Estudo histológico e histométrico das vilosidades e das células caliciformes ileais na ileocistoplastia em ratas

Histologic and histometric study of the villous and of the ileal goblet cells, on the ileocystoplasty in female rats

Estudo histológico e histométrico das vilosidades e das células caliciformes ileais na ileocistoplastia em ratas¹

Marli Doroti Schauffert²

Maria de Lourdes Pessole Biondo Simões³

Yára Juliano⁴

Manuel de Jesus Simões⁵

Neil Ferreira Novo⁶

Valdemar Ortiz⁷

Schauffert MD, Biondo-Simões MLP, Juliano Y, Simões MJ, Novo NF, Ortiz V. Estudo histológico e histométrico das vilosidades e das células caliciformes ileais na ileocistoplastia em ratas. Acta Cir Bras [serial online] 1999 Jul-Sept;14(3). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb.

RESUMO: 24 ratos de WISTAR, fêmeas, OUTB EPM-1, divididas em dois grupos experimentais de 4 e 12 semanas (GE eu e GE II). sofreram ileocitoplastia para estudo da mucosa ileal. Cada rato fêmea era seu próprio controle (GC I e GC II), pela exclusão de segmento ileal de 1,0 cm., no momento zero da operação, justaposto ao segmento ileal pediculado de 2,5 cm., que ampliou a bexiga urinária. Depois do tempo experimental, , as peças operatórias retiradas eram processadas com os controles, para estudo microscópico pelos métodos HE e Alcian Blue (pH 2,5) Orange. A eutanásia era consumada com anestésico. Os resultados histomorfométricos eram comparados por grupos entre experimento e controle e depois suas diferenças por grupos independentes, por meio da análise estatística, que fixou 5% o nível de rejeição da hipótese de nulidade, para os testes aplicados. Há diminuição progressiva do número e altura das vilosidades do GE II em relação ao GE I, e de cada experimento, comparado com seu controle. As células caliciformes ileais (sialomucinas), exibem aumento significante e progressivo de seu número. As alterações encontradas na mucosa ileal da ileocistoplastia, não desencorajam sua indicação.

DESCRITORES: Derivação urinária. Técnicas histológicas. Mucosa intestinal. Ratos.

INTRODUÇÃO

Revendo a literatura desde os primeiros estudos experimentais realizados por TIZZONI e FOGGI (1888)⁶,que usaram segmento ileal para reconstrução do aparelho urogenital em cães, e a partir de MIKULICZ (1898), que realizou a primeira ileocistoplastia, muitos modelos experimentais foram realizados com a finalidade de manter a integridade anatomo funcional do sistema urogenital, através de derivações urinárias, ampliações da bexiga urinária e sua substituição. Foram realizados vários estudos histológicos na mucosa dos segmentos gastrointestinais, utilizados nas operações, com o propósito de conhecer as alterações histomorfométricas, que poderiam ocorrer na presença de urina.

Os autores encontraram atrofia da mucosa ileal, até urotelização; perda das microvilosidades com modificações da arquitetura da mucosa e alterações das células caliciformes que podem aumentar ou mesmo diminuir, conforme o tempo e o modelo do experimento ^{2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15}.

Objetivou-se investigar as alterações da mucosa ileal na ileocistoplastia em ratas, por meio da histomorfometria, pelos métodos de coloração da Hematoxilina-Eosina (H.E.) e do Alcian Blue (pH 2,5) Orange (A.B.(pH2,5) O.), considerando que este tema necessita estudos experimentais esclarecedores, já que muitos pacientes são submetidos a essa operação, principalmente nas ressecções extensas e retrações da bexiga urinária (carcinomas, tuberculose), sem que se tenha conhecimentos suficientes, para tanto. Outrossim, quando a expectativa de vida é maior, como nas crianças que são portadoras de anomalias congênitas do aparelho urogenital, torna-se imperioso aprofundar o tema para indicações mais seguras.

MÉTODO

Utilizaram-se 24 ratas de WISTAR (Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia), fêmeas, da linhagem OUTB EPM-1, com peso corporal entre 172 a 230 gramas, fornecidas pelo Biotério Central da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) – Escola Paulista de Medicina (EPM).

