TRANSPLANTE DE ILHOTAS PANCREÁTICAS EM DISPOSITIVOS DE IMUNOISOLAMENTO CELULAR: RESULTADOS INICIAIS

PANCREATIC ISLET TRANSPLANTATION IN CAPSULES OF CELLULAR IMMUNOISOLATION: PRELIMINARY RESULTS

TRANSPLANTE DE ILHOTAS PANCREÁTICAS EM DISPOSITIVOS DE IMUNOISOLAMENTO CELULAR - RESULTADOS INICIAIS¹

PANCREATIC ISLET TRANSPLANTATION IN CAPSULES OF CELLULAR IMMUNOISOLATION. PRELIMINARY RESULTS

Mente E. D.², Ceneviva R.³, Netto J. C.⁴

Resumo: O transplante de pâncreas e de ilhotas pancreáticas vem apresentando grande desenvolvimento nos últimos anos. O isolamento das ilhotas em cápsulas com membrana semi-permeáveis pode ser tratamento de escolha para o diabetes, pois dispensa o uso de imunossupressores.

O material ideal para a confecção de uma cápsula para o isolamento celular ainda permanece um sonho. Um novo material a base de látex natural foi implantado no subcutâneo de ratos normais e diabéticos para estudar a biocompatibilidade e a neoformação vascular. A análise após 21 dias de implante mostrou intensa formação capilar na interface membrana-tecido e pouco tecido fibrótico. Estes achados iniciais mostram que o material pode ter algum potencial para a confecção de dispositivos de isolamento celular.

Descritores: Transplante de ilhotas pancreáticas, imunoisolamento celular

Key Words: Pancreatic islet cell transplantion, cellular immunoisolation

Introdução: O diabetes mellitus é uma doença que acomete milhões de indivíduos em todo o mundo, causando alta morbidade decorrente principalmente da microangiopatia e lesões secundárias.

O advento da insulinoterapia na década de 20 levou a uma diminuição drástica das situações de risco de vida pela hiperglicemia. O aparecimento de novos hipoglicemiantes orais e a melhora no acompanhamento clínico também contribuíram para um maior controle metabólico da doença. Entretanto, apesar do controle rigoroso do metabolismo dos carboidratos diminuir o risco de aparecimento de complicações secundárias, aumentou muito o número de episódios de hipoglicemias graves, particularmente em pacientes com diabetes tipo I.

O transplante de pâncreas e de ilhotas pancreáticas surgiu como uma alternativa para o controle permanente da glicemia e prevenção das complicações secundárias do diabetes, sem risco de hipoglicemia^1,2. O transplante de pâncreas é um procedimento cirúrgico delicado e há necessidade de contínua imunossupressão, sendo realizado atualmente nos casos de transplante simultâneo de rim ou fígado e em alguns pacientes com diabetes tipo I de difícil controle³.

Apesar de grande avanço nos últimos anos, o transplante de ilhotas pancreáticas não tem alcançado os resultados esperados. Número inadequado de ilhotas transplantadas e o efeito tóxico e diabetogênico das drogas imunossupressoras são os principais motivos de insucesso desse tipo de tratamento. O transplante de ilhotas em conjunto com outros órgãos (rim, fígado, medula óssea) é factível e pode reverter o diabetes, mas dificuldades no diagnóstico e tratamento precoces da rejeição impedem seu uso mais rotineiro⁴.

Novas perspectivas com resultados animadores estão sendo criadas com o transplante de células isoladas em cápsulas com membrana semipermeável^5,6 ou protegidas por material não-imunogênico⁷, eliminando a necessidade do uso de drogas imunossupressoras.

O desenvolvimento de dispositivos de isolamento celular para uso clínico ainda depende da resolução de questões essenciais, como a disponibilidade de tecido ou células para o encapsulamento, a manutenção da viabilidade e funcionamento dessas células e a proteção contra a rejeição^8,9.

O implante de biomateriais provoca no organismo uma reação de corpo estranho, resultando na formação de uma cápsula fibrosa pouco vascularizada, que isola o material¹⁰, impedindo o transporte de oxigênio e nutrientes¹¹.

