Avaliação de dois modelos experimentais de isquemia e reperfusão cerebral em ratos com oclusão temporária carotídea associada ou não à oclusão vertebral

Evaluation of two brain ischemia and reperfusion experimental models in rats with carotid temporary occlusion associated or not to vertebral occlusion

ARTIGO ORIGINAL

Avaliação de dois modelos experimentais de isquemia e reperfusão cerebral em ratos com oclusão temporária carotídea associada ou não à oclusão vertebral¹

Evaluation of two brain ischemia and reperfusion experimental models in rats with carotid temporary occlusion associated or not to vertebral occlusion

Daniela Mazza Sundefeld Tardini^I; Winston Bonetti Yoshida^II; Ethel Lourenzi Barbosa Novelli^III; Júlio Lopes Sequeira^IV

^IMestre em Cirurgia pela Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP. Residência Médica em Angiologia e Cirurgia Vascular

^IIProfessor Adjunto Livre-docente da Disciplina de Cirurgia Vascular do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da Faculdade Medicina de Botucatu – UNESP

^IIIProfessora Doutora Titular do Departamento de Química e Bioquímica do Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP

^IVProfessor Doutor Assistente do Departamento de Clínica Veterinária Da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu - UNESP

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: Avaliar a reprodutibilidade de dois modelos experimentais de isquemia e reperfusão cerebral.

MÉTODOS: 60 ratos foram distribuídos, aleatoriamente, em três grupos experimentais, com 20 animais cada: I – pinçamento temporário de artéria carótida esquerda; II – cauterização prévia das artérias vertebrais e pinçamento temporário da artéria carótida esquerda; simulado – sem isquemia nem reperfusão. Todos os animais tiveram oclusão definitiva de artéria carótida direita e os três grupos foram subdivididos em dois períodos de reperfusão: A – 60 minutos e B – 120 minutos. Os parâmetros verificados foram: medidas de pressão arterial média sistêmica e fluxo sangüíneo carotídeo; medida de malondialdeído cerebral através do teste TBARS e avaliação histológica do hemisfério cerebral submetido à isquemia e reperfusão. Foi feito também um estudo complementar com angiografia cerebral em 5 animais adicionais.

RESULTADOS: Não houve diferenças significativas nas dosagens de malondialdeído cerebral e na freqüência e gravidade das alterações histológicas cerebrais entre os três grupos. Nos grupos GI e GII, a PAM foi significantemente maior no período de isquemia. O fluxo sangüíneo entre os períodos pré e pós-pinçamento aumentou nos grupos IA e IIB, diminuiu no grupo IB e no grupo IIA manteve-se inalterado. As angiografias do estudo complementar mostraram aporte sangüíneo para cérebro através de circulação colateral.

CONCLUSÃO: Os modelos de isquemia e reperfusão estudados não demonstraram alterações consistentes de marcadores de lesão cerebral, seja quanto à produção de lipoperóxidos ou de lesões histológicas.

Descritores: Isquemia e reperfusão cerebral. Lipoperoxidação.

ABSTRACT

PURPOSE: To evaluate reproducibility of two experimental brain ischemia and reperfusion models.

METHODS: Sixty rats were randomly distributed to three experimental groups: I – (20) temporary clipping of the left carotid artery; II – (20) cauterization of vertebral arteries and temporary clipping of the left carotid artery; "Sham" – (20) simulation group, with neither ischemia nor reperfusion. All animals had permanent occlusion of right carotid artery and the three groups were subdivided into two reperfusion periods: A – 60 minutes e B – 120 minutes. Parameters verified were: mean systemic arterial blood pressure and carotid blood flow measurement; brain malondialdehyde measurement by TBARS assay and histological evaluation of the brain hemisphere submitted to ischemia and reperfusion. A supplementary brain angiography study was also conducted on 5 additional animals.