Dividiu-se a amostra em dois grupos de 12 animais, sendo cada animal de seu grupo experimental (GE), o seu próprio controle, no momento zero da operação (GC), por meio da exérese de segmento ileal com 1,0 centímetro (cm.), justaposto ao segmento ileal pediculado de 2,5 cm, usado para incorporação na bexiga urinária, conforme técnica inspirada em CIBERT (1953)⁵. Reduziu-se a amostra de 48 para 24 animais, distribuídos em Grupos I = GC I e GE I (4 semanas) e Grupos II = GC II e GE II (12 semanas). Todos os animais dos grupos experimentais de 4 e 12 semanas, foram submetidos à mesma operação, depois de terem permanecido 15 dias no alojamento da Técnica Operatória e Cirurgia Experimental (TOCE). Após 18 horas de jejum (sem ração e com água à vontade), foram pesados, sorteados, marcados na orelha e anestesiados com pentobarbital sódico a 3%, pela via intraperitonial, na dose de 30 mg.Kg ^–1 de peso. Sobre uma prancha, era colocada a rata anestesiada, mantida aquecida, em decúbito dorsal horizontal, tendo as patas (manus), fixadas com fita adesiva. A parede abdominal era lavada, os pelos retirados da região central e era feita a anti-sepsia com clorhexidine a 2%. O ambiente era mantido aquecido entre 20 a 24 ºC.

Após laparotomia mediana longitudinal de 3 cm englobando todos os planos anatômicos da parede abdominal, as vísceras foram reconhecidas e o ceco tracionado com pinça atraumática, até exposição do íleo, do qual se isolou um segmento pediculado de 3,5 cm, distante do ceco aproximadamente 1,0 cm, e retirou-se 1,0 cm proximal, no tempo zero da operação, que foi aberto longitudinalmente, lavado e fixado no Líquido de BOÜIN. As ligaduras dos vasos proximal e distal ao segmento ileal pediculado, foram realizadas com fio de polipropileno 7-0, que também foi usado para refazer o transito intestinal íleo-ileal término-terminal, com pontos separados em plano único. Era realizada a abertura sagital de 0,5 cm da bexiga urinária, na qual se incorporava por pontos separados em plano único, com fio de poliglecaprone 25, 5-0, a extremidade distal do segmento ileal pediculado, no sentido isoperistáltico e a extremidade proximal, era fechada com o mesmo fio. A umidade das vísceras era mantida com solução salina isotônica a 0,9%.

As vísceras eram recolocadas anatomicamente na cavidade e após sua revisão, a parede abdominal era fechada em 2 planos, com polipropileno 4-0. As ratas permaneciam em gaiolas para 2 animais até recuperação anestésica, quando eram reconduzidas ao Biotério da TOCE, onde o pós operatório era acompanhado, conforme protocolo elaborado. Após 4 e 12 semanas, os animais eram pesados, sorteados, anestesiados e reoperados para retirada em monobloco da bexiga urinária com segmento ileal., quando era feita a observação macroscópica das aderências e do processo de cicatrização. A eutanásia era consumada com dose mínima letal anestésica. As peças abertas na sua borda mesentérica, eram fixadas em Líquido de BOÜIN, e processadas antes de 48 horas, com os respectivos controles, até a coloração pelos métodos de H E. e do A.B (pH 2,5) O., para histomorfometria: contagem das vilosidades (média em 10 campos), contagem de células caliciformes (mucopolissacarídeos-sialomucinas) e medida da altura das vilosidades (média em 10 vilosidades diferentes).

Nos testes da análise estatística fixou-se 5% (a £ a 0,05), o nível para rejeição da hipótese de nulidade, assinalando-se com asterisco (*), os valores significantes.

RESULTADOS

O aumento do peso corporal foi progressivo em todas as ratas e significante. Os animais exibiram um aumento volumétrico do segmento ileal (como reservatório), que se apresentava com o formato da bexiga urinária. Aderências da bexiga urinária com o mesosalpinge e reações teciduais inflamatórias do processo de cicatrização, eram uma constante. O aspecto microscópico das vilosidades da mucosa ileal na ileocistoplastia, era digitiforme e uniforme nos controles, enquanto nos experimentos havia um achatamento progressivo, algumas deformações e a presença aumentada de muco. Ao microscópio óptico, as laminas coradas em H.E. dos animais do GE I e GE II, exibiram características semelhantes às de seus controles (GCI e GC II), porém o número de vilosidades e alturas das mesmas, foi significantemente menor no GE II em relação ao GE I e em cada experimento em relação ao seu controle (Figura 1 - pg. 7, e Figura 3 pg 8), conforme análise estatística. A contagem das células caliciformes (mucopolissacarídeos), foi significantemente maior nos experimentos em relação aos controles e no GE II em relação ao GE I (Figura 2 – pg. 7 e Figura 3 pg. 8), conforme análise estatística. O aumento das células caliciformes (mucopolissacarídeos), era evidente pela presença aumentada de muco. Os animais do GE II (12 semanas), mostraram alterações histomorfométricas mais acentuadas do que os do GE I (4 semanas).