Em modelos animais demonstrou-se que o aumento da vascularização local melhora o suprimento de nutrientes para as células transplantadas^12,13,14 e diminui a distância para a difusão de oxigênio.

A pesquisa de novos materiais que induzam a neovascularização no local do implante poderá garantir o funcionamento permanente de células encapsuladas. O implante prévio de dispositivo para que ocorra a neovascularização e posterior enxerto das células poderão diminuir o período de isquemia a que elas ficam expostas, proporcionando melhores resultados¹⁵.

Com o objetivo de desenvolver um dispositivo de isolamento celular com membrana de látex natural, inicialmente estudou-se a neovascularização e biocompatibilidade deste material em ratos normais e diabéticos.

Métodos

Delineamento do Experimento: Foram utilizados ratos Wistar machos fornecidos pelo Biotério Central da FMRP, com peso entre 200 e 250 g. Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos( I e II ). Foram implantadas membranas de látex de 0,5 x 1 cm e espessura de cerca de 100 µm, com e sem polilisina a 0,01%, no subcutâneo do dorso dos ratos, dividindo os grupos em a e b respectivamente. As membranas foram retiradas em bloco com o tecido adjacente (subcutâneo e musculatura) após 21dias, totalizando 8 blocos de cada rato. O material foi imediatamente fixado em formaldeído a 10% tamponado e enviado para estudo histológico, onde foram analisados 4 cortes de cada bloco. Durante o período em que permaneceram no biotério, os animais ficaram em gaiolas individuais e receberam dieta normal para ratos e água ad libitum.

Grupo I - Ratos normais (n=4)

a) membrana com polisina

b) membrana sem polisina

Grupo II - Ratos diabéticos tratados com insulina (n=4)

a) membrana com polisina

b) menbrana sem polisina

Ratos diabéticos: Para a indução de diabetes foi utilizada a droga aloxana (Sigma Chemical Company) dissolvida em tampão citrato 0,01 M, pH 4,5, a uma concentração de 2%. Essa solução foi utilizada imediatamente após seu preparo. A dose de 35 mg/kg de peso foi injetada por via endovenosa, através da veia peniana, em cada um dos ratos. Os animais haviam sido mantidos em jejum alimentar, não-hídrico, por 15 horas, e submetidos a dosagem de glicemia antes da administração da droga.

A confirmação do diabetes foi feita mediante dosagem da glicemia no 1° e 4° dias após a injeção da droga, sendo então iniciado tratamento com insulina NPH (1 UI/70 g de peso/dia, dividida em duas doses) por via subcutânea. Ratos não diabéticos foram descartados.

A glicemia de cada rato também foi dosada antes da eutanásia.

Coleta de sangue e dosagem da glicose plasmática: O sangue obtido da cauda dos animais foi imediatamente centrifugado a 1000 x g em centrífuga Eppendorf refrigerada. Foi utilizado 0,1 ml do plasma sobrenadante de cada amostra para a dosagem da glicose plasmática pelo método da glicose-oxidase, automatizado em um analisador de glicose da Beckman Instruments Inc., Palo Alto (USA).

Biomembrana: A biomembrana foi confeccionada com látex natural extraído da seringueira (Hevea brasiliensis) pelo processo tradicional conforme técnica descrita por Mrué²⁰.

Implante das membranas: Os animais foram submetidos a anestesia inalatória com éter sulfúrico.

Após tricotomia e assepsia com tintura de iodo, em cada animal foi realizada uma incisão na linha média do dorso, de aproximadamente 4 cm, e dissecção do subcutâneo bilateralmente. Em cada animal foram colocadas duas membranas de cada lado da incisão, sendo as de um lado com polilisina e as do outro sem polilisina. Uma das faces da membrana permaneceu em contato com a musculatura, e a outra com o subcutâneo.

Após a colocação das membranas foi realizada sutura contínua da pele e subcutâneo com fio absorvível monofilamentar (Monocryl 5-0, Ethicon). Os pontos foram ancorados na fascia muscular, com o objetivo de isolar-se as duas lojas, impedindo uma possível migração das membranas de um lado a outro.