RESULTS: There was no significant difference in brain malondialdehyde dose and in frequency and severity of histological brain alterations among the three groups. In groups GI and GII, mean arterial blood pressure was significantly higher during the ischemia period. Blood flow in the periods before and after clipping increased in Groups IA and IIB, decreased in Group IB and did not alter in Group IIA. Supplementary study angiographs showed blood supply to brain through collateral circulation.

CONCLUSION: The ischemia and reperfusion models studied did not show consistent change in brain injury markers as far as lipoperoxide production and histological damage are concerned.

Key Words: Brain ischemia and reperfusion. Lipoperoxidation.

Introdução

A doença aterosclerótica das artérias carótidas pode provocar sintomas como amaurose fugaz, cefaléia ou acidente isquêmico transitório (AIT). O quadro clínico mais temido é o acidente vascular cerebral (AVC), não apenas pelas seqüelas incapacitantes que podem ocorrer, mas principalmente, pelo risco de óbito; sabe-se que, nos Estados Unidos, o AVC é a terceira causa mais freqüente de morte. Deve-se ressaltar que, no primeiro ano após a ocorrência de um episódio de AIT, há um risco de, aproximadamente, 10% de o paciente vir a apresentar AVC. Também é importante ressaltar que, os pacientes assintomáticos e portadores de estenose carotídea maior ou igual a 75% têm um risco de 3 a 5% de virem a apresentar AVC, por ano de seguimento^{1, 2}.

Estudos prospectivos importantes como o NASCET³ e European Carotid Trial ⁽⁴⁾, que focalizaram pacientes sintomáticos, e o ACAS^{5, 6, 7} e Veterans Affairs Cooperative Study Group ⁸, que selecionaram pacientes assintomáticos, demonstraram que os pacientes submetidos à cirurgia de endarterectomia de carótida apresentaram redução significativa das taxas de ocorrência de AVC em relação aos pacientes tratados clinicamente.

Entretanto, na cirurgia de endarterectomia de carótida, independentemente da técnica cirúrgica empregada, há necessidade de se promover a oclusão temporária da artéria a ser operada, o que pode, eventualmente, desencadear lesões decorrentes de isquemia cerebral de intensidade variável, seguida de reperfusão. Como manifestação clínica, poderá haver a presença de edema cerebral, caracterizando a síndrome de hiperperfusão pós-operatória, a qual, ocorre mais freqüentemente em pacientes hipertensos crônicos e /ou portadores de estenoses carotídeas maiores que 90%^{9, 10}.

Durante a fase de isquemia, ocorre diminuição do aporte de oxigênio para o tecido cerebral, levando a inibição de fosforilação oxidativa mitocondrial e a queda da produção energética celular. Uma das conseqüências dessa isquemia é a degradação dos fosfolípides da membrana celular, por ação das fosfolipases A e C, liberando grande quantidade de ácidos graxos livres (AGL). Na fase da reperfusão, os AGL acumulados no tecido cerebral, durante a isquemia, sofrem metabolização pelas vias da lipoxigenase e cicloxigenase, formando tromboxanos, prostaglandinas e superóxidos, sendo estes últimos radicais livres^{11, 12, 13, 14}. Uma importante conseqüência da formação de radicais livres é a peroxidação lipídica, a qual, se propaga na forma de uma reação em cadeia autocatalítica. Os ácidos graxos livres insaturados são bastante suscetíveis a esse processo de lipoperoxidação^{15, 12, 16}.

Na isquemia, também há maior entrada de Ca⁺⁺ para o citossol, promovendo a quebra de uma ponte peptídica da enzima xantina desidrogenase (XD) e levando à formação da enzima xantina oxidase (XO). Com a reperfusão, a xantina oxidase (XO) leva a formação de xantina e promove sua oxidação em ácido úrico, tendo como subproduto dessa reação a formação do ânion superóxido, um radical livre¹⁷. Ainda relacionado ao aumento de Ca⁺⁺ no citossol, há aumento da liberação de glutamato, um neurotransmissor excitatório que estaria aumentado no meio extracelular. Esse gradiente aumentado de glutamato extracelular na isquemia também seria um "precursor", ou seja, fonte de radicais livres, para as alterações que viriam a ocorrer durante a reperfusão^{13; 18; 19}. Da mesma forma, ocorre formação de óxido nítrico (NO) a partir da L-arginina^{20; 21; 22} pela ação da óxido nítrico sintase constitutiva (cNOS), Ca⁺⁺ dependente.

