Modelo experimental de tumor de Walker

Walker’s tumoral experimental model

8 - ORIGINAL ARTICLE

MODELO EXPERIMENTAL DE TUMOR DE WALKER¹

Sandra Pedroso de Moraes²

Aguinelo Cunha³

José Alfredo dos Reis Neto⁴

Humberto Barbosa⁵

Cláudio Aurélio P. Roncolatto⁶

Renato Frediani Duarte⁷

Moraes SP, Cunha A, Reis Neto JA, Barbosa H, Roncolatto CAP, Duarte RF. Modelo experimental de tumor de Walker. Acta Cir Bras [serial online] 2000 Oct-Dec;15(4). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb.

RESUMO: Com o objetivo de padronizar normas técnicas para obtenção de modelo animal com tumor de Walker 256 e de estabelecer o número de células tumorais necessárias para que esse tumor tenha grande porcentagem de pega e longevidade, possibilitando o desenvolvimento de pesquisas em várias áreas da saúde, foi realizado trabalho em duas etapas. Na primeira foram utilizados 120 ratos para treinamento e definição da técnica. Na segunda etapa foram utilizados 84 ratos, sendo estes separados em 7 grupos (G) de 12 animais cada. O tumor, na forma ascítica, foi inoculado no tecido celular subcutâneo do dorso dos ratos com os seguintes números de células: GI, 1 x 10⁷; GII, 5 x 10⁶; GIII, 2,5 x 10⁶; GIV, 1 x 10⁶; GV, 5 x 10⁵; GVI, 3 x 10⁵ e GVII, 2 x 10⁵. Foram avaliadas a porcentagem de pega e a longevidade nos grupos. Os animais dos GI, GII, GIII e GIV obtiveram 100% de desenvolvimento tumoral, porém baixa longevidade. Os dos GV e GVI obtiveram desenvolvimento tumoral em frequência maior que 90% e longevidade satisfatória. Os do GVII não apresentaram desenvolvimento tumoral. Concluiu-se que todos os procedimentos devem ser exaustivamente treinados e que o número de células tumorais viáveis para inoculação, em tecido celular subcutâneo de ratos, deve estar na faixa entre 5 x 10⁵ e 3 x 10⁵.

DESCRITORES: Modelos animais de doenças. Neoplasias experimentais.

O carcinossarcoma 256 de Walker, descoberto por Walker em 1928¹ a partir de um adenocarcinoma de mama em rata, é mantido em vários laboratórios, por sucessivas inoculações. É um dos poucos modelos de tumores, disponíveis para estudos experimentais nas áreas médicas e biológicas em diferentes linhas de pesquisa.^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7}

Esse tumor tem a vantagem de ser facilmente obtido "in vivo" pela inoculação de células em ratos, desenvolve rapidamente e falhas de inoculação e regressão espontânea são pouco freqüentes.^1,7,8 Mas o comportamento do mesmo modifica nos sucessivos implantes¹, as técnicas de inóculo empregadas são diferentes ou não são citadas por muitos autores^1,3,4, dificultando a comparação dos resultados observados em diferentes laboratórios.³ Também tem a desvantagem de apresentar grande agressividade, crescimento muito rápido e pequeno período de latência, dificultando a avaliação da eficácia de diversos procedimentos, inclusive, da ação de drogas antitumorais.^1,7

Na maioria dos artigos consultados não se detalha a metodologia empregada para obtenção de ratos com tumor de Walker. Portanto, o objetivo deste trabalho foi padronizar normas técnicas para obtenção de modelo animal com tumor de Walker 256 e estabelecer o número de células tumorais necessárias para que ratos com esse tumor, tenha grande porcentagem de pega e longevidade, possibilitando o desenvolvimento de pesquisas em várias áreas da saúde.

MÉTODOS

Foram utilizados 204 ratos Wistar, machos, pesando entre 180-200 gramas, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de São Paulo. Os animais foram transportados em veículo e gaiolas apropriadas e permaneceram no biotério do Laboratório de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da Puc-Campinas (credenciado pelo COBEA), alojados em gaiolas de policarbonato autoclaváveis, com maravalha autoclavada, ambiente climatizado e ciclo claro/escuro de 12/12h, sendo alimentados com ração balanceada e água filtrada. Passaram por um período de adaptação de sete dias. Os reagentes, drogas e materiais de consumo utilizados, foram adquiridos em laboratórios especializados.