Estudo histológico: O bloco de tecido removido para estudo histológico foi fixado por 24 horas em formaldeído a 10% tamponado e enviado para inclusão em parafina, sendo posteriormente realizados cortes de 5µm e coloração com tricrômico de Masson para avaliação da biocompatibilidade do material e análise da neovascularização.

Resultados

Aspecto Morfológico Macroscópico: Após período de 21 dias, os dois tipos de membranas (com e sem polilisina) mostraram-se biocompatíveis com o organismo, nos animais normais e diabéticos. Observou-se aumento da vascularização local. Não houve aderências com o tecido adjacente, sendo as membranas facilmente removíveis (Fig. 1).

Histologia: A análise dos corters histológicos em todos os animais mostrou que na interface tecido-membrana houve formação de epitélio constituído por células alongadas que lembravam endotélio, e também infiltrado mononuclear. No tecido frouxo de cerca de 40 µm da membrana havia discreto infiltrado inflamatório crônico, poucos fibrócitos e fibroblastos, discreta fibrose e aumento moderado da quantidade de capilares (Fig. 2).

Discussão: O transplante de ilhotas provavelmente tornar-se-á o tratamento de escolha para o diabetes neste século, por algumas razões essenciais: é um procedimento tecnicamente simples, há possibilidade de enxerto xenogênico isolado e vem ocorrendo melhora nas técnicas de isolamento e no tratamento imunossupressor^16,17.

O uso de dispositivos de isolamento celular através de membrana semipermeável ou material não-imunogênico vem trazendo resultados animadores para o controle permanente dos níveis glicêmicos^5,6.

A membrana semipermeável protegeria as células encapsuladas da reação de rejeição imune do hospedeiro e permitiria o acesso de oxigênio e nutrientes provenientes do tecido ao redor, além da remoção de produtos do metabolismo. Este dispositivo permitiria também o transplante xenogênico.

O implante de órgãos biohíbridos provoca no organismo uma reação de corpo estranho, havendo a formação de uma cápsula avascular que bloqueia as trocas entre as células dentro do dispositivo e o tecido onde foi implantada^10,11.

As ilhotas de Langerhans são supridas, in vivo, por uma intensa rede capilar, e recebem oxigênio e nutrientes em níveis próximos aos arteriais. É essencial para a sobrevida e funcionamento das células dentro do dispositivo que ocorra uma adequada vascularização local, pois recebem oxigênio e nutrientes por difusão^18,19.

A pesquisa de novos materiais que induzam a neovascularização no local do implante poderá garantir o funcionamento permanente das células encapsuladas.Um novo material a base de látex natural vem sendo estudado, e os resultados iniciais mostraram atividade na reconstituição tecidual e na angiogênese, com possível intensificação desse efeito com o uso de polilisina²⁰.

O presente estudo analisa alguns aspectos da biocompatibilidade do implante e da histologia para avaliação da neovascularização na interface da membrana de látex implantada e o tecido adjacente em ratos normais e diabéticos.

Análises preliminares, 21 dias após o implante, mostraram que o material foi bem aceito, não tendo ocorrido rejeição, e macroscopicamente houve aparente aumento da vascularização local.

A análise dos cortes histológicos mostrou formação neovascular e pouco tecido fibrótico entremeado de quantidade variável de capilares. A manutenção deste padrão ao longo do tempo pode significar que o material tem grande potencial para a confecção de dispositivos de isolamento celular.

Conclusões: O implante de membrana de látex natural no subcutâneo de ratos normais e diabéticos não mostrou rejeição.

Houve intensa neoformação vascular na interface membrana-tecido nos primeiros 21 dias.

Abstract: There have been great developments in pancreas and pancreatic islet cell transplantion in the last few years. The isolation of the islet cells in capsules with semi-permeable membranes may become ideal means of treating diabetes, and the use of immunossuppression could be avoided.

The ideal material for the confection of the capsules has remained a dream. A new material derived from natural latex was implanted in the subcutaneous tissue of normal and diabetic rats to study the biocompatibility and the vascular neoformation. After 21 days, an analysis of the implant showed intense vascular neoformation on the membrane-tissue interface and little fibrotic tissue. The inicial results show great promise for utilization of this material in capsules for the isolation of cells.

