Avaliação dos efeitos da ciclofosfamida nos testículos escrotal e retido em ratos jovens submetidos à criptorquia unilateral

Evaluation of the cyclophosphamide effects in descended and undescended testis of young rats with unilateral cryptorchidism

ARTIGO ORIGINAL

Avaliação dos efeitos da ciclofosfamida nos testículos escrotal e retido em ratos jovens submetidos à criptorquia unilateral¹

Evaluation of the cyclophosphamide effects in descended and undescended testis of young rats with unilateral cryptorchidism

Elaine Alves^I; Paulo Tubino^II; Saul Goldenberg^III

^IProfessora Adjunta de Cirurgia Pediátrica da Universidade de Brasília (UnB). Doutora em Medicina pela UNIFESP-EPM

^IIProfessor Titular de Cirurgia Pediátrica da UnB. Co-Orientador da Tese

^IIIProfessor Titular do Departamento de Cirurgia da UNIFESP-EPM. Orientador da Tese

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Foi produzida criptorquia unilateral experimental em ratos pré-puberais. Tanto no testículo retido quanto no contralateral escrotal, foram encontradas alterações similares às observadas cm seres humanos. Essas alterações correspondem a um desenvolvimento testicular prejudicado, com degeneração da gônada. A administração crônica da droga imunossupressora ciclofosfamida, em doses baixas, evitou a deterioração do testículo tópico, a despeito de sua reconhecida ação deletéria para a espermatogênese. Tendo em vista que as lesões observadas atingem também o testículo escrotal e podem ser prevenidas pela ciclofosfamida, e discutida a possibilidade de que sejam causadas por reação auto-imune.

Descritores: Testículos. Criptorquismo. Ciclofosfamida.

SUMMARY

Experimental unilateral cryptorchidism was produced in prepubertal rats. Both in the operated undescended testis and in the contralateral descended one, the changes were similar to that founded in the human. These changes show a disturbed testicular development with gonadal degenerative process. The chronic use of the immunosuppressant drug cyclophosphamide, with low dosages, avoided the damage in the topic testis, in spite of its very known harmful action to the spermatogenesis. As the observed lesions affects also the scrotal testis and as this can be prevented by the cyclophosphamide, the possibility of autoimmunization causing this damage in the experimental cryptorchidism in the rat is discussed.

Subject headings: Testis. Cryptorchidism. Cyclophosphamide.

INTRODUÇÃO

A etiologia da criptorquia é complexa, multifatorial e ainda não completamente esclarecida. Com freqüência a criptorquia se associa à infertilidade, a despeito de um testículo tópico contralateral aparentemente normal¹².

Desde os trabalhos de SHIRAT e col.(1966)⁵⁵, que tem sido observado que a espermatogênese é prejudicada no testículo tópico, nos casos de retenção testicular unilateral.

Por outro lado, a ciclofosfamida é a droga mais usada em quimioterapia anti-neoplásica⁸, espacialmente em pediatria, pelo seu amplo espectro de atividade clínica, que inclui as leucemias agudas e diversos tumores sólidos da criança.

ROBISON (1993)⁴⁷, com base nos dados de incidência do câncer na faixa etária pediátrica e das taxas atuais de sobrevida, considera que no início do próximo século, um de cada 900 indivíduos entre 16 c 44 anos de idade será um sobrevivente do câncer infantil. Pode-se afirmar, com segurança, que a maioria desses pacientes terá recebido ciclofosfamida durante seu tratamento. Considerando-se que a incidência de criptorquia varia de 0,8% a 1 % em meninos com um ano de idade⁵⁴, pode-se inferir que haverá ocasiões em que um paciente criptorquídico terá que receber ciclofosfamida, droga com reconhecida ação deletéria para a espermatogênese^{3,15,16,34,44,52}.

MÉTODO

Foram utilizados 48 ratos machos Wistar (Rattus norvegicus albinus), com idade variando entre oito dias e 60 dias de vida e pesando entre 20 g e 40 g no período da administração da ciclofosfamida, do 14º. dia ao 28º dia de vida. Os animais foram mantidos em gaiolas de plástico, forradas com serragem, recebendo ração comercial^* e água ad libitum. Até o desmame, as mães permaneceram nas gaiolas junto com suas ninhadas.

