Aderência e atividade microbicida de monócitos em portadores de esquistossomose mansônica na forma hepatoesplênica cirúrgica

Monocyte adherence and microbe kill activity in patients with surgical schistosomisis mansoni

Resumos

A cirurgia nas crianças portadoras de esquistossomose mansônica inclui esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e o auto-implante de tecido esplênico no omento maior. A eficácia desse procedimento pode ser responsável pelo desaparecimento da sepse fulminante pós-esplenectomia (SFPE) neste tipo de paciente. Esta condição é atribuída à diminuição de IgM, de linfócitos circulantes, de properdina e ausência de tuftsina, o que conduz a deficiência da atividade das células macrófágicas, que são responsáveis pela aderência à bactéria, fagocitose e destruição das mesmas. OBJETIVO: Analisar os aspectos funcionais dos monócitos destes pacientes, operados quando crianças, no Serviço de Cirurgia Geral da Criança do Hospital das Clínicas da UFPE, entre 1991 a 2000. MÉTODOS: Foram analisados os índices de aderência in vitro dos monócitos e a geração do ânion superóxido (O2-), em três grupos. O 1º, auto-implante (AI), constituído por 18 portadores de esquistossomose mansônica na forma hepatoesplênica, submetidos a esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e auto-implante de tecido esplênico no omento maior; o 2º, (ESP), formado por nove pacientes similares, submetidos a esplenectomia e desconexão ázigo-portal, e o 3º,(CT), constituído por 12 adolescentes sadios, oriundos da mesma condição sócio-econômica-geográfica. RESULTADOS: Não houve diferença no índice de aderência entre os três grupos. Os monócitos dos pacientes do grupo AI tiveram a geração de O2- semelhante à dos indivíduos do grupo CT, e significantemente maior do que os pacientes do grupo ESP. CONCLUSÕES: Os monócitos dos portadores de esquistossomose hepatoesplênica submetidos a esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e auto-implante de tecido esplênico no omento maior se mostram funcionalmente similares aos de indivíduos normais da mesma condição sócio-econômica-geográfica.

Esquistossomose mansônica; Monócitos; Atividade microbicida


Surgical treatment in children suffering from schistosomissis mansoni includes splenectomy; ligature of left gastric vein and auto-implantation of spleen morsels into the greater omentum. The efficacy of this procedure may be responsible for the disappearance of overwhelming post-splenectomy infection (OPSI), in this kind of patients. This condition may be assigned to the lowering of IgM, circulating lymphocytes, properdin and to the absence of tutfsin, which may lead to the deficiency of mono-macrophage activity cells, responsible for bacteria adherence, phagocytosis and its destruction. PURPOSE: To analyze the functional features of the monocytes from young patients, who underwent splenectomy, ligature of left gastric vein and auto-implantation of morsels of spleen tissue on the major omentum. These patients were cared for at - University Hospital - "Serviço de Cirurgia Geral da Criança, Hospital das Clínicas, UFPE", from 1991 to 2000. METHODS: It was analyzed the rates of monocytes in vitro adherence to the solid surface and the generation of O2- radical by the monocytes, stimulated with acetate miristate of phorbol (PMA) and PMA + tuftsin, in 3 groups. The 1st group (AI), constituted by 18 patients with schistosomiasis mansoni in the hepatosplenic form and treated with splenectomy, ligature of left gastric vein and auto-implantation of fragments of spleen tissue on the major omentum; the 2nd group (ESP), formed by 09 patients with schistosomiasis mansoni in the hepatosplenic form who underwent azigo-portal disconnection with splenectomy and the 3rd one (CT) constituted by 12 voluntary teenagers from the same geographic area and with the same socio-economical conditions. RESULTS: There was no significant difference in the monocyte adherence rate among the 3 groups. With regard to the generation of O2- release, the monocytes of patients from AI group had a super oxide generation similar to that of individuals from CT group, and higher than the patients from ESP group. The monocyte treatment with tuftsin did not change the kinetic of the superoxide generation on the 3 groups. CONCLUSIONS: The monocytes of the surgical hepatosplenic schistosomiasis mansoni bearers who underwent splenectomy, ligature of the left gastric vein and auto-implantation of spleen tissue into the major omentum showed functional similar features as comparared to normal people from the same social-economical-geographical conditions.

Schistosomiasis mansoni; Monocyte; Microbe kill activity


11 – ARTIGO ORIGINAL

Aderência e atividade microbicida de monócitos em portadores de esquistossomose mansônica na forma hepatoesplênica cirúrgica1 1 Trabalho realizado no Serviço de Cirurgia Geral da Criança HC, UFPE e no LIKA

Monocyte adherence and microbe kill activity in patients with surgical schistosomisis mansoni

Carlos Teixeira BrandtI, 2 2 Prof. Titular de Clínica Pediátrica Cirúrgica, CCS, UFPE ; Carlos Roberto Carvalho LeiteII, 3 3 Mestre em Cirurgia, CCS, UFPE ; Raul Manhães-de-CastroIII, 4 4 Prof. Adjunto em Nutrição, CCS, UFPE ; Carlos Brandt FilhoIV, 5 5 Bolsista de Iniciação Científica, CNPq/UFPE ; Célia Maria Machado Barbosa de CastroV, 6 6 Prof. Adjunto em Medicina Tropical, CCS, UFPE

IProf. Titular de Clínica Pediátrica Cirúrgica, CCS, UFPE

IIMestre em Cirurgia, CCS, UFPE

IIIProf. Adjunto em Nutrição, CCS, UFPE

IVBolsista de Iniciação Científica, CNPq/ UFPE

VProf. Adjunto em Medicina Tropical, CCS, UFPE

Endereço para correspondência

RESUMO

A cirurgia nas crianças portadoras de esquistossomose mansônica inclui esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e o auto-implante de tecido esplênico no omento maior. A eficácia desse procedimento pode ser responsável pelo desaparecimento da sepse fulminante pós-esplenectomia (SFPE) neste tipo de paciente. Esta condição é atribuída à diminuição de IgM, de linfócitos circulantes, de properdina e ausência de tuftsina, o que conduz a deficiência da atividade das células macrófágicas, que são responsáveis pela aderência à bactéria, fagocitose e destruição das mesmas.

