Apr;17(2). Available from URL: http://www.scielo.br/acb.

ABSTRACT: Objective: Evaluate by morphometry, if tenoxicam with bidistilled water (diluent) or 0.9% sodium chloride, causes venous endothelium alterations. Methods: 90 white male rabbits of the New Zealand branch (Oryctolagus cuniculus) with age over 10 weeks, weight varying between 2000 and 3500 grams were used. The rabbits were divided in two groups: Experiment and Control, and analyses were conducted in 6hrs, 12hrs and 24hrs after the procedure. Into the right and left auriculares veins of the Experiment group was injected tenoxicam with its diluent or 0.9% sodium chloride; in the Control group 0.9% sodium chloride was injected. Results: Statistical differences were evaluated by One-way analysis of variance: a) apart for each group (Tenoxicam/0.9% Sodium Chloride, Tenoxicam/Diluent and 0.9% Sodium Chloride), to compare the average measures of the endothelial cells nuclei diameters obtained in the observation period of 6hrs, 12hrs and 24hrs, without significant difference among them; b) apart from the observation period (6hrs, 12hrs and 24hrs), to compare the average measures obtained, in the Tenoxicam/0.9% Sodium Chloride, Tenoxicam/Diluent and 0.9% Sodium Chloride groups, it was observed that the average measures of the nuclei diameters of the 0.9% Sodium Chloride group were significantly bigger than the ones observed in the Tenoxicam/0.9% Sodium Chloride and Tenoxicam/Diluent groups. Conclusion: Tenoxicam, either with bidistilled water or 0.9% sodium chloride, reduced the endothelial cells nuclei diameters in the veins where it was injected.

KEY WORDS: Endothelium. Anti-inflamatory agents, non-steroidal. Rabbits.

Conflito de interesses: nenhum

Fontes de financiamento: nenhuma

Endereço para correspondência:

Taylor Brandão Schnaider

Av. Francisca R. de Paula, 289

Pouso Alegre – MG

37550-000

Tel/Fax: [phone]

[e-mail]

Data do recebimento: 14/12/2001

Data da revisão: 05/01/2002

Data da aprovação: 11/02/2002

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1

. Resumo da Tese de Doutorado realizada no Curso de Pós-Graduação em Técnica Cirúrgica e Cirurgia Experimental da Faculdade de Medicina – Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

2

. Professor(a) Titular do Departamento de Clínica Cirúrgica da Faculdade de Medicina – Universidade do Vale do Sapucaí (UNIVAS).

3

. Professor(a) Titular Doutor(a) da Disciplina de Cirurgia do Aparelho Digestivo da Faculdade de Medicina – UFMG.

4

. Professor(a) Adjunto do Departamento de Ciências Fisio-morfológicas e Patologia da Faculdade de Medicina – UNIVAS.

5

. Professor(a) Adjunto Doutor(a) da Disciplina de Bioestatística da Escola Paulista de Medicina – Universidade Federal do Estado de São Paulo (UNIFESP).

6

. Professor(a) Adjunto Doutor(a) da Disciplina de Bioestatística da Escola Paulista de Medicina – UNIFESP.

7

. Residente de Pediatria do Hospital Escola da Faculdade de Medicina de Itajubá.

8

. Aluno da Faculdade de Medicina – UNIVAS

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Jun 2002
• Data do Fascículo
  Abr 2002

Histórico

• Recebido
  14 Dez 2001
• Revisado
  15 Jan 2002
• Aceito
  11 Fev 2002