Os animais foram distribuídos, aleatoriamente, em quatro grupos de 12 ratos: GRUPO 1 - Ratos com criptorquia que receberam ciclofosfamida; GRUPO 2 - Ratos sem criptorquia que receberam ciclofosfamida; GRUPO 3 - Ratos com criptorquia que não receberam ciclofosfamida; GRUPO 4 - Ratos sem criptorquia que não receberam ciclofosfamida {grupo controle). Cada grupo foi dividido em dois subgrupos de seis animais cada um, de acordo com a época escolhida para o sacrifício: 30 ou 60 dias.

Com nove dias de vida, todos os animais foram submetidos a procedimento cirúrgico para o fechamento do anulo inguinal superficial esquerdo, impedindo a descida do testículo ipsilateral. Os animais dos grupos 2 e 4 foram submetidos, com a mesma idade, a procedimento semelhante, mas sem o fechamento do anulo superficial do canal inguinal: grupos de operação simulada.

A partir do 14º dia de vida, os ratos dos grupos 1 e 2 receberam injeçõcs diárias de ciclofosfamida, na dose de 25 mg/ml/dia, por via intraperitonial, durante 14 dias consecutivos. Nos grupos 3 e 4 foi administrado apenas soro fisiológico a 0,9%, nas mesmas condições e em volumes equivalentes.

Os animais foram sacrificados por inalação de éter em câmara fechada. Os testículos foram retirados e fixados em líquido de BOUIN e posteriormente processados pelos métodos usuais de histopatologia e incluídos em parafina. Foram obtidos cortes com cinco micra de espessura, corados pelos métodos da hematoxilina-eosina e do ácido periódico de SCHIFF (P.A.S.) e analisados em microscópio óptico.

A maturidade do epitélio germinativo foi determinada por meio do escore de JOHNSEN para biópsia testicular²⁵, modificado por SALMAN e col. (1988)⁵¹, usando-se uma objetiva de 25 x. Em cada lâmina foram avaliados 30 túbulos seminíferos, que receberam notas de um a 10. O escore testicular médio foi calculado pela média aritmética dos escores obtidos. O diâmetro médio dos túbulos seminíferos foi determinado por meio da identificação dos 10 túbulos mais circulares em cada secção de biópsia testicular e da medição dos diâmetros por meio de uma ocular micrométrica, usando-se uma objetiva de 10 x. Para cada testículo foi obtido o diâmetro tubular médio, em micra.

Para a análise estatística dos resultados foram utilizados testes não paramétricos⁵³.

Teste de WILCOXON, para comparar, em cada rato, os valores observados nos testículos direito e esquerdo e teste de MANN-WHITNEY, para comparar os resultados obtidos nos ratos sacrificados aos 30 dias com os dos ratos sacrificados aos 60 dias do experimento. Este mesmo teste foi aplicado para comparar, dois a dois, os quatro grupos estudados. O confronto dos grupos foi feito em relação aos valores dos lados direito, esquerdo c às diferenças percentuais (A%), calculadas a partir dos dois lados. Em todos os testes fixou-se em 0,05 ou 5% (p<0,05) o nível para rejeição da hipótese de nulidade.

RESULTADOS

A macroscopia, todos os ratos submetidos à criptorquia unilateral (grupos 1 e 3) apresentavam o testículo esquerdo retido, sendo possível a identificação dos pontos de fechamento do ânulo inguinal superficial. Nos animais dos grupos 2 e 4, ambos os testículos estavam tópicos.

Aos 60 dias do experimento, todos os testículos apresentavam tamanho nitidamente menor do que o dos testículos descidos. Essa diferença não foi observada aos 30 dias.