OBJETIVO: Analisar os aspectos funcionais dos monócitos destes pacientes, operados quando crianças, no Serviço de Cirurgia Geral da Criança do Hospital das Clínicas da UFPE, entre 1991 a 2000.

MÉTODOS: Foram analisados os índices de aderência in vitro dos monócitos e a geração do ânion superóxido (O2-), em três grupos. O 1º, auto-implante (AI), constituído por 18 portadores de esquistossomose mansônica na forma hepatoesplênica, submetidos a esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e auto-implante de tecido esplênico no omento maior; o 2º, (ESP), formado por nove pacientes similares, submetidos a esplenectomia e desconexão ázigo-portal, e o 3º,(CT), constituído por 12 adolescentes sadios, oriundos da mesma condição sócio-econômica-geográfica.

RESULTADOS: Não houve diferença no índice de aderência entre os três grupos. Os monócitos dos pacientes do grupo AI tiveram a geração de O2- semelhante à dos indivíduos do grupo CT, e significantemente maior do que os pacientes do grupo ESP.

CONCLUSÕES: Os monócitos dos portadores de esquistossomose hepatoesplênica submetidos a esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e auto-implante de tecido esplênico no omento maior se mostram funcionalmente similares aos de indivíduos normais da mesma condição sócio-econômica-geográfica.

Descritores: Esquistossomose mansônica. Monócitos. Atividade microbicida.

ABSTRACT

Surgical treatment in children suffering from schistosomissis mansoni includes splenectomy; ligature of left gastric vein and auto-implantation of spleen morsels into the greater omentum. The efficacy of this procedure may be responsible for the disappearance of overwhelming post-splenectomy infection (OPSI), in this kind of patients. This condition may be assigned to the lowering of IgM, circulating lymphocytes, properdin and to the absence of tutfsin, which may lead to the deficiency of mono-macrophage activity cells, responsible for bacteria adherence, phagocytosis and its destruction.

PURPOSE: To analyze the functional features of the monocytes from young patients, who underwent splenectomy, ligature of left gastric vein and auto-implantation of morsels of spleen tissue on the major omentum. These patients were cared for at – University Hospital - "Serviço de Cirurgia Geral da Criança, Hospital das Clínicas, UFPE", from 1991 to 2000.

METHODS: It was analyzed the rates of monocytes in vitro adherence to the solid surface and the generation of O2- radical by the monocytes, stimulated with acetate miristate of phorbol (PMA) and PMA + tuftsin, in 3 groups. The 1st group (AI), constituted by 18 patients with schistosomiasis mansoni in the hepatosplenic form and treated with splenectomy, ligature of left gastric vein and auto-implantation of fragments of spleen tissue on the major omentum; the 2nd group (ESP), formed by 09 patients with schistosomiasis mansoni in the hepatosplenic form who underwent azigo-portal disconnection with splenectomy and the 3rd one (CT) constituted by 12 voluntary teenagers from the same geographic area and with the same socio-economical conditions.

RESULTS: There was no significant difference in the monocyte adherence rate among the 3 groups. With regard to the generation of O2- release, the monocytes of patients from AI group had a super oxide generation similar to that of individuals from CT group, and higher than the patients from ESP group. The monocyte treatment with tuftsin did not change the kinetic of the superoxide generation on the 3 groups.

CONCLUSIONS: The monocytes of the surgical hepatosplenic schistosomiasis mansoni bearers who underwent splenectomy, ligature of the left gastric vein and auto-implantation of spleen tissue into the major omentum showed functional similar features as comparared to normal people from the same social-economical-geographical conditions.

Keywords: Schistosomiasis mansoni. Monocyte. Microbe kill activity.

Introdução

A esquistossomose persiste como problema médico-social no Nordeste do Brasil1. Na criança, sua forma hepatoesplênica (EHE) pode determinar hipertensão porta, sangramento digestivo, hiperesplenismo e alterações do crescimento e desenvolvimento2. A maioria desses pacientes é tratada clinicamente, mas alguns requerem intervensão cirúrgica, sendo a esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e auto-implante de tecido esplênico uma opção freqüente2,3. Na vigência de recidiva hemorrágica é indicada esclerose endoscópica das varizes de esôfago4.

A esplenectomia determina alterações imunitárias, em virtude da perda da função imunológica de proteção do baço2,5. A complicação mais temida é a sepse fulminante pós-esplenectomia (SFPE), que tem mortalidade de 50% a 75%6.

O auto-implante de tecido esplênico é uma forma aceitável de preservar a função do baço quando a esplenectomia total for inevitável7,8. O procedimento diminui a ocorrência de SFPE, que é atribuída à diminuição de: IgM, linfócitos, properdina e ausência de tuftsina, conduzindo à deficiência da atividade das células mononucleares, que são responsáveis pela fagocitose e destruição de bactérias9-11.

A aderência dos monócitos à superfície bacteriana é a primeira etapa da ativação dessas células e início da resposta imunológica12. Na seqüência, as células fagocitárias destroem as bactérias utilizando sistemas microbicidas dependente de oxigênio, constituídos de oxidantes letais13. Logo, uma alteração no balanço oxidativo celular possui papel chave em condições fisiológicas e patológicas, levando a vários estados de morbidade14.