Primeira Etapa

Foram utilizados 120 ratos, para definição da técnica e treinamento da equipe. Animais com tumor de Walker na forma ascítica, provenientes da Universidade de Campinas, foram anestesiados com éter etílico, submetidos à tricotomia e a antissepsia abdominal com polivinil pirrolidona-iodo (PVPI), removido, em seguida, com soro fisiológico a 0,9% (SF), laparotomia mediana de 0,5cm de extensão, coleta da ascite por aspiração com seringa e agulha, prolongamento da incisão laparotômica para todo o abdomen e investigação sistematizada da cavidade peritoneal, todos os procedimentos foram feitos com técnica asséptica.

Parte do líquido ascítico coletado recebeu glicerina, na proporção de 9:1, e foi colocado em reservatórios com nitrogênio líquido à temperatura de 190^ºC negativos para conservação e a outra parte foi usada para inoculação na cavidade peritoneal de ratos.

Após a 5^a passagem "in vivo", líquido ascítico obtido pela mesma técnica descrita, diluído em SF na proporção de 1:100, começou a ser sistematicamente corado pelo azul de trypan a 0,25%, para treinamento de contagem de células neoplásicas viáveis na câmara de Neubauer. Este era imediatamente colocado em Becker e mantido dentro de caixa de isopor com gelo. Nas sucessivas inoculações intraperitoneais, para manutenção do tumor "in vivo", começaram a ser utilizadas 3x10⁵ células tumorais viáveis.

Foram feitas várias diluições de líquido ascítico em SF, com contagem de células neoplásicas viáveis, para se estabelecer a concentração de células viáveis por mililitro (ml) de solução, após 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 e 60 minutos decorridos da retirada do material da cavidade peritoneal.

À seguir, 40 ratos, separados em 2 grupos (Gm e Gsc), foram inoculados com 3 x 10⁵ células. Após tricotomia, antissepsia com PVPI e remoção com SF, em flanco direito, na região de inserção da pata trazeira com o tronco, distando aproximadamente 4cm da coluna vertebral, receberam 0,5ml do inóculo, coletado 10 a 20 minutos antes. O Gm recebeu o inóculo em plano muscular e o Gsc em tecido celular subcutâneo. A partir desse experimento foram padronizados essa técnica e o tecido celular subcutâneo, como local para inóculo em dorso. Anestesia só foi realizada nos animais submetidos a procedimento operatório.

Outros 18 animais, separados em caixas com seis, foram inoculados com 3 x 10⁵ células nos seguintes volumes: 0,3; 0,5 e 1,0 ml.

Tumor sólido, também foi empregado para inoculação em dorso de outros 10 animais. O tumor foi enucleado e a parte sem necrose foi isolada. Esta foi fatiada em fragmentos pequenos, de aproximadamente 0,3cm³, foi adicionado SF e o material foi coado em gase estéril. O líquido obtido, passou pelos mesmos procedimentos realizados com o líquido ascítico e foi inoculado como no Gsc. Todos os animais foram examinados diariamente e a região inoculada palpada.

Dez ratos inoculados intraperitonealmente (Gip) e 34 ratos inoculados em tecido celular subcutâneo do dorso (Gd), com líquido ascítico, foram submetidos à necropsia, com exame macroscópico (nos Gip e Gd) e microscópico (no Gd). Esta foi realizada por sacrifício (no Gip) ou por morte espontânea (nos Gip e Gd).

Segunda Etapa

Oitenta e quatro ratos foram separados em 7 grupos de 12 animais cada. A seguir, a ascite coletada foi diluída em SF em várias concentrações e volumes entre 0,3 a 0,5 ml, contendo os seguintes números de células viáveis para os seguintes grupos: GI, 1 x 10⁷; GII, 5 x 10⁶; GIII, 2,5 x 10⁶; GIV, 1 x 10⁶; GV, 5 x 10⁵; GVI, 3 x 10⁵ e GVII, 2 x 10⁵ foram inoculados no tecido celular subcutâneo, dentro do intervalo entre 15 a 30 minutos da coleta, com a mesma técnica e na mesma região usada para inoculação na primeira etapa. A partir do dia seguinte da inoculação, a região foi palpada diariamente até a data das mortes dos animais.