À microscopia, nos animais sacrificados aos 30 dias, o escore testicular médio variou entre 3 e 7, evidenciando as etapas da espermatogênese que vão desde o aparecimento das espermatogônias até a formação de espermatócitos e de espermátides ainda não diferenciadas (Fig. 1A e ^B). A mesma variação foi encontrada nos quatro grupos estudados (Fig. 2).

Aos 60 dias, os ratos do grupo 4 apresentaram o escore testicular entre 9 e 10 (média: 9,77 para o testículo direito e 9,73 para o esquerdo), caracterizando a presença de espermatozóides na luz tubular (Fig. 3A e ^B).

No grupo 1, no testículo direito (tópico), os escores foram similares aos do grupo controle (media: 9,88). No entanto, no testículo esquerdo (retido), foram achados valores entre 3 e 7 (média: 4,53) (Fig. 4A e ^B).

No grupo 2, em ambos os testículos (tópicos), o escore variou entre 9 e 10 (média: 9,93 para o direito e 9,89 para o esquerdo) (Fig. 5A e ^B).

No grupo 3, os resultados obtidos no testículo direito (tópico) evidenciaram escores entre 4 e 10 (média: 7,15). No testículo esquerdo (retido), esses valores variaram entre 4 e 5 (média: 4,72) (Figs. 6A e ^B e ⁷).

O diâmetro tubular médio foi menor no grupo 3, inclusive em relação ao testículo tópico. Esse achado, embora estivesse presente já aos 30 dias, foi mais evidente aos 60 dias do experimento (Fig. 8).

DISCUSSÃO

• Da amostra:

Foi utilizado o rato, por ser um animal de pequeno porte, padronizável, de fácil manejo em laboratório, de custo acessível e um modelo consagrado para estudos da função testicular. São bem conhecidas as características da população celular dos túbulos seminíferos de ratos adultos e pré-puberais ^{9,10,11,31,32,62}.

• Do procedimento

Tendo em vista a grande variação na literatura quanto à época da descida testicular no rato,^{23,26,29,30,42,56} em uma primeira fase deste trabalho, foi observada a descida de 50 testículos. Destes, 24% desceram entre o 14°. e o 15°. dias de vida, o que nos levou a estabelecer o nono dia para a produção da criptorquia, objetivando uma boa margem de segurança antes da descida testicular normal.

A técnica original utilizada para a produção da criptorquia experimental (fechamento do anulo inguinal superficial com dois pontos separados de fio inabsorvível), teve como objetivos: ser de fácil execução, mesmo em animais bem jovens, ser eficaz e preservar a morfologia do testículo retido. Outras técnicas freqüentemente usadas, como a secção do gubernaculum testis⁴¹ ou a fixação do testículo na parede abdominal⁵¹, podem provocar alterações morfohistológicas. A primeira, por interferir na diferenciação androgênica^5,24 e a outra, por causar reações inflamatórias significantes¹³.

A ciclofosfamida é, em geral, empregada em doses altas para o tratamento inicial da indução e em doses baixas para a administração crônica, nos esquemas de manutenção. A dose para uso diário varia entre 50 e 100 mg/m² de superfície corporal⁶³. Quando administrada a crianças abaixo de um ano de idade, a dose deve ser reduzida à metade⁴⁵. Nos ratos com 14 dias de vida, idade que corresponde a cerca de um ano no ser humano, não foi tolerada dose acima de 25 mg/m²/dia. A aplicação da droga durante 14 dias consecutivas, em dose baixa, procurou reproduzir os esquemas utilizados clinicamente para manutenção, no tratamento do câncer,

O estado do epitélio germinativo é o parâmetro mais sensível da função testicular³⁵. A avaliação de suas alterações pode ser feita por meio da contagem do número de espermatogônias ou pela presença ou não de espermatozóides na luz tubular, juntamente com a determinação do diâmetro médio dos túbulos seminíferos^30,36,38,54.

No presente trabalho, além da medição do diâmetro tubular médio, o estudo da maturidade do epitélio germinativo foi feito pelo escore de JOHNSEN²⁵, modificado por SALMAN e col.⁵¹. Dando-se um escore para cada secção tubular, baseado na presença ou ausência de todas as células germinativas (e não apenas espermatogônias ou espermatozóides), é possível avaliar a espermatogênese quantitativamente e de modo mais preciso.