• 1. Kelly WD, Lillehei RC, Merkel FK, Idezuki Y, Goetz FC. Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nefhropathy. Surgery 1967, 61(6):827-37.
• 2. Robertson RP, Sutherland DER. Pancreas transplantation as therapy for diabetes mellitus. Annu Rev Med 1992, 43:395-415.
• 3. London NJM, Robertson GSM, Chadivick RD, Johnson PRV, James JA & Bell PRF. Human pancreatic islet isolation and Transplantation. Clinical Transplantation 1997, 8:421-59.
• 4. Rilo HLR, Carroll PB, Shapiro R, Jordan M, et al. Human islet transplantation: Results of the first 37 patients. Transplant Proc 1995, 27(6):3162-3.
• 5. Lacy PE, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeou A, Gentile FT, Dionne KE. Maintenance of normoglycemia in diabetic mice by subcutaneous xenografts of encapsulated islets. Science 1991, 254:1782-4.
• 6. Lanza RP, Kühtreiber WM, Ecker D, Staruk JE, Chick WL. Xenotransplantation of porcine and bovine islets without immunosuppression using uncoated alginate microspheres. Transplantation 1995, 59:1377.
• 7. Panza JL, Wagner WR, Rilo HLR, Rao RH, Beckman EJ, Russel AJ. Treatment of rat pancreatic islets with reative PEG. Biomaterials 2000, 21:1155-64.
• 8. Reach G. Bioartificial pancreas. Transplant Proc 1994, 26(2):397-8.
• 9. Colton CK. Engineering challenges in cell-encapsulation technology. Trends Biotechnol 1996, 14:158-62.
• 10. Anderson JM. Inflammatory response to implants. Trans Am Soc Artif Intern Organs 1988, 34:101-7.
• 11. Scharp DW, Mason NS, Sparks RE. Islet immunoisolation: the use of hybrid artificial organs to prevent islet tissue rejection. World J Surg 1984, 8:221-9.
• 12. Sandler S, Jansson L. Blood flow measurements in autotransplanted pancreatic islets of rat: impairment of the blood perfusion of the graft during hyperglycemia. J Clin Invest 1987, 80:17-21.
• 13. Jansson L, Sandler S. Influence of hyperglycemia on blood perfusion of autotransplanted pancreatic islets in diabetic rats. Diabetes 1989, 38(Suppl. 1):196-98.
• 14. Menger MD, Jaeger S, Walter P, Feifel G, Hammersen F, Messmer K. Angiogenesis and hemodynamics of microvasculature of transplanted islets of Langerhans. Diabetes 1989, 38(Suppl.1): 199-201.
• 15. De Vos P, Hillebrands JL, De Haan BJ, Strubbe JH, Van Schilfgaarde R. Efficacy of a prevascularized expanded polytetrafluoroethylene solid support system as a transplantation site for pancreatic islets. Transplantation 1997, 63:824-30.
• 16. Ricordi C & Hering BJ. Human islet allotransplantation. Current opinion in Organ Transplantation 1988, 3: 274-8
• 17. Shapiro AM, Hukey JRT, Ryan CA, Korbut GS, Toth C, Warnoch GH, Kneteman NM & Rajott RV. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticord-free immunosupressive regimen. New England Journal of Medicine 2000, 343: 230-8.
• 18. Lifson N, Kramlinger KG, Mayrand FF, Lender EJ. Blood flow to the rabbit pancreas with special reference to the islets of Langerhans. Gastroenterology 1980, 79:466-73
• 19. Bonner-Weir S, Orci S. New perspectives on the microvasculature of the islets of Langerhans in the rat. Diabetes 1982, 31:883-89.
• 20. Mrué F. Neoformação tecidual induzida por biomembrana de látex natural com polilisina. Tese de doutorado 2000, FMRP-USP.

1

Trabalho realizado no Departamento de Cirurgia e Anatomia e Departamento de Bioquímica e Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP)

2

Aluno de Pós-Graduação da Área de Clínica Cirúrgica e Médico Assistente

3

Professor Titular do Departamento de Cirurgia e Anatomia

4

Professor Adjunto do Departamento de Bioquímica e Imunologia

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Jun 2002
• Data do Fascículo
  2001