Diversos estímulos induzem, em fagócitos, eventos metabólicos, tais como a explosão respiratória. Neste fenômeno, o oxigênio molecular (O2-) sofre uma redução enzimática para produzir agentes microbicidas. A reação chave na explosão respiratória é a redução do oxigênio a ânion superóxido (O2-). O O2- é fabricado pelos leucócitos através da NADPH-oxidase, essa enzima catalisa a redução de um elétron de oxigênio. O O2- gerado pode ser convertido a peróxido de hidrogênio (H2O2) na presença da superóxido dismutase (SOD). Por isso, essas enzimas são importantes na proteção da célula contra a ação do ânion O2-, permitindo sua ação no centro do fagossomo15,16.

O O2-, produzido durante a fagocitose, pode ser detectado através de sua habilidade em reduzir um aceptor de elétrons. O ferricitocromo C tem sido usado neste intuito17. Assim, modificações na análise de redução do ferricitocromo C pela SOD têm sido usadas para detectar a geração de O2- por neutrófilos, monócitos e macrófagos17,18.

O presente estudo teve por objetivo avaliar a atividade funcional de monócitos através do índice de aderência e da geração de superóxido, tratados ou não com tuftsina, em portadores de esquistossomose mansônica na forma hepatoesplênica, submetidos a esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e auto-implante de tecido esplênico no omento maior.

Métodos

A pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética do Centro de Ciências da Saúde da UFPE. O termo de consentimento foi assinado por todos os pacientes ou responsáveis.

Pacientes

Foram constituídos três grupos: O grupo teste (auto-implantados – AI) incluiu 18 adolescentes portadores de EHE, submetidos, no período de 1991 a 2000, no Serviço de Cirurgia Geral da Criança do HC da UFPE, a esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e auto-implante de tecido esplênico no omento maior. Todos foram submetidos a avaliações clínica, laboratorial, endoscópica e ultra-sonográfica no pré-operatório e a cintilografia com enxofre coloidal marcado com Tecnécio 99m, no pós-operatório.

A confirmação da infecção esquistossomótica foi feita pelo Kato-Katz. Todos os pacientes haviam sido tratados com dose única de oxaminiquine (20mg/Kg de peso, via oral) e submetidos a tratamento cirúrgico após 30 dias. O seguimento pós-operatório variou de 1 a 10 anos, média (5,5 ± 2,4). Foram excluídos os pacientes com: antiginemia positiva para hepatite; uso abusivo de bebidas alcoólicas; biópsia hepática com lesões sugestivas de doença hepática alcoólica; uso de imunosupressores ou estimulantes do sistema imunológico durante o período do estudo; e os pacientes com doenças hematológicas. A idade variou de 14 a 23 anos, média (18,5 ± 2,4). Dez eram do sexo masculino (55,5%) e oito do feminino (44,5%). Os pacientes tinham, à época da cirurgia, idades entre 9 e 18 anos, média (12,9 ± 2,1).

Em relação à comprovação do auto-implante dos tecidos esplênicos, houve captação do enxofre coloidal marcado com Tecnécio99 100% dos casos. Nenhuma criança teve SFPE.

O grupo controle esplenectomizado (ESP) foi constituído por nove adultos, idades de 23 a 31 anos, média (27,4 ± 2,8), portadores de EHE submetidos a esplenectomia e desconexão ázigo-portal. O seguimento pós-operatório variou de 1 a 6 anos, média (2,9 ± 1,6). Sete pacientes eram do sexo masculino e dois do feminino. O HbsAg foi negativo em todos os casos.

O grupo controle sadio (CT) foi constituído por 12 adolescentes voluntários sadios, idades variando de 15 a 19 anos, média (16,6 ± 1,2), não portadores de esquistossomose, sem antecedentes de banho de rio, oriundos do município de Timbaúba -PE. Dois eram do sexo masculino (16,6%) e 10 do feminino (83,3%). Nenhum voluntário tinha morbidade associada. O exame físico destes adolescentes foi normal.

Procedimentos

Os pacientes foram operados sob anestesia geral. Após a esplenectomia, o baço era imerso em recipiente contendo solução de Ringer-lactato à temperatura de ± 4 graus Celsius (oC). O pólo superior era seccionado em fragmentos de aproximadamente 2 x 2cm, e implantados no grande omento, sendo fixados com categute cromado 000, e envoltos por esta estrutura. O peso total dos implantes era cerca de 100g .

O estudo foi do tipo ensaio biológico, sendo objeto de estudo in vitro, os monócitos do sangue periférico. A parte laboratorial foi realizada no Setor de Microbiologia do Laboratório de Imuno Patologia Keiso Azami (LIKA).

Foram coletados 20ml de sangue dos indivíduos de todos os grupos. O sangue era distribuído em quatro containers à vácuo, de 5ml cada, e contendo EDTA a 15%.

O experimento seguiu o protocolo descrito por Johnston17. O sangue era distribuído em tubos para centrífuga. Posteriomente, diluído na proporção de 1:2 em meio de cultura Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640), estéril a 8ºC, e, aos 40 ml da suspensão eram adicionados 10 ml de Histopaque (SIGMA). A mistura era centrifugada por 30 minutos a 1.400rpm (2º a 8ºC). A seguir, era coletado, com pipeta de Pauster, a camada formada por mononucleares (PBMC), que era transferida para outro tubo de centrífuga. Eram adicionados 15ml de meio RPMI 1.640, e feito, em seguida, nova centrifugação por 10 minutos. O sobrenadante era aspirado e desprezado. Posteriormente, o sedimento era ressuspendido em 2 ml de meio de cultura RPMI 1640, contendo soro fetal bovino a 3% e antibióticos (penicilina 100U/ml e estreptomicina 100mg/ml). Desta última solução, era retirada alíquota de 10ml e colocada em tubo Eppendorf, plástico e estéril, e adicionado, à suspensão de células, 90ml do corante azul tripan a 0,05%. Este corante, portanto, foi utilizado para fazer a contagem das células e avaliar a sua viabilidade. Do total de células recuperadas, os monócitos encontravam-se em uma proporção de 95%. Ao final, a mistura era disposta sobre uma lâmina espessa de vidro (Hemocitômetro ou Câmara de Neubauer), que era levada ao microscópio óptico para contagem das células.