O tecido cerebral é, particularmente, susceptível às lesões por agentes oxidantes, pois possui grandes reservas de ferro e altos níveis de lipídios polinsaturados e porque possui uma pobre defesa antioxidante²³. Alguns autores observaram em estudos realizados em pacientes submetidos a endarterectomia de carótida^{24, 25, 23} que houve tanto presença de lipoperoxidação, quanto a diminuição de antioxidantes plasmáticos e concluíram que, esses resultados, poderiam ser indicativos da presença de produção de radicais livres no tecido cerebral durante a cirurgia de endarterectomia de carótida.

Os estudos experimentais são necessários não apenas para a confirmação e esclarecimento dos dados encontrados nos estudos clínicos, mas também para se encontrar os tratamentos que atenuem essas lesões. Os modelos experimentais de isquemia e reperfusão cerebral, no entanto, são variáveis e nem sempre reprodutíveis.

Em vista disso, o objetivo deste trabalho foi analisar dois modelos de isquemia e reperfusão cerebral. Para tanto, foram avaliados: a lipoperoxidação cerebral, o fluxo sangüíneo de artéria carótida esquerda, a pressão arterial média e as alterações histológicas cerebrais. Foi também realizado um estudo angiográfico cerebral complementar com o objetivo de verificar a oclusão das artérias vertebrais.

Métodos

Foram utilizados 60 ratos machos da raça Wistar, com idades entre 60 e 65 dias e com pesos entre 200g e 300g, fornecidos pelo Biotério Central do Campus de Botucatu – UNESP, tendo sido o delineamento experimental aprovado pela Comissão de Ética na Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP (Protocolo número: 150, 24/06/2002).Todos os animais foram submetidos a dissecção das artérias vertebrais e, após esse procedimento, foram aleatoriamente divididos em três grupos experimentais com vinte animais em cada um.

• GRUPO I – simulação da cauterização das artérias vertebrais e oclusão temporária, por 30 minutos, da artéria carótida comum esquerda.

• GRUPO II – cauterização das duas artérias vertebrais, seguida de um período de 24 horas de repouso. Após esse período, foi realizada oclusão temporária, por 30 minutos, da artéria carótida comum esquerda.

• SIMULADO (III) – simulação tanto da cauterização das artérias vertebrais, quanto da oclusão da artéria carótida comum esquerda.

