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PROPRIEDADES DE ISOLADOS VIRAIS DE SACCHARUM SPP. CAUSADORES DE MOSAICO EM CANA-DE-AÇÚCAR NO PARANÁ E SÃO PAULO

PROPERTIES OF VIRUS ISOLATES FROM SACCHARUM SPP. CAUSING MOSAIC IN SUGARCANE IN PARANÁ AND SÃO PAULO STATES, BRAZIL

RESUMO

Os vírus causadores do mosaico da cana-de-açúcar encontram-se disseminados em todas as regiões canavieiras do mundo, podendo infectar culturas de milho, sorgo e outras gramíneas. Este trabalho teve como objetivo determinar as propriedades de isolados paranaenses dos clones de cana-de-açúcar RB925268 e RB945950, e compará-los com isolados das variedades RB72454 e SP86155 do Estado de São Paulo. Foram observadas variações na severidade, e no tempo necessário para a manifestação dos sintomas nas plantas inoculadas com cada isolado. Através da reação de RT-PCR com oligonucleotídeos para o SCMV, obteve-se a amplificação de fragmentos com aproximadamente 900 pb da ORF codificadora da protéica capsidial. O padrão de RFLP resultante do tratamento dos produtos de RT-PCR com a enzima HinfI revelou variações na seqüência de nucleotídeos, indicando que possam existir diferentes estirpes do SCMV entre os isolados.

PALAVRAS-CHAVE
SCMV; Potyvirus ; RT-PCR

ABSTRACT

Viruses associated with sugarcane mosaic are disseminated in all sugarcane producing areas, and also may infect maize, sorghum and other gramineous plants. The objective of this study was to determine some properties of two virus isolates causing mosaic in the sugarcane clone RB925268 and RB945950, from the state of Paraná, compared to those of isolates from sugarcane varieties RB72454 and SP86-155 from the state of São Paulo. Brazil. The symptom severity and the time of their appearance differed for each isolate in the inoculated plants. RT-PCR reactions with SCMV specific primers allowed for the amplification of 900-bp fragments of the virus coat protein open reading frame (ORF). The restriction fragment length polymorphism pattern (RFLP) obtained with HinfI treatment of the RT-PCR products revealed nucleotide sequence variations indicating there could be different SCMV strains among these isolates.

KEY WORDS
SCMV; Potyvirus ; RT-PCR

O mosaico é uma das principais doenças da cana-de-açúcar (Saccharum spp.), podendo ser causado por um subgrupo de quatro espécies distintas de Potyvirus que infectam diferentes poáceas: Sugarcane mosaic virus (SCMV), espécie que dá nome ao complexo viral do SCMV; Sorghum mosaic virus (SrMV); Maize dwarf mosaic virus (MDMV); e Johnsongrass mosaic virus (JGMV), (SHUKLA et al., 1994SHUKLA, D.D.; WARD, C.W.; BRUNT, A.A. The Potyviridae. In: CAB International. Cambridge: Cambridge University Press, 1994. p.360-371.). Recentemente, a espécie Zea mosaic virus (ZeMV), isolada de milho, foi proposta como um novo membro do subgrupo (SEIFERS et al., 2000SEIFERS, D.L.; SALOMON, R.; MARIE-JANE, V.; ALLIOT, B.; SIGNORET, P.; HABER, S.; LOBODA, A.; ENS, W.; SHE, Y-M.; STANDING, K. G. Characterization of a novel potyvirus isolated from maize in Israel. Phytopathology, v.90, p.505-513, 2000.).

Como os vírus da cana-de-açúcar podem infectar outras gramíneas como milho (COSTA et al., 1971COSTA, A.S.; KITAJIMA, E.W.; ARRUDA, S.C. Moléstias de vírus e de micoplasmas do milho em São Paulo. Revista da Sociedade Brasileira de Fitopatologia, v.4, p.39-41, 1971.) e sorgo (PINTO, 1984PINTO, N.F.J.A. Vírus do mosaico comum da cana-deaçúcar em sorgo (Sorghum bicolor (..) Moench): caracterização de isolados. reação de cultivares e herança de resistência. Piracicaba: 1984. 136p. Tese (Doutorado) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Univ. São Paulo, Piracicaba, 1984.), a utilização de novas cultivares introduzidas no Brasil, e o plantio na entre safra, podem contribuir para o aumento da incidência do mosaico nessas culturas (FERNANDES; OLIVEIRA, 1997FERNANDES, F.T.; OLIVEIRA, E. Principais doenças na cultura do milho. Brasília: EMBRAPA, 1997. (Circular Técnica n.26).).

Este trabalho teve como objetivo identificar dois isolados virais de clones de cana-de-açúcar cultivados numa área experimental do Paraná, e compará-los com dois isolados obtidos de um plantio comercial do Estado de São Paulo.