• Dos resultados

Embora a criptorquia seja reconhecida já há alguns séculos e apesar das numerosas pesquisas desenvolvidas em todo o mundo, o mecanismo da infertilidade em pacientes criptorquídicos continua a ser objeto de questionamentos. Sobretudo nos casos de criptorquia unilateral, onde diversas hipóteses tentam explicar porque o testículo retido afeta a gônada escrotal contralateral.

Diversas teorias têm sido propostas para a explicação desse efeito bilateral: disgenesia bilateral^17,33, estimulação hormonal deficiente^19,21,22,28, anormalidades cromossômicas^2,46 e dano imunológico. ^{36,37,50,51,61}

Experimentalmente, a produção de orquite unilateral⁶⁰, torção testicular unilateral^20,38,57,64 e criptorquia unilateral^36,40,51,55 tem sido utilizada para provocar alterações histológicas no testículo contrai ateral.

Considerando que, no modelo experimental usado em nossas observações, o testículo não descido é normal antes do fechamento do anulo inguinal superficial; a degeneração do testículo escrotal não pode ser congênita e, portanto, deve ser secundária à degeneração do testículo retido.

Nos animais analisados no presente estudo, os resultados evidenciaram que no grupo 1 (criptorquia e ciclofosfamida), o testículo direito (tópico) foi significantemente maior do que o esquerdo (retido), tanto aos 30 quanto aos 60 dias de vida. Valores semelhantes foram encontrados no grupo 3 (criptorquia apenas). No entanto, quando foi feita a comparação entre os grupos 1 e 3, para que se pudesse avaliar o efeito da ciclofosfamida entre os criptorquídicos, verificou-se que o testículo direito era significantemente maior no grupo 1. Quanto ao testículo não descido (esquerdo), não foi observada diferença significante entre os dois grupos, em nenhuma ocasião.

Aparentemente, o testículo tópico do grupo 1 foi preservado dos efeitos degenerativos do testículo distópico.

Nos grupos 2 (ciclofosfamida apenas) e 4 (controle) não houve diferença significante entre os testículos direito e esquerdo, o que já era esperado, uma vez que ambos eram tópicos. Da mesma forma, ambos' eram maiores aos 60 dias, o que mostrou apenas o crescimento normal ocorrido no período. A comparação entre os grupos 2 e 4, para avaliação do efeito da ciclofosfamida entre os animais não criptorquídicos, não evidenciou diferenças significantes entre os mesmos.

Ao que tudo indica, a ciclofosfamida não produziu alterações na espermatogênese dos ratos do grupo 2.

A comparação entre os grupos 1 e 2 mostrou que a presença da criptorquia, entre os ratos que receberam a ciclofosfamida, provocou uma diferença evidente, demonstrada pelo fato de que o testículo esquerdo no grupo 1 (retido), aos 60 dias de vida, era significantemente menor do que no grupo 2 (ambos tópicos),

Finalmente, a comparação entre os grupos 3 e 4, para avaliação do efeito da criptorquia entre os animais que não foram submetidos à ciclofosfamida, tornou bem clara a diferença entre eles, já que os valores do grupo 3 foram significantemente menores, tanto para o testículo retido quanto para o tópico.

De um modo geral, todas as alterações encontradas foram mais evidentes nos ratos com 60 dias.

Se considerarmos que fatores hormonais são agentes etiológicos improváveis na gênese das lesões testiculares encontradas na criptorquia experimental, a causa mais provável é a imunológica.

MENGEL e col. (1977)³⁶ administraram azatioprina em cães jovens, submetidos a criptorquia unilateral por três meses, e demonstraram que houve um aumento no número de espermatogônias, tanto nos testículos tópicos quanto nos retidos. A azatioprina e um agente imunossupressor de largo uso, que não provoca danos conhecidos no epitélio germinativo testicular.