Os animais de cada grupo foram, posteriormente, subdivididos em dois subgrupos, com dez animais cada um, de acordo com tempo de reperfusão: Subgrupo A: 60 minutos de reperfusão e Subgrupo B: 120 minutos de reperfusão. Após jejum por 12 horas os animais foram anestesiados com pentobarbital na dose de 30mg/Kg, por via intraperitoneal. Em todos os animais, realizou-se tricotomia e anti-sepsia da face anterior do pescoço e da região cervical posterior e, em seguida, foi feita incisão em linha mediana cervical posterior, próxima à base do osso occipital, com dissecção de musculatura para-vertebral e localização do corpo vertebral de C1 e de seus forames laterais, por onde foram visualizadas as artérias vertebrais. Após a dissecção das artérias vertebrais, apenas nos animais do Grupo II, foi feita a cauterização dessas artérias (Eletrocautério bipolar Imbracrios, modelo BE 200). Depois desse procedimento, estes ratos (GII) permaneceram 24 horas em repouso e foram, então, novamente anestesiados, dando seqüência às demais etapas experimentais. Nos animais dos grupos I e III a dissecção vertebral foi feita imediatamente antes da dissecção carotídea, sem o intervalo de 24 horas, entre esses procedimentos. Em todos os animais foi realizada incisão mediana na região cervical anterior e dissecção das artérias carótidas. Foi feito o cateterismo proximal da artéria carótida comum direita para medida contínua de pressão arterial média (Fisiógrafo BIOPAC, modelo MP-100). Somente nos grupos GI e GII foi aplicado, externamente na artéria carótida comum esquerda, um transdutor para medida de fluxo sangüíneo (Fluxômetro ultrassônico Transonic System Inc, modelo HT-207). O fluxo sangüíneo carotídeo foi registrado durante 10 minutos aos: 10 minutos após o início do procedimento, 10 minutos após o início da isquemia e 10 minutos após o início da reperfusão. O fluxo sangüíneo não foi registrado no grupo III, pois nesses animais não houve o período de pinçamento. A temperatura esofágica foi medida previamente ao período de isquemia e foi, novamente, verificada durante os períodos de isquemia e de reperfusão (Fisiógrafo BIOPAC, modelo MP-100). A temperatura não foi medida continuamente, mas durante aproximadamente 5 minutos em cada uma das fases experimentais, em todos os animais. Em todos os animais, procurou-se manter a temperatura corporal entre 33 e 34 graus Celsius, com auxílio de calor de lâmpada externa e do uso de compressas grandes aquecidas durante todo o experimento. Após intervalo de 20 minutos para estabilização hemodinâmica do animal, realizou-se o pinçamento temporário da artéria carótida comum esquerda por 30 minutos nos grupos GI e GII, e simulação no grupo III, com reperfusão por 60 ou 120 min, conforme os subgrupos descritos. Ao final do período de reperfusão, os animais foram sacrificados por excesso anestésico. Realizou-se, então, craniectomia e ressecção do hemisfério cerebral esquerdo para estudos bioquímicos e para análise histológica. A metade anterior do hemisfério cerebral esquerdo (200µg) foi pesada, identificada e resfriada em nitrogênio líquido para posterior dosagem de malondialdeído pelo método do ácido tiobarbitúrico, padronizado por Slater ²⁶. Os fragmentos foram homogeneizados (Homogeneizador Virtis Company, modelo Virtis 23, teflon) em 2 mL de tampão fosfato, pH 7,0 e, posteriormente, centrifugados por5 minutos a 1000rpm (Centrífuga Fanem, modelo 215). Colheu-se 200 mL do sobrenadante do homogenato centrifugado e a ele foram adicionados: 1 mL de ácido tricloroacético 20% e 400 mL de ácido tiobarbitúrico a 1,6%, sendo essa mistura incubada por 30 minutos a 95 graus Celsius.Os lípides foram extraídos através da mistura com n-butanol (1,6 mL), de vigorosa agitação e nova centrifugação por 10 minutos a 3000rpm. A absorbância de camada orgânica foi medida em espectrofotômetro (530nm) (Espectofotômetro Pharmacia Biotech Ultrospec 3000, UV/Visible Spectophotometer). Os níveis de malondialdeído foram expressos em valores de absorbância e em nanomoles de malondialdeído por grama de tecido.

Para análise histológica, um fragmento de tecido cerebral, com 1 a 2 mm de espessura obtido no sentido coronal da região média do hemisfério esquerdo, foi fixado em formol a 10%, incluído em parafina, cortado e corado pelo método da Hematoxilina-Eosina para avaliação histológica. A avaliação foi feita por patologista sem conhecimento prévio dos grupos, tendo sido realizada apenas análise qualitativa das lâminas, visando-se verificar a presença de alterações como: edema cerebral, citoplasma eosinofílico ou infarto cerebral.

Os dados de medidas de dosagem de malondialdeído foram submetidos à análise estatística através da Análise de Variância ao nível de 5%. Às medidas de fluxometria foi aplicada Análise de Variância com medidas repetidas no tempo e realizada a decomposição da interação grupo versus tempo, ao nível de 5%. As medidas de pressão arterial média foram analisadas utilizando-se a Análise de Variância de um esquema multifatorial e foi feita a decomposição da interação grupo versus tempo, ao nível de 5%.