Folhas de cana-de-açúcar dos clones RB925268 e RB945950 cultivados no Município de São Tomé, PR, e folhas das variedades RB72454 e SP86-155, provenientes do Município de Piracicaba, SP, com sintomas de mosaico, foram utilizadas nas inoculações mecânicas de Sorgo bicolor cv. Rio, para manutenção e propagação dos vírus. Gramíneas de diferentes espécies foram inoculadas com o inóculo preparado de folhas de sorgo maceradas e trituradas em um liquidificador, na presença de tampão fosfato de sódio (Na2HPO4) e potássio (KH2PO4) 0,05 M e pH 7,0, mais 1,3% de sulfito de sódio (Na2SO3). As plantas inoculadas foram mantidas em estufa plástica, e observadas durante 10 a 50 dias após a inoculação.

Secções ultrafinas de folhas de sorgo ‘Rio’ com mosaico foram examinadas em um microscópio eletrônico de transmissão Zeiss EM900, onde também foram observadas as reações de imunoadsorção (ISEM) utilizando anti-soros policlonais para o SCMV e SrMV, segundo procedimentos previamente descritos (KITAJIMA, 1965KITAJIMA, E.W. A rapid method to detect particles of some spherical plant viruses in fresh preparations. Journal of Electron Microscopy, v. 14, p.119-121, 1965.; MILNE; LESEMANN, 1978MILNE, R.G.; LESEMANN, D.E. Na imuno-electron microscope investigation of oat sterile dwarf and related viruses. Virology, v.90, p.299-304, 1978.).

Para extração dos RNAs totais de plantas infectadas, foram utilizados 100 mg de tecido fresco de sorgo ‘Rio’ triturado em nitrogênio líquido, conforme o protocolo de extração do RNeasy® Plant Kit (Qiagen®). Para a síntese do cDNA foi utilizado o protocolo descrito por YANG; MIRKOV (1997)YANG, Z. N.; MIRKOV, T. E. Sequence and relationships of sugarcane mosaic and sorghum mosaic virus strains and development of RT-PCRbased RFLPs for strains discrimination. Phytopathology, v.87, p.932-939, 1997., com modificações, adicionandose em um microtubo 4 µL do RNA total obtido de plantas infectadas, 4 µL da solução (3µg/µL) do oligonucleotídeo hexamero randômico pd(N)6 – INVITROGENTM, 6μL do tampão de transcrição reversa 10x (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM KCl), 2 μL de dNTP mix (10 mM), 3 μL de água tratada com DEPC, seguido de um aquecimento a 65º C durante 5 min, e resfriamento no gelo por 1 min, adicionando-se 4μL de MgCl2 (25 mM), 2 μL de DTT (0,1 M) e 1μL de RNase out, levemente misturados e centrifugados, e incubados a 25º C por 2 min, acrescentando-se 2 μL da enzima transcriptase reversa do M-MLV (Invitrogen ®), e 6μL de água tratada com DEPC com aquecimento a 25º C durante 10 min, e a 42º C por 50 min. Para o PCR foi utilizado 5 μL do cDNA, e adicionado 5μL de tampão 10X PCR-Buffer (0,5 M Tris-HCL; 0,7 M KCL; 0,1 M MgCl2 pH 8,0), 3 μL de MgCl2 (25 mM), 2 μL dNTP mix (10 mM) e, 2 μL dos oligonucleotídeos SCMV-F (5’-CCCTCTAGATTTYCA CCAAGCTGGAA-3’) e SCMV-R (5’-CCCAAGCTTAGCTGTGTGTCTCTCTGTAT TCTC-3’) (desenvolvidos pelo Centro de Tecnologia Canavieira, Piracicaba, SP), cujas seqüências são similares às dos oligonucleotídeos SCMV-F3 e SCMV-R3 de YANG;MIRKOV (1997)YANG, Z. N.; MIRKOV, T. E. Sequence and relationships of sugarcane mosaic and sorghum mosaic virus strains and development of RT-PCRbased RFLPs for strains discrimination. Phytopathology, v.87, p.932-939, 1997., e 2μL dos oligonucleotídeos SrMV-F3 e SrMV-R3 (YANG; MIRKOV, 1997YANG, Z. N.; MIRKOV, T. E. Sequence and relationships of sugarcane mosaic and sorghum mosaic virus strains and development of RT-PCRbased RFLPs for strains discrimination. Phytopathology, v.87, p.932-939, 1997.), específicos para amplificação dos genes da capa protéica do SCMV e do SrMV, respectivamente. As reações foram conduzidas em um termociclador BIOMETRA®, programado para um ciclo de 94º C (1 min), quarenta ciclos de 94º C (1 min), 55º C (1 min), e 72º C (1 min), seguido de um único ciclo de 72º C (7 min). Uma alíquota de 10μL do produto de RT-PCR foi analisada por eletroforese em gel de agarose (1,2%). Os padrões de RFLP gerados pelo tratamento dos produtos de RT-PCR com as enzimas de restrição TaqI e HinfI foram analisados através de eletroforese em gel de agarose a 1,7%.