RESULTADOS

Primeira Etapa

No 6º ou 7º dia após inoculação de 3x10⁵ célulastumorais na cavidade peritoneal, todos os ratos apresentavam abaulamento do abdomen e da bolsa escrotal, conjuntivas descoradas e diminuição de movimentação nas caixas. Quando não eram submetidos à coleta da ascite e sacrificados, evoluíam para óbito em algumas horas.

Quando foi feita a contagem de células tumorais em tempos diferentes, verificou-se que até 30 minutos após a coleta, era possível obter número suficiente de células viáveis para inoculação.

Os grupos (Gm e Gsc) apresentaram evolução semelhante. Mas os tumores do Gm , à palpação, não apresentavam limites bem definidos e na laparotomia, havia invasão dos planos profundos até a cavidade peritoneal . No Gsc, os tumores eram facilmente delimitados por palpação e só havia invasão de estruturas profundas nas datas próximas à morte espontânea.

Quanto se inoculou 0,3 e 0,5ml de líquido ascítico com células tumorais, em tecido celular subcutâneo, não se notou diferenças no aspecto e na palpação dos tumores formados. A inoculação de 1ml geralmente resultou em tumores difusos, envolvendo áreas maiores.

Os tumores provindos da inoculação de células de tumor sólido apresentaram 70% de porcentagem de pega e o dia de aparecimento de tumor, à palpação, foi coincidente para todos os animais. Os de origem ascítica apresentaram 92% de pega mas a data da palpação do tumor variou em até três dias, entre os ratos desse grupo.

Nas necropsias, o tumor inoculado intraperitonealmente (Gip) não apresentou comprometimento visceral macroscópico. Nos animais sacrificados mais precocemente a ascite tinha aspecto seroso e no período pré-óbito ou pós-óbito espontâneo a ascite adquiria aspecto serosanguinolento ou sanguinolento. Os ratos do Gd apresentaram, ao exame macroscópico, tumores com volume médio de 5cm³, duros, geralmente com ulceração da pele adjacente, facilmente enucleados após incisão da pele, às vezes envolvendo planos musculares. Ao corte observou-se necrose central e não havia cápsula bem definida. Foram encontradas metástases em baço, fígado, pulmão, medula óssea, em todos animais e comprometimento de cadeias linfáticas, que se manifestavam de forma tumoral, em ilíaca (94%), inguinal (47%) e aórtica (34%). Não foram encontradas metástases em rim, cérebro e testículo. À microscopia foram encontradas células redondas indiferenciadas, pequenas, em arranjo difuso, com núcleos arredondados, de cromatina vesiculosa, grosseira e nucléolo pequeno. O citoplasma era escasso. Havia grande índice mitótico com infiltração de tecido muscular adjacente e ausência de cápsula. Havia também extensas áreas de necrose. No pulmão a infiltração era de padrão intersticial (septal), sinusoidal em fígado e intersticial em baço. Portanto essa neoplasia é indiferenciada, de pequenas células redondas, sem componente sarcomatoso, fusocelular.

Segunda Etapa

Todos os ratos dos grupos I a IV apresentaram desenvolvimento tumoral (100%), porém baixa longevidade (Fig. 1). Os tumores começaram a ser palpados a partir do 3º dia pós inóculo e apresentaram área de necrose central a partir do 8º dia, em 80 a 90% dos animais desses grupos.

Nos grupos V e VI mais de 90% dos animais apresentaram desenvolvimento tumoral e nesses grupos a longevidade foi maior (Fig. 2). O início da palpação tumoral ocorreu geralmente no 6º ou 7º dias pós inóculo. A área de necrose tumoral começou a aparecer no 15º dia, com uma porcentagem de 50 a 60% dos animais desses grupos.

Nenhum dos ratos do GVII apresentou tumor palpável.