Figura 1 –
Fotomicrografias de corte longitudinal de parte da mucosa de segmento ileal mostrando diminuição progressiva do número e altura das vilosidades, de forma comparativa, em rata de GC, de GE I e GE II. H.E. 280 X.

Figura 2 –
Fotomicrografias de corte longitudinal de parte da mucosa de segmento ileal mostrando aumento progressivo do número das células caliciformes (mucopolissacarídeos), destacadas em azul, de forma comparativa em rata de GC, de GE I e de GE II. A.B. (pH 2,5) O., 100 X.

Figura 3 –
Gráfico da variação da média do número de vilosidades, (No V), das células caliciformes (No. CC) e da altura das vilosdiades (H V) em micra, nos diferentes períodos de estudo: tempo zero (T0) do GC; 4 semanas (4 s) do GE I e 12 semanas (12 s) do GE II.

DISCUSSÃO

Da amostra: decidiu-se pelo rato, pela facilidade no manuseio e obtenção; disponibilidade de amostra homogênea de baixo custo; por ser um animal silencioso, limpo, ocupar pequenos espaços e ainda de anatomia ideal para o experimento, pela semelhança com os humanos. Utilizaram-se fêmeas pela disponibilidade e respeitaram-se os 3 Rs, segundo as normas de bioterismo, reduzindo-se (Reduction) o N de 48 para 24 animais por ser cada experimento seu próprio controle, substituindo (Replacement) os animais pelos filogeneticamente mais primitivos e aprimorando-se (Refinement) o método para melhor resultado e menor sofrimento para o animal.

Do método: Realizou-se ileocistoplastia em 24 ratas que foram divididas em dois grupos. Após 4 e 12 semanas, era consumada a eutanásia por dose mínima letal anestésica, sendo que as peças em monobloco eram retiradas antes e processadas até a coloração em H.E. e A.B.( pH 2,5) O., e submetidas a histomorfometria pela microscopia óptica. Os resultados foram analisados estatisticamente através de testes não paramétricos. Revendo a literatura, outros autores que realizaram derivações urinárias e ampliações vesicais em ratos, utilizaram modelos diferentes ou em parte, semelhantes ao deste trabalho^{3,4,7,10,11,12}.

Não se encontrou na literatura nenhum trabalho que comparasse em tempos diferentes os resultados histomorfométricos na ileocistoplastia de ratas e que estudasse além das vilosidades, os mucopolissacarídeos (sialomucinas), das células caliciformes ileais com corante específico, o que tornou este trabalho pioneiro¹⁵.

Dos resultados: Obteve-se resultados significantes quanto as contagens e mensurações das vilosidades, que tiveram diminuição progressiva, quando se comparou o experimento com o controle de cada grupo e as diferenças entre os grupos. As contagens das células caliciformes (sialomucinas), exibiram aumento significante na comparação entre experimento e controle de cada grupo e entre os delta percentuais obtidos, havendo aumento do peso corporal dos animais nessa mesma proporção. Na observação macroscópica, notou-se: aumento nos diâmetros transversal e longitudinal do segmento ileal pediculado incorporado à bexiga urinária; presença de muco na urina; aderências da bexiga com o mesosalpinge; reações inflamatórias teciduais de cicatrização na área de anastomose, menos acentuadas do que as encontradas com o uso do fio de categute cromado 6-0, no plano piloto e ao contrário desse plano, não se encontrou cálculos. As observações microscópicas ópticas, mostraram áreas quase atróficas, vilosidades digitiformes reduzidas e deformadas algumas vezes e aumento das células caliciformes (sialomucinas). Alguns autores encontraram resultados semelhantes ao deste trabalho conforme literatura consultada ^{4,7,8,10,11,12,13,14}. Em todos os experimentos (4 e 12 semanas), a mucosa ileal estava com alterações na sua unidade estrutural, a vilosidade, que contem células caliciformes variadas, enterócitos e glândulas de LIEBERKÜHUN. As vilosidades apareceram sempre reduzidas em todos os trabalhos consultados. As células caliciformes resultaram aumentadas quanto aos mucopolissacarídeos, neste trabalho. Alguns autores encontraram aumento das células caliciformes em seus estudos ^2,7,12,13,14, enquanto outros, diminuição ⁹. Quanto maior o tempo de experimento, mais significante as alterações encontradas na mucosa ileal, que progrediram para metaplasia transicional nas áreas que se esboçaram quase atróficas, à microscopia. Diversos autores consultados, relataram urotelização em experimentos de 2 até 12 meses, de forma progressiva. Esses pesquisadores estudaram diferentes modelos de gastroenterocistoplastias com amostra (N) que variou de 8 até 35 animais (ratos) por grupo e sempre encontraram alterações na mucosa ileal disfuncionalizada, na presença de urina^{3,4,7,10,11,12}.