Em cinco animais adicionais, com mesmo porte e idade dos animais utilizados no experimento principal, foi feito um estudo angiográfico cerebral em aparelho com subtração digital (Philips, modelo BV-300), utilizando-se como meio de contraste a Massa de Schlesinger ²⁷. Sob anestesia com pentobarbital sódico (30mg/Kg, por via intraperitoneal), foi feita a cauterização das duas artérias vertebrais, como descrito anteriormente e, 24 horas após, novamente sob anestesia, realizou-se a ligadura de ambas artérias carótidas comuns, seguida de toracotomia para dissecção da aorta torácica e de veias cavas superior e inferior. Na aorta torácica realizou-se ligadura distal e cateterismo proximal com cateter de polietileno. As veias cavas foram seccionadas parcialmente. Foi feita perfusão cerebral com solução salina 0,9% gota a gota, através do cateter na aorta torácica, até que, houvesse saída apenas da solução salina pelas veias cava superior e inferior. Nesse momento, iniciou-se a infusão do meio de contraste (massa de Schlesinger), pelo mesmo cateter, com pressão de 120 a 140mmHg, até ocorrer escoamento desse meio através das secções venosas. As imagens angiográficas com subtração digital foram registradas durante toda a fase de preenchimento do leito vascular com a massa.

Resultados

Os animais apresentaram médias de idade de 62 dias (mínima de 60 e máxima de 64 dias) e de peso de 254,4g (mínimo de 215 e máximo de 300g).

Não houve diferença, estatisticamente significativa, entre as determinações de malondialdeído (MDA) nos grupos estudados (Figura 1).

Houve aumento, estatisticamente significativo, do fluxo sangüíneo entre os períodos pré e pós-isquemia nos grupos GIA e GIIB e foi observada diminuição significativa no grupo GIB. Não foi encontrada alteração entre os períodos pré e pós-pinçamento no grupo GIIA (Figura 2).

Verificou-se que a Pressão Arterial Média no subgrupo III A foi 123,8 ± 3,8 mmHg e no subgrupo III B, 126,7 ±2,6 mmHg.Nos outros grupos houve aumento significativo da PAM durante a fase de pinçamento de artéria carótida comum esquerda, com retorno aos níveis iniciais após a reperfusão (Figura 3).

Foi realizada somente avaliação histológica descritiva do tecido cerebral. As alterações histopatológicas cerebrais foram discretas e não apresentaram diferenças de freqüência e intensidade entre os grupos experimentais estudados. O edema da substância branca cerebral foi mais comumente observado no córtex da região dos lobos temporais e parietais e no hipocampo. Eventualmente, os vasos das meninges da região parieto-temporal, mostraram discreta congestão. No Grupo IB, o edema do tecido nervoso cerebral tendeu a ser um pouco mais intenso que nos demais grupos. Neurônios contraídos, com citoplasma acidofílico e eventualmente vacuolizados, além da presença de espaço perineuronal foram observados, de forma esparsa, no córtex da região dos lobos temporais e parietais e em áreas focais do hipocampo, em todos os grupos. Alterações isquêmicas mais graves como infartos ou áreas de malácia não foram observados em nenhum dos grupos. (Tabela 1)

No Experimento Complementar, verificou-se que todos os 5 animais estudados apresentaram preenchimento vascular cerebral através de circulação colateral, cuja origem não foi possível identificar. Em um dos animais observou-se que uma das artérias vertebrais permaneceu pérvia, apesar de ter sido submetida aos mesmos procedimentos que os demais (Figuras 4 e 5).