O resultado da contagem das células era obtido aplicando-se a seguinte fórmula: Células/mm3 de sangue = n x 10 x 10 X 103 onde: n: número total de células contadas nos quatro campos; 10: fator de conversão da diluição; 10: fator da espessura lamínula/lâmina; 103 : fator de conversão para 1mm3; A concentração celular foi ajustada para 1. 106células / ml.

Posteriormente, eram adicionados 6ml de meio RPMI 1.640 aos 2ml de células já existentes. As células eram colocadas em placas de cultura contendo seis poços de 35mm de diâmetro cada, onde eram dispensados 2ml da suspensão de células em uma proporção de 106 células/ml de meio de cultura RPMI 1.640, em cada poço. O material era colocado na incubadora a 37ºC e 5% de dióxido de carbono (CO2). Após, era feita lavagem do poço com meio de cultura RPMI 1.640 para retirada das células não aderentes à superfície da placa. Posteriormente, a placa era deixada por mais 1h na incubadora para a preparação do ensaio da geração de radical superóxido.

Após a recuperação dos monócitos, as células eram ressuspendidas em RPMI 1.640. Alíquota de 10ml da suspensão de células não aderentes era colocada em tubo Eppendorf, misturadas a 90ml do corante azul tripan a 0,05% e contadas.

O IA era calculado usando a fórmula19:

Os monócitos aderidos eram utilizados para determinar a geração de superóxido, cuja liberação era induzida com PMA (SIGMA) em solução salina balanceada de Hank's (HBSS, Gibco), concentração de 2ml/ml. Foi utilizado o ferricitocromo C de mitocôndria de coração de cavalo, tipo IV (30 mg/ml em HBSS, 2.4x 10-3 M, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA). A especificidade da geração de superóxido foi conseguida pela utilização da superóxido dismutase de eritrócitos bovinos - SOD (SIGMA), contendo 3.000u/mg de proteína em solução final de 3mg/ml.

Para a avaliação da produção de superóxido foram preparados três sistemas de análise descontínua com avaliação a cada uma hora, durante um período de duas horas. Para o preparo destes sistemas, foram utilizados os monócitos do sangue em cultura (2ml/poço com 106/ml de meio de cultura). Estes sistemas eram mantidos em incubadora com atmosfera úmida a 5% de CO2 a 37oC, por 10 minutos, para ativação da SOD.

No primeiro sistema em que foi adicionado SOD, (utilizada para inibir a produção de radical superóxido formado e garantir a especificidade do experimento), o meio foi acrescido de citocromo C e PMA (acetato miristato de forbol - PMA, SIGMA) preparado em solução concentrada de 3000mg/ml em dimetil sulfóxido de sódio (DMSO, SIGMA). O PMA utilizado para estimular as células era diluído para uma concentração de 2mg/ml em 2.145ml de solução salina balanceada de Hanks (HBSS, GIBCO) e colocado nos poços da placa de cultura. No segundo sistema, contendo água destilada, também foram adicionados citocromo C e PMA. O terceiro sistema continha Citocromo C, PMA e Tuftsina, esta última usada para avaliar a sua influência na geração de radical superóxido.

Em seguida, amostras de 600 ml eram retiradas concomitantemente de cada sistema e colocadas em tubos Eppendorf. A primeira alíquota recolhida relativa ao tempo "zero" de cada sistema correspondia ao branco do espectrofotômetro. Em seguida, a reação era paralisada em banho de gelo. As amostras subseqüentes eram coletadas em intervalos de tempo regulares, nas mesmas condições, de uma em uma hora, até duas horas.

Ao término da última coleta, as amostras eram centrifugadas a 10.000rpm por 5 min à temperatura ambiente em microcentrífuga (25.000Xg - rotor Ra-1M Kubota). Ao final da coleta, as células aderidas na placa eram recuperadas em cloreto de sódio a 0,9% para determinar o conteúdo em proteínas.As amostras eram levadas para determinação do grau de redução de ferrocitocromo C usando-se cubeta de 1ml (quartzo) e espectrofotômetro com comprimento de onda ajustado para a faixa do vermelho (550nm). Os resultados da leitura eram registrados como valores de DO ou absorbância.

Sabendo-se que 1mol de superóxido reduz 1mol de citocromo C, para converter os resultados obtidos na leitura do espectrofotômetro (DO) para nmoles de O2-/min, foi confeccionado uma curva correlacionando os resultados das leituras do espectro com os respectivos tempos de coleta, e nesta curva encontrado o valor correspondente em DO, ao tempo 1 minuto. Em seguida, multiplicava-se o valor encontrado pela constante 71,4, quando o volume total do sistema era de 1,5ml. Esta constante representava o valor em DO obtido a 550nm para um sistema de 1,5ml de citocromo C, em uma cubeta de cm2, onde todo o citocromo C encontrava-se reduzido, adotando-se para isto um coeficiente de extinção molar DE550 = 21,0 x 103 M-1 cm-1 17.

Os resultados finais foram expressos, após o agrupamento dos respectivos pontos para cada tempo de coleta de cada paciente. Sendo assim, foi confeccionada uma curva que representava a média destes pontos. Desta curva foi calculada a produção de radical superóxido em nmoles/min, que representou a média do grupo AI, que foi confrontada com os valores dos grupos controles ESP e CT, obtidos de forma semelhante.

O cálculo final foi dado pela fórmula: Cálculo [O2-] = K x DO x V. Onde: K: constante calculada para o volume final em cada poço. Nesse estudo, K = 205,49; DO: densidade ótica; e V: volume da amostra (600ml).