Os sintomas induzidos pelos isolados das variedades RB72454 e SP86-155 foram mais severos, surgindo 5 dias antes dos sintomas causados pelos isolados do Paraná, os quais se manifestaram entre 10 e quinze dias após a inoculação. As cultivares de sorgo ‘Rio’, ‘TX 398B’, ‘Brandes BR 501’, de milho ‘K 75’, ‘AMS 22’, e a cultivar de milho pipoca ‘IAC 112’, mostraram-se susceptíveis aos quatro isolados. Porém, as cultivares de sorgo ‘TX632B’ e milho ‘BR106’ apresentaram sintomas de mosaico, apenas quando inoculadas com os isolados de RB72454 e SP86-155 de São Paulo, enquanto a variedade de milho pipoca ‘UEL/PRO25’ apresentou sintomas apenas quando inoculada com o isolado de RB72454.

Em São Paulo, vários isolados da cana-de-açúcar, milho e sorgo, do SCMV, foram identificados, sendo que um deles quebrou a resistência da variedade RB72454, a mais cultivada no país (GONÇALVES et al., 2007GONÇALVES, M.C.; SANTOS, A.S.; MAIA, I.G., CHAGAS, C.M.; HARAKAVA, R. Caracterização de um isolado do Sugarcane mosaic virus que quebra a resistência de variedades comerciais de cana-de-açúcar. Fitopatologia Brasileira, v.32, p.32-39, 2007.). Neste trabalho, os isolados de RB72454 e de SP86-155, provenientes de São Paulo, mostraram-se mais agressivos que os isolados do Paraná, causando avermelhamento e necrose em sorgo ‘Rio’ (Tabela 1).

Tabela 1
Reações das hospedeiras à inoculação mecânica dos isolados virais provenientes das variedades RB72454 e SP86-155, e dos clones RB925268 e RB945950 de cana-de-açúcar.

As análises de microscopia eletrônica revelaram partículas alongadas e levemente flexuosas típicas de Potyvirus, e nas reações de imunoadsorção (ISEM) o anti-soro para o SCMV não reagiu com material infectado. Por outro lado, houve fraca reação do antisoro para o SrMV contra todos os isolados testados.

De modo semelhante, nos ensaios realizados por GONÇALVES et al. (2007)GONÇALVES, M.C.; SANTOS, A.S.; MAIA, I.G., CHAGAS, C.M.; HARAKAVA, R. Caracterização de um isolado do Sugarcane mosaic virus que quebra a resistência de variedades comerciais de cana-de-açúcar. Fitopatologia Brasileira, v.32, p.32-39, 2007., um isolado do SCMV também não pôde ser detectado nos testes DAS-ELISA com um anti-soro comercial para essa espécie. Segundo HOLLINGS; BRUNT (1981)HOLLINGS, M.; BRUNT, A.A. Potyviruses. In: KURSTAK, E. (Ed.). Handbook of plant virus infections: comparative diagnosis. Amsterdam: Elsevier/North-Holland, 1981. p.731-807., diferentes estirpes de uma mesma espécie de Potyviridae podem ser tão distantemente relacionados sorologicamente quanto elas são de outras espécies da família. Portanto, a inconsistência verificada nos testes sorológicos não é incomum, e a sorologia, muitas vezes, apresenta-se insatisfatória na identificação de membros da família Potyviridae (SHUKLA et al., 1994SHUKLA, D.D.; WARD, C.W.; BRUNT, A.A. The Potyviridae. In: CAB International. Cambridge: Cambridge University Press, 1994. p.360-371.).

Nos ensaios de RT-PCR foram obtidos fragmentos de aproximadamente 900 pb com os oligonucleotídeos SCMV-F e SCMV-R (Fig. 1). E não ocorreram amplificações com os oligonucleotídeos SrMV-F3 e SrMV-R3 nos testes realizados.