Discussão

Diversos modelos experimentais foram desenvolvidos para se estudar melhor a fisiopatologia e o potencial terapêutico das reações e alterações decorrentes de isquemia e reperfusão cerebral. Esses modelos poderiam ser divididos em dois tipos: os de isquemia focal, ou seja, com oclusão de vasos intracranianos (geralmente a artéria cerebral média) e os de isquemia global, caracterizados por oclusão de artérias carótidas e/ou vertebrais. Estes últimos poderiam ser ainda subdivididos em: a) modelo de isquemia completa, quando se promove a ligadura de todos os ramos da base aórtica ou a aplicação de torniquete de pressão ao redor do pescoço do animal; b) modelo de isquemia incompleta, ou seja, quando há algum fluxo sangüíneo chegando ao cérebro através de circulação colateral¹³. O presente estudo avaliou a reprodutibilidade de dois modelos experimentais caracterizados por isquemia cerebral global e incompleta, através da oclusão temporária de uma das artérias carótidas e definitiva da outra. As duas variantes foram baseadas em outros modelos encontrados na literatura, associando-se ou não a oclusão das artérias vertebrais.

No modelo de isquemia do Grupo I não foi feita a cauterização de artérias vertebrais (2VO), ou seja, apenas realizou-se o pinçamento das artérias carótidas. A ausência de diferenças significativas de alguns dos parâmetros estudados, entre os animais submetidos à isquemia e aqueles do grupo simulado nesse estudo, poderia ser creditada à circulação colateral mais proeminente nesses animais. Sabe-se que os ratos apresentam o Polígono de Willis bem desenvolvido, por esse motivo, quando submetidos à isquemia 2VO, isoladamente, há diminuição do aporte sangüíneo cerebral em somente cerca de 50% ^{(13, 28)}. Essa isquemia tenderia a ficar mais intensa se associada a diminuição da pressão arterial média do animal, durante o pinçamento da artéria carótida¹³. Já, animais como as cobaias, possuem o Polígono de Willis incompleto¹³ e por esse motivo, em geral, não necessitam ser submetidos à hipotensão ou a outros artifícios adicionais para se promover isquemia e reperfusão cerebral.

Para diminuir a influência da circulação colateral nos modelos de isquemia e reperfusão, Pulsinelli e col.²⁹ descreveram, em 1979, a associação da cauterização das artérias vertebrais ao modelo de 2VO. Essa técnica foi capaz de promover, segundo alguns autores, diminuição de 90 a 95% do aporte sangüíneo para os hemisférios cerebrais do rato, quando associada à isquemia temporária de ambas carótidas^{13, 28}. O Grupo II do presente estudo reproduziu esse modelo (4VO), com a diferença de que se realizou isquemia temporária apenas da artéria carótida esquerda, uma vez que a outra artéria carótida encontrava-se permanentemente ocluída pela ligadura e cateterismo. Como não houve diferenças significativas nas dosagens de MDA e na análise histológica, em comparação com os grupos "sham" , o aporte sangüíneo cerebral nesses animais chegou, possivelmente, através de circulação colateral. O estudo complementar mostrou que essa circulação colateral poderia estar realmente presente, pois houve preenchimento de leito vascular cerebral nos cinco animais estudados e submetidos aos mesmos procedimentos do grupo II. Esse fluxo colateral, ainda que reduzido, poderia ser capaz de evitar a peroxidação lipídica e lesões decorrentes de isquemia e reperfusão cerebrais, avaliados pela dosagem do MDA cerebral e estudo histológico.

Em estudo recente, Islekel e col,³⁰ submeteram ratos à técnica 4VO e à isquemia incompleta, com períodos de reperfusão variáveis (0, 20, 60 e 240 minutos). Verificaram que, quando esses animais eram comparados com o grupo "sham" não havia diferenças nas dosagens do MDA cerebral. No entanto, neste mesmo experimento, ao associarem o uso de um torniquete insuflado ao redor do pescoço dos animais, verificaram diferença significativa da dosagem de MDA cerebral entre os animais submetidos a isquemia e reperfusão e os simulados. Os autores concluíram que a circulação colateral advinda de ramos cervicais das artérias subclávias poderia ser suficiente para a prevenção da lipoperoxidação cerebral³⁰.