Os resultados dos diferentes grupos foram expressos por seus valores absolutos e respectivas médias e desvios padrões. Para verificação da diferença das médias dentro dos grupos foram utilizados o teste "t" de Student para amostras pareadas e não pareadas. Para a análise da diferença das médias entre os grupos foi utilizada a análise de variância (ANOVA), e quando a ANOVA revelou diferença significativa, foi utilizado o teste de Tukey. A significância estatística foi considerada, admitindo-se um nível crítico de 5% em todos os casos (p £ 0,05). Foi utilizado o software Jandel Sigma Stat, versão 2.0.

Resultados

Índice de aderência

O índice de aderência foi expresso em porcentagem (%). Nos monócitos dos pacientes do grupo AI, a média do IA foi de 69,2% ± 9,7%; nos monócitos dos pacientes do grupo ESP, a média do índice de aderência foi de 66,3 ± 13,4% e nos monócitos dos sadios do grupo CT, foi de 67,3% ± 14,5%. Comparando as médias dos IA, através da ANOVA, não se observou diferença entre os grupos F = 0,190; p = 0,827. (Figura 1)

Produção de radical superóxido

A produção de radical superóxido pelos monócitos foi expressa em nmol/min x 106/ml. A liberação de O2- pelos monócitos foi avaliada durante o período de 2 horas.

A produção média de O2- pelos monócitos estimulados com PMA dos indivíduos do grupo CT, aumentou da 1ª para 2ª hora (14,5 ± 4,5 vs 20,8 ± 6,2; t = - 9,049; p £ 0,001). O mesmo achado foi encontrado nos monócitos estimulados com PMA e tratados com tuftsina (PMA + tuftsina) (13,5 ± 5,1 vs 23,2 ± 8,6; t = -3,849; p = 0,003). Porém, estes valores não diferem, nem na 1ª hora (14,5 ± 4,5 vs 13,5 ± 5,1; t = 0,465; p = 0,647), nem na 2ª hora (20,8 ± 6,2 vs 23,2 ± 8,6; t = -0,789; p = 0,439). (Figura 2).

No grupo ESP, a média da produção de O2- pelos monócitos estimulados com PMA, aumentou da 1ª para 2ª hora (4,2 ± 2,2 vs 7,1 ± 2,3; t = -3,436; p = 0,009). Nos monócitos estimulados com PMA + tuftsina não houve aumento da liberação de O2- da 1ª para 2ª hora (3,7 ± 2,9 vs 6,7 ± 3,5; t = -2,282; p = 0,052). Na comparação da liberação média de radical O2- pelos monócitos estimulados com PMA ou com PMA + tuftsina, observou-se que não houve aumento nem na 1ª hora (4,2 ± 2,2 vs 3,7 ± 2,9; t = 0,358; p = 0,725), nem na 2ª hora (7,1 ± 2,3 vs 6,7 ± 3,5; t = 0,290; p = 0,776). (Figura 3).

A média da produção de O2- dos monócitos dos pacientes do grupo AI, estimulados com PMA, não sofreu aumento entre a 1ª e a 2ª hora (14,9 ± 7,3 vs 16,1 ± 5,6; t = - 0,541; p = 0,595). Houve aumento da 1ª para 2ª hora pelos monócitos estimulados com PMA + tuftsina (13,1 ± 5,6 vs 18,3 ± 8,5; t = -2,867; p = 0,011). Porém, comparando a média da produção de O2- nos monócitos estimulados com PMA ou com PMA + tuftsina não se observa diferença, nem na 1ª hora (14,9 ± 7,3 vs 13,1 ± 5,6; t = 0,837; p = 0,408), nem na 2ª hora (16,1 ± 5,6 vs 18,3 ± 8,5; t = -0,917; p = 0,366). (Figura 4).

A média da produção de radical O2- na 1ª hora, pelos monócitos dos pacientes dos grupos AI, ESP e dos indivíduos do grupo CT, estimulados com PMA, mostrou diferença significante (14,9 ± 7,3 vs 4,2 ± 2,2 vs 14,5 ± 4,5; F = 11,7; p £ 0,001). Para situar a diferença entre as médias, foi aplicado o teste de Tukey, não revelando diferença entre os grupos AI e CT (Diferença de média = 0,444; q = 0,294; p< 0,05). A diferença foi localizada entre os grupos AI e ESP (Diferença de média = 10,7; q = 6,4; p< 0,05) e entre os grupos CT e ESP (Diferença de média = 10,2; q = 5,7; p< 0,05). Em relação à média da produção de O2- na 2ª hora nos grupos AI, ESP e CT, também ocorreu diferença entre os grupos (16,1 ± 5,6 vs 7,1 ± 2,3 vs 20,8 ± 6,2 vs; F = 17,3; p £ 0,001). O teste de Tukey não mostrou também diferença entre os grupos AI e CT (Diferença de média = 4,7; q = 3,3; p< 0,05), situando as diferenças entre os grupos AI e ESP (Diferença de média = 9,0; q = 5,8; p< 0,05) e os grupos CT e ESP (Diferença de média = 13,7; q = 8,2; p< 0,05). (Figura 5).

Quando os monócitos foram estimulados com PMA + Tuftsina, a média da produção do radical O2- na 1ª hora nos grupos AI, ESP e CT, mostrou diferença (13,1 ± 5,6 vs 3,7 ± 2,9 vs 13,5 ± 5,1; F = 12,4; p £ 0,001). A diferença entre as médias foi localizada pelo teste de Tukey, que, novamente, não revelou diferença entre os grupos AI e CT (Diferença de média = 0,4; q = 0,35; p< 0,05), mas mostrou diferença entre os grupos AI e ESP (Diferença de média = 9,3; q = 6,4; p< 0,05) e entre os grupos CT e ESP (Diferença de média = 9,8; q = 6,2; p< 0,05). Em relação a média da produção de O2- na segunda hora, também ocorreu diferença (18,3 ± 8,5 vs 6,7 ± 3,5 vs 23,2 ± 8,6; F = 12,0; p £ 0,001). O teste de Tukey não mostrou diferença entre os grupos AI e CT (Diferença de média = 4,9; q = 2,4; p< 0,05), situando as diferenças, novamente, entre os grupos AI e ESP (Diferença de média = 11,6; q = 5,1; p< 0,05) e os grupos CT e ESP (Diferença de média = 16,5; q = 6,8; p< 0,05). (Figura 6).