DISCUSSÃO

O tumor de Walker é um bom modelo experimental, de fácil aquisição no nosso meio, mas que apresenta comportamento biológico extremamente variável, dependendo do laboratório de origem.

Para utilização desse modelo, em linhas de pesquisa, torna-se necessário conhecer previamente seu comportamento e sua evolução. Alguns pesquisadores tem bastante conhecimento desse tumor, mas nos periódicos científicos praticamente não se encontram esclarecimentos que permitam a reprodução desse modelo experimental sem grande dispêndio de tempo, de recursos materiais e sacrifício de grande número de animais. As poucas informações encontradas na literatura mostram a grande variabilidade do número de células tumorais inoculadas, do volume e do local de inóculo^{1,2,3,5,6,7,8,9,10,11}. Por essa razão resolveu-se investir no conhecimento e na padronização de todos os procedimentos experimentais.

O animal de experimentação utilizado tem sido ratos Wistar^{1,2,5,6,7,9,10} ou Sprague-Dawley^3,8,11, com evolução tumoral semelhante.

Utilizou-se nesta pesquisa ratos Wistar, de fácil aquisição no nosso meio.

A contaminação bacteriana tem sido responsabilizada pela regressão de alguns tumores inoculados em dorso de ratos, conduzindo alguns pesquisadores à adição de antibióticos ao líquido ascítico inoculado.⁹

Desde a primeira fase deste trabalho, optou-se pela realização das operações em condições assépticas, considerando-se que a prevenção fosse a melhor forma de se evitar a contaminação. A laparotomia permitiu a coleta de maior volume de ascite e a avaliação das características da cavidade peritoneal. A manutenção de células tumorais congeladas tornou possível o resgate do tumor estudado, caso as suas características modificassem nas sucessivas inoculações.

Na literatura^6,9 são apontados números de 1x10⁷ e 2x10⁵ células tumorais viáveis, como adequados para inoculação intraperitoneal em ratos Wistar, produz ascite e a morte dos animais em 7 a 10 dias. Para a inoculação em dorso^2,5,6,7,8,9 são utilizadas números de células que variam entre 1,5x10⁵ a 1x10⁷.

No estudo piloto deste trabalho foram feitas algumas variações no número de células inoculadas intraperitonealmente, mas optou-se por definir o número de 3x10⁵, que permitia o diagnóstico clínico no 6º ou 7º dia pós inóculo, das células originárias da Universidade de Campinas. A contagem de células em tempos diferentes foi importante para o conhecimento da freqüência da morte celular "in vitro", que ocorria mesmo mantendo o líquido em isopor com gelo, e para facilitar o cálculo das diluições e estabelecer o número de células, que atendesse às necessidades do momento. Inicialmente empregamos também 3x10⁵ células tumorais para inóculo no dorso.

Os inóculos, para obtenção de tumor sólido, podem ser implantados em várias regiões corporais, mas geralmente são feitos em região dorsal dos ratos. Quando injetados em tecido celular subcutâneo, na região escapular³, na parte posterior ao pescoço⁵ ou em flanco, na região de inserção da coxa com o tronco^8,9, áreas com pele mais frouxa. Quando injetados por via intramuscular, tem sido feito no músculo flexor da coxa.^7,9 Esta última localização, quando o tumor cresce, limita a movimentação animal.

Neste trabalho preferiu-se inocular no flanco, região que aparentemente não causa dor e nem limitação funcional. Após a contenção do rato por um funcionário, o material previamente preparado para inóculo, com seringa de 1ml e agulha de 3x4,5mm, era injetado numa prega de pele formada entre os dedos polegar e indicador do pesquisador na área frouxa de inserção da pata com o tronco.

O material para inoculação, contendo células de tumor de Walker, para formação de tumor sólido, pode provir de ascite^5,6,9,11 tumor sólido fragmentado^1,3,9,11, tumor sólido fragmentado e coado⁶ ou de tumor sólido fragmentado, centrifugado e coado⁹.

Também tentou-se associar esta última técnica à fragmentação do tecido com liquidificador, mas sem a centrifugação, por indisponibilidade de centrífuga refrigerada, houve grande destruição celular e não se conseguiu obter número suficiente de células neoplásicas viáveis, método esse que foi abandonado.