Ao contrário, a ciclofosfamida causa efeitos deletérios na espermatogênese, levando á oligospermia, azoospermia e níveis aumentados de hormônio folículo-estimulante^{4,16,18,34,43,44,52} . Dependendo da dose cumulativa e da duração do tratamento, a espermatogênese pode retornar, mas o prazo é variável e pode levar alguns anos^3,7,13,48. Alguns trabalhos^6,27,49 mostraram que a espermatogênese danificada por altas doses de ciclofosfamida era recuperável se a administração fosse feita em uma única dose. Por outro lado, o uso da droga em doses mais baixas parece não provocar o mesmo efeito lesivo^14,58,59.

Os resultados observados nos animais do grupo 2 comprovam esse fato, uma vez que não foram encontradas alterações testiculares significantes em relação ao grupo 4.

Analisando os resultados obtidos em nossa pesquisa, podemos afirmar que: 1.º) Por meio da produção da criptorquia experimental unilateral, foi possível confirmar que tanto os testículos retidos quanto os tópicos sofrem alterações causadas pela posição anômala; 2.°) Uma vez que os testículos tópicos contralaterais dos animais do grupo 3 apresentam as mesmas alterações que os testículos retidos, embora menos acentuadas, pode-se depreender que tais lesões surgem mais tardiamente nos testículos tópicos; 3.°) Já que no grupo 1 não houve diferença significante entre os valores dos testículos tópicos contralaterais e os valores normais do grupo 4 (controle), esse efeito deve ser atribuído à ciclofosfamida; 4.º) Considerando que o testículo retido desencadeia um processo degenerativo, a ciclofosfamida pareceu bloquear os fatores responsáveis, resultando na continuidade do desenvolvimento dos túbulos seminíferos e na maturação das células germinativas.

Tendo em vista a diferença de resultados entre os grupos I (tratado) e 3 (não tratado) e os efeitos imunossupressores da ciclofosfamida, a hipótese deste trabalho é que, de fato, as alterações encontradas nos testículos têm origem em processos auto-imunes (Fig. 9A e ^B).

Como resultado da alta temperatura a que estão submetidos os testículos retidos, a barreira hêmato-testicular torna-se permeável, o que permite ao sistema imune entrar em contato com os antígenos testiculares, ocasionando a formação de anticorpos. Uma vez que ambos os testículos são lesados, depreende-se que o organismo reage não apenas aos antígenos modificados do testículo retido, mas também contra os antígenos originais.

Em ratos, os antígenos das células germinativas só são encontrados nos testículos quatro semanas após o nascimento, no citoplasma dos espermatócitos secundários, paralelamente com a maturação sexual¹. Esse fato está de acordo com as alterações observadas por nós, que foram mais intensas aos 60 dias de vida.

CONCLUSÕES

1. O uso crônico da ciclofosfamida, em doses baixas, em ralos jovens com criptorquia unilateral, não provocou alterações na espermatogênese e preveniu a deterioração do testículo tópico;

2. Nesses animais, o processo degenerativo prosseguiu no testículo relido.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Neil Ferreira Novo e à Profª. Dr^ª. Yara Juliano, Professores da Disciplina de Bioestatística do Departamento de Medicina Preventiva da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, pela orientação e análise estatística dos resultados desta pesquisa.

Data do recebimento: 06.08.96

Data da revisão: 10.09.96

Data da aprovação: 08.10.96

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Endereço para correspondência:

Eliane Alves

Departamento de Pediatria

Faculdade de Ciências da Saúde

Universidade de Brasília

Campus Universitário - Asa Norte

70910-900 - Brasilia - DF

*

Labina (Purina); ração para camundongos, ratos e hamsters.

1

Resumo da Tese de Doutorado aprovada no Curso de Pós-Graduação em Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da Universidade Federai de São Paulo (UNIFESP) - Escola Paulista de Medicina (EPM).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Dez 2010
• Data do Fascículo
  Mar 1997

Histórico

• Recebido
  06 Ago 1996
• Revisado
  10 Set 1996
• Aceito
  08 Out 1996