Discussão

A esquistossomose associa-se à pobreza, que obriga o uso de águas contaminadas para o exercício da agricultura, trabalho doméstico e lazer. A região Nordeste é a que apresenta a maior prevalência do Brasil, sendo que mais de 90% dos pacientes infectados apresentam a forma leve e moderada, e cerca de 4% a 10% a forma grave, hepatoesplênica1.

Até 1989, a conduta em crianças portadoras de hipertensão porta esquistossomótica cirúrgica, no Nordeste do Brasil, consistia, de forma similar aos adultos, em esplenectomia associada à sutura obliterante das varizes de esôfago. A morbidade, em termos de recidiva hemorrágica, era semelhante a dos adultos, entretanto, a mortalidade era maior em virtude da sepse fulminante pós-esplenectomia20. O Serviço de Cirurgia Geral da Criança do HC da UFPE instituiu, a partir de 1990, de forma inédita, nesses pacientes, o protocolo de esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e auto-implante de tecido esplênico no omento maior.

Com relação à idade entre os grupos estudados, houve diferenças (F = 66; p£ 0,001). Estas localizaram-se entre os grupos ESP e CT (q = 15,3; p£0,05) e ESP e AI (q =13,7; p£0,05). Porém, não há referência, na literatura, da interferência da idade no índice de aderência e/ou na geração de radical superóxido nos monócitos. Por isso, essa variável de controle não deve ser considerada como um fator que tenha interfirido nos resultados.

Nos pacientes incluídos não foram observados positividade antigênica para hepatite B. Porém, a pesquisa é importante, pois é conhecida a associação da EHE e a hepatite pelo vírus B21.

Os resultados cirúrgicos estão relacionados à reserva de função hepática desses pacientes4. A baixa morbidade e a ausência de óbitos pode ser resultado de cirugia realizada em um grupo de pacientes com boa reserva funcional hepática, já que 12 pacientes foram enquadrados como Child A, os outros como Child B.

É conhecida que a iniciação da resposta imune depende da presença de tecido esplênico. Muito embora o auto-implante de tecido esplênico esteja sendo realizado para restaurar a função imune normal do baço, até agora não se sabe se a esplenose resultante é capaz de iniciar uma reação primária humoral aos antígenos TI-222.

A incidência nula de SFPE sugere que a esplenose mantém algumas das funções de defesa originais do baço8. É provável, também, que a antibioticoprofilaxia intensa iniciada na indução anestésica e mantida por sete a dez dias; assim como a administração de Penicilina G benzantina a cada três semanas, no pós-operatório tardio até, pelo menos 14 anos de idade, tenha contribuído.

A ligadura da veia gástrica esquerda bloqueia o desvio entre o sistema venoso ázigo e o portal, diminuindo a pressão nas varizes do terço inferior do esôfago e do fundo gástrico23.

Depois que ficou provado que pacientes esplenectomizados9-11 e asplênicos apresentavam maior susceptibilidade às infecções por várias bactérias, o auto-implante de tecido esplênico realizado com o objetivo de manter função esplênica residual estimulou um número crescente de pesquisas sobre tal procedimento5. Este reveste-se de maior importância na criança, na qual a incidência de SFPE é maior do que no adulto. Por outro lado, a aparente regeneração do tecido esplênico auto-implantado parece ser melhor nos organismos jovens do que nos velhos24. Este fato é corroborado em modelo animal25.

No Brasil, vários autores têm dado apoio à importância da função do auto-implante e do remanescente esplênico após esplenectomia subtotal, demonstrando os efeitos benéficos na manutenção da função imunológica esplênica5,26,27. Do ponto de vista clínico, a esplenose pode ter contribuído, no presente estudo, para não ocorrência de nenhum caso de SFPE.

A ligadura dos vasos gástricos curtos é realizada no último tempo da esplenectomia, a fim de manter a irrigação, por maior tempo possível, do pólo superior do baço, que é usado para o auto-implante. Assim foi conduzida a cirurgia em todos os casos do presente estudo. Esse conceito tem tido o suporte de outros estudos, quando é mantido tecido esplênico residual através da esplenectomia parcial. Nesses experimentos, ocorre, também, a preservação da função fagocitária do pólo superior do órgão 26,27.

Apesar de ser evidente o beneficio do auto-implante de tecido esplênico5,7,9,22,27-34, o assunto ainda é controverso e permanece sob investigação8,35.

Além do grande fluxo de sangue, 4% do volume sanguíneo circulante por minuto, o baço representa um importante ponto de encontro entre a informação antigênica tranportada pelo sangue e o sistema imune. A baixa velocidade de fluxo na polpa vermelha leva a um contato íntimo e prolongado entre os antígenos e os fagócitos36,37.

Os macrófagos representam a primeira linha de defesa contra antígenos. Estas células fagocitam as bactérias, liberam mediadores bioativos e citocinas como TNF-a, IL-1, IL-6, IL-8 e outras38.

A fagocitose desenvolvida pelas células macrofágicas constitui o início do conjunto das atividades de toda a resposta imunológica, que é constituída por várias etapas: aderência ao substrato, quimiotaxia, ingestão de células e partículas inertes e produção de superóxido19.