Para início desta pesquisa utilizou-se ascite ou tumor sólido, fragmentado com bisturi e coado. Nos trabalhos com tumor de Walker, é necessário que o Centro de Pesquisas sempre avalie, no seu laboratório, o tumor adquirido. Na forma ascítica, quando aparecem os primeiros sinais clínicos, há progressão rápida do tumor e óbito. Se o pesquisador não examinar os animais, várias vezes ao dia, certamente não conseguirá coletar ascite. Com o conhecimento da evolução do tumor e com a padronização do número de células inoculadas, é possível prever a data do surgimento dos sinais clínicos e a data ideal para coleta da ascite.

Neste trabalho, durante estudo piloto, alguns animais receberam inóculo intraperitoneal com 3x10⁵células, provenientes da Universidade de São Paulo, apresentaram tumor ascítico já no 4º dia pós inóculo, com comportamento muito agressivo e óbito precoce, material esse que não foi mais empregado.

Deve haver treinamento de vários membros da equipe para que, simultâneamente, cada um participando de um procedimento, consiga coletar, contar e inocular células tumorais no menor tempo possível. Após 30 minutos da coleta, grande número de células são inviáveis, o que poderá comprometer o resultado do inóculo.

Em relação ao volume e à profundidade do inóculo os autores têm utilizado 0,1ml⁸; 0,3ml¹⁰; 0,5ml¹; 0,1ml a 0,5ml⁹ e 1ml⁷ e a via subcutânea^{1,2,3,5,8,9,11} ou intramuscular ^6,7,10. Alguns autores referem que a via subcutânea apresenta crescimento mais lento e superficial, aparecimento de metástases mais tardias, porém com maior necrose⁹. Do ponto de vista imunológico, animais inoculados por essa via apresentam maior resposta celular específica.⁶

Neste trabalho percebeu-se que inoculação de volume maior que 0,5ml favorecia a formação de tumor mais disseminado. Provavelmente no momento da injeção, o líquido penetrava com mais facilidade nos tecidos. Quanto à profundidade, como esse tumor tem grande porcentagem de pega, a via subcutânea foi a preferida, pois retardava o aparecimento de metástases e/ou invasão da cavidade peritoneal e a extensão de necrose não apresentava grande diferença, quando comparada com a inoculação por via intramuscular.

A obtenção de tumor sólido por inoculação com suspensão de células é mais eficiente e permite calcular o número aproximado de células. Quando essas células provém de ascite, diminui a possibilidade de contaminação bacteriana e consequentemente a necrose e a ulceração da pele aparecem mais tardiamente.⁹

Neste experimento, com a manipulação asséptica do material, encontrou-se boa porcentagem de pega com a inoculação de células originárias de ascite ou de tumor sólido. Com este último houve a vantagem de se poder programar a data da retirada das células, pela maior longevidade dos animais. Acredita-se que se forem evitados a contaminação e muitos implantes sucessivos de tumor sólido, é perfeitamente possível utilizar essa forma de tumor para inoculações em dorso.

A literatura descreve como adenocarcinoma o tumor de Walker original e outras várias gerações mantidas pelo pesquisador. Posteriormente, observou-se que algumas gerações não apresentavam mais estrutura glandular. Às vezes aparecia células redondas pequenas, bem coradas e com núcleos uniformemente corados. Outras vezes as células eram grandes, alongadas e com núcleos pouco corados, com quantidade variável de estroma.⁹

Neste trabalho observou-se que o tipo histológico encontrado não apresenta características de adenocarcinoma ou carcinossarcoma e sim de tumor indiferenciado de pequenas células redondas, provavelmente por modificações nas sucessivas inoculações, mas com alguma semelhança com aquelas descritas por EARLE¹ .