Com relação ao delineamento dos grupos do presente trabalho, a rigor, deveria ter sido feito de uma forma um pouco diferente, ou seja, os animais dos grupos I e III deveriam ter sido submetidos a dissecção vertebral também 24 horas antes do início do experimento definitivo, de modo que houvesse homogeneidade dos tempos experimentais. Entretanto, acreditamos que este fator não deva ter pesado nos resultados encontrados, uma vez que nesses grupos as artérias vertebrais não foram cauterizadas.

O estudo angiográfico complementar, realizado no presente experimento, mostrou a presença de fluxo sangüíneo cerebral através de circulação colateral; no entanto, as imagens obtidas não permitiram definir o local de origem desse fluxo colateral. Em um dos animais, verificou-se ainda que uma das artérias vertebrais havia permanecido pérvia, apesar do mesmo rigor técnico usado nos demais animais, fato esse que poderia comprometer a reprodutibilidade desse modelo.

Quanto à avaliação da lipoperoxidação, no estudo atual, foi realizado o teste das substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS). Resultados semelhantes aos nossos foram encontrados no estudo realizado por Yoshida e col.³¹, que provocaram isquemia e reperfusão cerebral em cobaias mediante pinçamento temporário de ambas as artérias carótidas (2VO). Neste estudo os autores também não encontraram diferenças no teste das substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) entre o grupo "sham" e os grupos que foram submetidos a 2VO. Em outro estudo, MacMillan também não verificou diferença nas dosagens de MDA em ratos submetidos à cauterização das artérias vertebrais e pinçamento temporário das artérias carótidas (4VO)³². Da mesma forma, Islekel e col.³⁰ ao realizarem isquemia 4VO incompleta, como em nosso experimento, não observaram diferenças na dosagem de MDA entre os grupos simulados e os com isquemia e reperfusão, creditando esse resultado à possível presença de circulação colateral advinda das artérias subclávias³⁰.

Em estudo realizado em ratos Wistar submetidos à técnica de 4VO, não houve aumento de MDA em períodos de uma ou duas horas de reperfusão, mas quando foi prolongado esse período para além de oito horas verificou-se aumento significativo da dosagem de MDA, principalmente, nas regiões do córtex parietal e do neocórtex³³. Por outro lado, os resultados de outros autores^{13, 16}, revelaram aumento dos lipoperóxidos cerebrais, após curtos períodos de reperfusão. Muitos outros estudos mostraram também alterações significativas do MDA em fases precoces de reperfusão: Vagnozzi e col. (1994 e 1995), Seif-el-Nars e El-Fattah (1995) e Siragusa e col. (1997) verificaram haver aumento significativo de MDA em ratos submetidos à isquemia e reperfusão cerebral, quando comparados aos grupos controle sem isquemia e reperfusão^{34,35, 36,37}. Foi com base nos resultados desses estudos que, no presente experimento, optou-se pelas dosagens de MDA nas fases mais precoces da reperfusão (uma e duas horas).

O método de dosagem das substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico, embora simples, pode algumas vezes ser realmente pouco específico, levando a resultados díspares, ainda que sejam utilizadas metodologias criteriosas^{12, 13, 16}. Uma das formas de se evitar variabilidade é através do controle do ambiente em que se realiza o experimento, do modo de armazenamento das amostras e do animal utilizado^{13 ,38}. Além disso, o teste TBARS, realizado por espectofotometria ou por fluorometria, identifica um produto (cromóforo) resultante da reação de duas moléculas de TBA com uma de MDA, mas, pode também reagir com outras substâncias como a desoxirribose, as prostaglandinas e outros aldeídos, que não o MDA^12,16. Já, quando o teste é realizado por HPLC ("high-performance liquid chromatography"), os resultados são mais específicos, uma vez que somente o complexo TBA-MDA é determinado^{12, 39}.