Tem sido demonstrado que dentro de 30 minutos de aderência monocítica, às bactérias e seus produtos, há iniciação de um conjunto de eventos regulatórios, definido pela rápida mudança nos níveis de RNA-m de muitos proto-oncogenes e de mediadores da inflamação, como a interleucina –1 (IL-1) e o TNF-a39. Os macrófagos alveolares não aderentes são incapazes de produzir quantidades suficientes de TNF-a em resposta ao LPS, e, ao contrário, a secreção de TNF-a é aumentada pela aderência40. Assim sendo, a aderência do fagócito é crucial para a migração e interação com outras células e componentes da matriz extracelular no sítio inflamatório. Isto é evidenciado pelo fato de que células aderidas apresentam maior capacidade fagocitária e menor complexidade de grânulos41.

A separação dos monócitos é feita em função do gradiente de densidade com Histopaque. O plástico, o vidro, o nylon, o microexsudato ou a fibronectina são materiais que asseguram a aderência destas células42. Esta capacidade de aderência constitui uma função celular essencial que regula múltiplos fenômenos como ligação, migração, diferenciação e morte celular12,19,42.

Os valores de índice de aderência entre os monócitos de adultos normais têm sido relatados entre 55% e 90%.43. No presente estudo, três pacientes do grupo AI, um paciente do grupo ESP e um indivíduo do grupo CT, apresentaram índices de aderência menores do que estes valores. É provável que fatores individuais estejam envolvidos e sejam responsáveis por estes resultados, não podendo ser atribuída esta baixa aderência, portanto, ao procedimento da esplenectomia. Não foi encontrado IA maior do que 90%.

A aderência monocitária pode ser fortemente alterada frente a qualquer estímulo que, ao ativar os macrófagos, induza à liberação de citocinas. Essa propriedade pode avaliar o estado de ativação dos macrófagos44. Os macrófagos, quando estão em meio de cultura RPMI, rico em nutrientes e fatores de crescimento celular, apresentam sua aderência normal, constatada através do índice de aderência ao plástico19.

Tem sido demonstrado que a aderência dos macrófagos de ratos esplenectomizados é diminuída, contudo, o auto-transplante de tecido esplênico restaura esta atividade funcional45. Entretanto, pela análise das médias dos IA dos monócitos dos pacientes dos grupos ESP e AI, encontrando-se valores semelhantes da média do IA dos indivíduos sádios, é possível inferir que a esplenectomia, seguida ou não de auto-implante de tecido esplênico, não interfere nesta propriedade das células monocíticas humanas.

O objetivo da ER é gerar reativos microbicidas derivados do oxigênio que podem ser usados pelos fagócitos para a destruição de microrganismos. Este é um mecanismo característico destas células que acompanha a fagocitose. O interesse foi centrado no ânion superóxido por que a geração deste radical reflete a iniciação da cadeia respiratória46.

A redução de citocromo C por alguns tipos de macrófagos de camundongo, ou monócitos do homem, é linear em 60-90 minutos, e a liberação do ânion superóxido depende da densidade de células em cultura, do tipo de célula, do tipo de estímulo e de outras condições empregadas12.

Pela análise da geração média de O2- dos monócitos dos indivíduos sadios (CT) é possível ter uma idéia da cinética normal da liberação deste radical após estímulo com PMA ou com PMA + tuftsina, donde se observa um aumento na produção de superóxido relacionado ao tempo de estímulo das células ao PMA. Estes achados estão de acordo com a produção de O2- em ratos Wistar normais, estimulados com PMA, observando-se elevação crescente dos níveis de produção até as seis primeiras horas, havendo redução a 50% do valor máximo após 24h. A partir daí, os valores são quase imensuráveis48. Porém, o adicionamento da tuftsina sintética não parece aumentar a média de liberação nas duas horas, não alterando, portanto, a cinética da geração de O2- pelos monócitos do grupo CT.

Os monócitos do grupo ESP, estimulados com PMA, demonstraram aumento da liberação de O2- da primeira para segunda hora, portanto relacionada ao tempo de exposição ao PMA. Aumento não foi observado após estímulo com PMA + tuftsina. É possível inferir que os monócitos do pacientes esplenectomizados são capazes de gerar ânion superóxido em quantidade crescentes, parecendo simular a cinética de geração dos indivíduos sadios. Porém, estas quantidades são muito pequenas, o que, naturalmente, demonstram uma atividade microbicida menor. Não há diferença, como observado no grupo CT, entre a quantidade média de radical superóxido pelos monócitos estimulados com PMA ou com PMA + tuftsina. Fica patente, também, que a administração de tuftsina não altera a cinética da liberação de O2-. Tem sido demonstrado que nos pacientes esplenectomizados ocorre diminuição dos níveis de tuftsina32. Portanto, seria esperado que os monócitos destes pacientes respondessem, com a administração deste peptídeo, liberando maiores quantidades de O2-.

Nos pacientes do grupo AI não houve aumento na geração média de O2- pelos monócitos estimulados com PMA, relacionado ao tempo. Porém, a liberação de O2- , por estas células, já é satisfatória na 1ª hora, já que é semelhante à dos indivíduos controles normais. Aumento foi observado nos monócitos estimulados com PMA + tuftsina. Porém, quando se compara a geração média de O2- pelos monócitos estimulados com PMA ou com PMA + tuftsina não se observa diferença, o que demonstra, também, que a tuftsina não altera a cinética dos monócitos neste grupo de pacientes. Os níveis séricos de tuftsina em crianças esquistossomóticas esplenectomizadas seguidas de auto-implante de tecido esplênico no omento maior são similares aos das crianças sadias, o que demonstra que este procedimento é um meio eficiente de manter as concentrações deste peptídeo9. Nos pacientes que desenvolvem algum grau de esplenose após lesões traumáticas, as concentrações da tuftsina também situam-se em níveis normais32.