GONÇALVES e cols.⁹ avaliaram métodos de mensuração de tumores de Walker, implantados no tecido celular subcutâneo do dorso, relacionando-os com seu peso. Setenta ratos Wistar, separados em seis grupos, receberam número de células variável numa faixa entre 1,7x10⁵ a 2,5x10⁵ . Seis dias após a inoculação o tumor era palpado em 63 animais, os outros sete foram desprezados. Posteriormente, inoculou-se em mais 50 ratos, com a mesma técnica, separados em cinco grupos, que receberam 5x10⁴; 1x10⁵; 1,5x10⁵; 2x10⁵ e 2,5x10⁵. Seis dias após, o tumor era palpado em 45 animais, sendo os restantes desprezados. Com o sacrifício dos animais, não foi possível calcular a porcentagem de pega em cada grupo.

Neste trabalho foi verificado que, com as células empregadas para inoculação, não se consegue pega com 2x10⁵ células. Provavelmente por ter comportamento menos agressivo que o dos autores referidos anteriormente.

CONCLUSÕES

1. A utilização desse modelo animal implica em se padronizar metodização para todos os procedimentos experimentais e em se conhecer o comportamento do tumor no ambiente físico da pesquisa.

2. O número ideal de células ascíticas viáveis para inoculação em flanco de ratos Wistar é 3x10⁵ ,em tumores de Walkerdesta geração. Assim consegue-se grande porcentagem de pega com maior longevidade animal, possibilitando avaliações de diversas terapêuticas, inclusive da ação de drogas antineoplásicas.

AGRADECIMENTOS

Luci R. Bevilacqua e Sérgio Murilo de Mello Borges do Laboratório de Técnica Cirúrgica do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina da USP, pela doação de células tumorais e informações prestadas e ao TEC-LAB Prod. e Equip. para Laboratório e ao Laboratório de Análises Clínicas DMS Burnier pelo fornecimento de materiais e trabalhos executados.

Moraes SP, Cunha A, Reis Neto JA, Barbosa H, Roncolatto CAP, Duarte RF. Walker’s tumoral experimental model. Acta Cir Bras [serial online] 2000 Oct-Dec;15(4). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb.

ABSTRACT: The aim of this work was standardize technical norms to obtain a model of Walker 256 tumor in animals and get the tumorous cells number needed to increase the tumorous join percentage and longevity, it makes possible the research development in several health areas. The work was realized in two stages. In first were used 120 rats to crew’s training and technicals definitions. In second stage were used 84 rats, these separated in 7 groups (G) with 12 animals each one. The tumor, in ascitic form was inoculated on subcutaneous cellular tissue on dorsal of rats with the follow number of cells : GI, 1 x 10⁷; GII, 5 x 10⁶; GIII, 2,5 x 10⁶; GIV, 1 x 10⁶; GV, 5 x 10⁵; GVI, 3 x 10⁵ e GVII, 2 x 10⁵. Were evaluate the join percentage and longevity in groups. The animals of GI, GII, GIII e GIV obtained 100% of tumorous development, however low longevity. The two GV and GVI had tumorous development often high that 90% and satisfactory longevity. The GVII didn’t show tumorous development . The conclusion was made all procedures must be exhaustivelly trained and the number of tumorous cells passable to inoculation, in subcutaneous cellular tissue of rats, must be in the range of 5x10⁵ and 3x10⁵ .

SUBJECT HEADINGS: Disease models animal. Neoplasms experimental.

Endereço para correspondência:

Sandra Pedroso de Moraes

Rua Boaventura do Amaral, 684/131

Campinas - SP

13015-191

e-mail: [e-mail]

Data do recebimento: 08/08/2000

Data da revisão: 12/09/2000

Data da aprovação: 02/10/2000

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1

. Trabalho realizado no Laboratório de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da Pontifícia Universidade Católica de Campinas.

2

. Profª. Doutora, Titular Depto. de Cirurgia da PUC – Campinas.

3

. Prof. Assistente Depto. de Cirurgia da PUC – Campinas.

4

. Prof. Livre Docente, Titular Depto. de Cirurgia da PUC – Campinas.

5

. Biólogo, PUC - Campinas.

6

. Enzimologista, Campinas.

7

. Patologista - Lab. de Anal. Clín. DMS Burnier, Valinhos.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  08 Nov 2000
• Data do Fascículo
  Dez 2000

Histórico

• Recebido
  08 Ago 2000
• Revisado
  12 Set 2000
• Aceito
  02 Out 2000