Deve-se também ressaltar que as técnicas de dosagem do TBARS sofreram inúmeras modificações, algumas inapropriadas, e essas variações na metodologia de sua realização, acabaram interferindo na reprodutibilidade do teste^{12, 16, 38, 39}, tornando difícil a comparação da quantificação do teste TBARS entre os diversos estudos¹⁶.

No presente estudo, é possível que o aporte sangüíneo cerebral através de circulação colateral e/ou por falha na cauterização das artérias vertebrais possa ter influenciado nos resultados atenuando a isquemia e as lesões de reperfusão.

Outro parâmetro avaliado em nosso estudo foi a medida de fluxo sangüíneo de artéria carótida comum esquerda, antes e após o seu pinçamento, usado, principalmente, para confirmação de oclusão do aporte sangüíneo para face e cérebro através da carótida esquerda. Os resultados de reperfusão observados não foram consistentes, o que impede uma análise mais criteriosa da possibilidade de hiperperfusão pós-isquemia. Da mesma forma que para as análises de outros parâmetros, este aspecto, em particular, do fluxo sangüíneo pós-reperfusão pode ter sido influenciado pelo suprimento colateral cerebral durante a isquemia. Meadow e colaboradores ressaltaram que a fluxometria, ultrassônica ou eletromagnética, confirmariam a interrupção completa do fluxo sangüíneo do vaso analisado, o que foi confirmado no presente trabalho⁴⁰.

Com relação à medida de PAM, o aumento significativo da pressão arterial durante o pinçamento temporário da artéria carótida esquerda seria devido à redução do estímulo aos barorreceptores carotídeos e ao aumento da pós-carga. Em estudo realizado em humanos⁹ esse mesmo comportamento foi verificado, assim como, em estudos experimentais com ratos^33,41,29. Esse aumento poderia incrementar o aporte sangüíneo cerebral através da circulação colateral reduzindo as alterações decorrentes da isquemia.

As alterações histológicas foram similares às observadas por Islekel e col. que foram caracterizadas por presença de neurônios encolhidos e citoplasma escuro na região CA1 de hipocampo, mas apenas nos animais que sofreram isquemia 4VO, independentemente dos tempos de reperfusão (0, 20, 60 e 240 minutos). Os autores verificaram ainda que, na região CA3 do hipocampo não ocorreram alterações histológicas, demonstrando assim diferentes suscetibilidades das regiões cerebrais³⁰.

No trabalho de Pulsinelli e Brierley²⁹ em ratos Wistar com isquemia 4VO, verificou-se nos estudos histológicos que o grau de lesão neuronal era maior nos animais que sofreram períodos mais prolongados de isquemia. Nesse estudo não apareceram microvacuolizações⁴², diferentemente dos nossos resultados, em que foi verificada a presença de eventuais neurônios contraídos e vacuolizados em córtex parietal e hipocampo.

Conclusão

Os modelos de isquemia e reperfusão cerebral utilizados no presente estudo não mostraram diferenças significativas entre os grupos quanto: à presença de lipoperoxidação, avaliada através da dosagem de MDA cerebral, e à avaliação histológica cerebral.

O estudo angiográfico cerebral complementar mostrou que, apesar do rigor técnico, a cauterização das artérias vertebrais pode estar sujeita a ocorrência de falhas e que mesmo com oclusão completa de todos os vasos cerebrais extracranianos, o tecido cerebral pode receber suprimento sangüíneo através de circulação colateral.

Data do recebimento: 05/08/2003

Data da revisão: 21/08/2003

Data da aprovação: 04/09/2003

Conflito de interesse: nenhum

Fonte de financiamento: nenhuma

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Trabalho desenvolvido na Disciplina de Cirurgia Vascular do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP. Botucatu – SP.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Abr 2007
• Data do Fascículo
  Dez 2003

Histórico

• Aceito
  04 Set 2003
• Revisado
  21 Ago 2003
• Recebido
  05 Ago 2003