Quando foram comparadas as médias da produção de O2- pelos monócitos estimulados com PMA, entre os grupos AI, ESP e CT, observa-se que os monócitos dos pacientes submetidos ao auto-implante de tecido esplênico liberam O2- em quantidades semelhantes aos monócitos do grupo controle e que esta produção foi maior do que a produção no grupo de pacientes esplenectomizados. Estes achados podem demonstrar que o auto-implante de tecido esplênico contribui de forma sinérgica ou isolada para que o monócito tenha uma atividade microbicida normal, pela manutenção das reações imunes que continuam se processando na esplenose.

Os monócitos dos pacientes esplenectomizados parecem ter a capacidade de se aderir à superfície da bactéria, mas a resposta imune não é completada pela falta do baço. Estes dados podem suportar a hipótese de que, por um lado, a produção de O2- deficiente nos pacientes esplenectomizados seria um dos fatores implicados na resposta deficitária do hospedeiro às infecções, permitindo a instalação da SFPE, e por outro, que o auto-implante de tecido esplênico restaura em parte a capacidade microbicida dos monócitos. O benefício deste procedimento, portanto, seria manter a integração do sistema fagocítico mononuclear (SFM), pivô no mecanismo primário de defesa do hospedeiro, através de seus sistemas microbicidas. Pode-se sugerir ainda que a liberação de superóxido pode representar um marcador do processo patológico que ocorre durante a SFPE. Os mesmos achados foram encontrados, entre os grupos, comparando as médias da geração de superóxido pelos monócitos estimulados com PMA + tuftsina47.

Os achados estão, de certa forma, em concordância com a avaliação similar feita em pacientes esplenectomizados por trauma esplênico. Nesse grupo de pacientes foi observado, ainda, diminuição da atividade intracelular da mieloperoxidase48. Igualmente, tem o respaldo de estudo da função fagocítica dos macrófagos em ratos que diminui após esplenectomia parcial. Entretanto, o remanescente esplênico tem a capacidade de ser estimulado quando exposto a um estímulo antigênico49.

Mizukami e col.50 mostraram que a exposição de ratos a polissacarídios da cápsula de pneumococos resulta em aumento na liberação de superóxido pelas células de Kupffer dentro dos sinusóides e dano das células endoteliais nos sinusóides. Estas alterações foram atenuadas pelo tratamento com superóxido dismutase ou pela esplenectomia, demonstrando que este procedimento reduz a produção de O2-, tendo efeito protetor sobre a injúria hepática induzida pelo polissacarídio50.

McCarthy e col.11 comparando grupos de ratos adultos, controles, esplenectomizados e outro grupo submetido a operações simuladas, avaliaram defeitos na função dos macrófagos peritoneais no período precoce da esplenectomia e verificaram que a produção de superóxido pelos macrófagos não foi prejudicada em nenhum momento. Porém, foram encontradas taxas de mortalidade em 24h maior no grupo esplenectomizado além da redução da liberação de óxido nítrico (um outro produto microbicida), leucopenia e redução da atividade microbicida intracelular em 24h. Este último defeito na função dos macrófagos ocorreu apesar da liberação de quantidades similares de superóxido. Os autores afirmaram que é inteiramente possível que outro mecanismo antibacteriano seja responsável por estes achados. Em contraste, a atividade microbicida extracelular não foi prejudicada após a esplenetomia, e este achado é correlacionado com o aumento na produção de O2- após a esplenectomia, uma resposta antecipada dos macrófagos na presença de certos micróbios11.

A idéia geral foi dar maior consistência à hipótese de que o auto-implante de tecido esplênico pode influir de forma positiva na atividade fagocítica, na imunidade celular e humoral destes pacientes, o que pode ser capaz de reduzir a incidência da sepse fulminante pós-esplenectomia. Outra alternativa com fundamentação similar é a esplenectomia parcial nesses pacientes, cujos resultados satisfatórios têm sido confirmados em adultos49,51.

Até agora não existem experimentos que avaliem diretamente a função do baço. A forma de avaliação ideal da capacidade fagocítica das células macrofágicas esplênicas poderia ser estudar, tanto funcional como histologicamente, os macrófagos dos fragmentos esplênicos auto-implantados neste grupo de pacientes. Esse estudo, obviamente, não responde a questão crítica se o auto-implante de tecido esplênico fornece tecido esplênico capaz de prevenir a SFPE. Porém, é possível que traga subsídio para pesquisas futuras nesta área.

Conclusões

1 - O índice de aderência dos monócitos dos grupos CT, ESP e AI foi semelhante.

2 - A atividade microbicida de monócitos estimulados com PMA e com PMA + tuftsina, avaliada pela liberação de O2-, em pacientes esplenectomizados com auto-implante de tecido esplênico foi semelhante a liberação em indivíduos normais na primeira e segunda hora e esta liberação foi maior em relação aos pacientes esplenectomizados.

3 - O tratamento dos monócitos com tufsina não alterou a cinética da geração de superóxido nos três grupos.

Data do recebimento: 18/11/2002

Data da revisão: 12/12/2002

Data da aprovação: 05/01/2003

Conflito de interesse: nenhum

Fonte de financiamento: nenhuma

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  • Endereço para correspondência
    Carlos Teixeira Brandt
    Av. Boa Viagem, 5090/1201
    50011-000 Recife, PE
    E-mail:
  • 1
    Trabalho realizado no Serviço de Cirurgia Geral da Criança HC, UFPE e no LIKA
  • 2
    Prof. Titular de Clínica Pediátrica Cirúrgica, CCS, UFPE
  • 3
    Mestre em Cirurgia, CCS, UFPE
  • 4
    Prof. Adjunto em Nutrição, CCS, UFPE
  • 5
    Bolsista de Iniciação Científica, CNPq/UFPE
  • 6
    Prof. Adjunto em Medicina Tropical, CCS, UFPE

Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    03 Set 2003
  • Data do Fascículo
    Mar 2003

Histórico

  • Recebido
    18 Nov 2002
  • Revisado
    12 Dez 2002
  • Aceito
    05 Jan 2003
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