O Alcian Blue(pH 2,5)Orange que se utilizou como método de coloração neste trabalho, para ressaltar as células caliciformes (sialomucinas) ¹⁵, foi encontrado num único trabalho em ratos (sem o fundo Orange), cujos autores utilizaram um segundo corante à base de ferro(High Iron Diamine), para separar as sialomucinas das sulfomucinas, em segmento ileocolônico disfuncionalizado em uso e desuso. Nesse trabalho, DAVIDSSON e col. (1996), encontraram aumento significante das sulfomucinas, enquanto as sialomucinas se apresentaram inalteradas⁷.

O fio de poliglecrapone 25, 5-0, adotado, provou ser ideal na profilaxia de cálculos urinários, quando comparado ao categute 6-0, utilizado no plano piloto, o que corrobora com os achados de BIONDO-SIMÕES (1996)¹.

CONCLUSÕES

A mucosa ileal da ileocistoplastia em rata, demonstra alterações histomorfométricas significantes, que progridem para atrofia e metaplasia transicional por diminuição progressiva do número e altura das vilosidades e aumento das células caliciformes (sialomucinas), mais acentuado no grupo de 12 do que no de 4 semanas. Todos os animais apresentam aumento de peso corporal, demonstrando adaptação às novas condições anatomo-funcionais impostas pela operação.

Então é possível entender que as alterações encontradas, minimizam os distúrbios metabólicos e contribuem para a defesa do hospedeiro, tentando manter a homeostase e prolongar a vida.

Schauffert MD, Biondo-Simões MLP, Juliano Y, Simões MJ, Novo NF, Ortiz V. Histologic and histometric study of the villous and of the ileal goblet cells, on the ileocystoplasty in female rats. Acta Cir Bras [serial online] 1999 Jul-Sept;14(3). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb .

SUMMARY: 24 rats of WISTAR, females, OUTB EPM-1, divided in two experimental groups of 4 and 12 weeks (GE I and GE II). they suffered ileocytoplasty for study of the ileal mucous. Each female rat was its own control (GC I and GC II), for the exclusion of segment ileal of 1,0 cm., in the moment zero of the operation, juxtaposed to the segment pediculated ileal of 2,5 cm., that enlarged the urinary bladder. After the experimental time, the pieces operative retreats were processed with the controls, for microscopic study for the methods HE and Alcian Blue (pH 2,5) Orange. The euthanasia was consummated with anesthetic. The histomorphometric results were compared by groups between experiment and control and later its differences for independent groups, by means of the statistical analysis, that it fastened 5% the level of rejection of the nullity hypothesis, for the applied tests. There are progressive decrease of the number and height of GE II's villous in relation to GE I and of each experiment, compared with its control. The ileal globet cells (syalomucins), exhibit significant and progressive increase of its number. The alterations found in the ileal mucous of the ileocystoplasty, don't discourage its indication.

SUBJECT HEADINGS: Urinary diversion. Histological techniques. Intestinal mucosa. Rat.

Endereço para correspondência:

Marli Doroti Schauffert

Al. Dr. Muricy, 819, 10 º andar

80020-040 Curitiba-PR

Fax: [phone]

E-mail: [e-mail]

Data de recebimento: 09/03/99

Data da revisão: 14/04/99

Data da aprovação: 11/05/99

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¹

Resumo de Tese de Mestrado apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM).

²

Mestre em Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-Escola Paulista de Medicina. Professora Assistente da Disciplina de Anatomia Humana do Departamento de Medicina da Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUC – PR).

³

Professora Doutora da Disciplina de Cirurgia Experimental da Faculdade Evangélica de Medicina do Paraná.

⁴

Professora Doutora da Disciplina de Bioestatística da UNIFESP-Escola Paulista de Medicina.

⁵

Professor Doutor da Disciplina de Morfologia (Histologia) da UNIFESP-Escola Paulista de Medicina.

⁶

Professor Doutor da Disciplina de Bioestatística da UNIFESP-Escola Paulista de Medicina.

⁷

Doutor, Professor Livre Docente em Técnica Operatória e Cirurgia Experimental. Chefe da Disciplina de Urologia da UNIFESP-Escola Paulista de Medicina.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Out 1999
• Data do Fascículo
  Set 1999

Histórico

• Recebido
  09 Mar 1999
• Revisado
  14 Abr 1999
• Aceito
  11 Maio 1999