Fig. 1
Análise eletroforética dos produtos de amplificação por RT-PCR de aproximadamente 900 pb da região 5’-terminal da capa protéica viral, com os oligonucleotídeos SCMV-F e SCMV–R. (1) Isolado de RB925268; (2) Isolado de RB945950; (4) Isolado de RB72454; (5) Isolado de SP86-155, (3 e 6) Cana-de-açúcar sadia e (M) DNA Ladder 100pb

Embora o SrMV e o SCMV sejam os mais encontrados nas infecções naturais da cana-de-açúcar, até o momento apenas o SCMV pôde ser identificado no Brasil, e em países africanos (GONÇALVES et al., 2007GONÇALVES, M.C.; SANTOS, A.S.; MAIA, I.G., CHAGAS, C.M.; HARAKAVA, R. Caracterização de um isolado do Sugarcane mosaic virus que quebra a resistência de variedades comerciais de cana-de-açúcar. Fitopatologia Brasileira, v.32, p.32-39, 2007.; ALEGRIA et al., 2003ALEGRIA, O.M.; ROYER, M.; BOUSALEM, M.; CHATENET, M.; PETERCHMITT, M.; GIRARD, J.C.; ROTT, P. Genetic diversity in the coat protein coding region of eighty-six sugarcane mosaic virus isolates from eight countries, particularly from Cameroon and Congo. Archives of Virology, v.148, p. 357-372, 2003.). Todavia, nos Estados Unidos, em levantamentos na Louisiana, mais de 90% das amostras encontradas foram das estirpes I e H do SrMV, demonstrando que naquele país este vírus vem assumindo importância crescente como causador do mosaico da cana-de-açúcar (GRISHAM; PAN, 2003GRISHAM, M.P.; PAN, Y. Identification of virus isolates causing mosaic of sugarcane in Lousiana. In: INTERNATIONAL CONGRESS ON PLANT PATHOLOGY, 8., 2003, Christchurch, New Zealand. Abstracts. Christchurch: 2003. p.308.).

O padrão de RFLP gerado pelo tratamento dos produtos de RT-PCR, com as enzimas TaqI e HinfI, confirmou que os isolados de RB72454 e SP86-155 são da mesma estirpe (Fig.2), como indicado pela semelhança na severidade de sintomas em hospedeiras inoculadas com estes isolados (Tabela 1). Foi observado ainda, que os padrões de bandas das enzimas TaqI e HinfI diferiram dos padrões para as estirpes americanas A, B, D e E do SCMV, com base na técnica de RT-PCR-RFLP utilizada por YANG; MIRKOV (1997)YANG, Z. N.; MIRKOV, T. E. Sequence and relationships of sugarcane mosaic and sorghum mosaic virus strains and development of RT-PCRbased RFLPs for strains discrimination. Phytopathology, v.87, p.932-939, 1997. com estas enzimas. Com base no polimorfismo de bandas da enzima HinfI, podemos suspeitar que os isolados do Paraná não sejam da mesma estirpe, embora os sintomas induzidos por ambos tenham sido muito semelhantes.

Isolados do SCMV já seqüenciados no Brasil apresentaram maior proximidade com a estirpe SCMV-Brisbane da Austrália, com identidade variando de 78 a 96% (GONÇALVES et al., 2007GONÇALVES, M.C.; SANTOS, A.S.; MAIA, I.G., CHAGAS, C.M.; HARAKAVA, R. Caracterização de um isolado do Sugarcane mosaic virus que quebra a resistência de variedades comerciais de cana-de-açúcar. Fitopatologia Brasileira, v.32, p.32-39, 2007.). Neste trabalho, a análise por RFLP dos isolados brasileiros com as enzimas de restrição TaqI e HinfI resultaram em padrões de polimorfismo diferentes dos obtidos para isolados americanos do SCMV. Estes resultados evidenciam a estreita correlação existente entre as estirpes do SCMV e suas localizações geográficas, o que deve ser considerado nos programas de melhoramento e de biotecnologia, visando a resistência da canade-açúcar ao mosaico.

Fig. 2
Padrões de RFLP obtidos com a digestão enzimática dos produtos de RT-PCR com as enzimas de restrição TaqI e HinfI, de isolados de cana-de-açúcar: (1) isolado de RB925268; (2) isolado de RB945950; (3) isolado de RB72454; (4) isolado de SP86-155. (M) DNA Ladder 100pb.

Isto também reforça a necessidade do uso de medidas quarentenárias para o movimento e troca de germoplasma para evitar a introdução de novas estirpes do SCMV nas áreas de expansão da cana-deaçúcar, e destas para culturas de sorgo e milho.

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Elliot W. Kitajima (NAPA-Esalq) por facilitar o uso do microscópio eletrônico. Ao Dr. Marcos C. Gonçalves (Instituto Biológico) pela cessão dos antisoros, e ao Dr. Álvaro Sangüino (CTC) pelo fornecimento dos isolados do SCMV do Estado de São Paulo.

REFERÊNCIAS

  • ALEGRIA, O.M.; ROYER, M.; BOUSALEM, M.; CHATENET, M.; PETERCHMITT, M.; GIRARD, J.C.; ROTT, P. Genetic diversity in the coat protein coding region of eighty-six sugarcane mosaic virus isolates from eight countries, particularly from Cameroon and Congo. Archives of Virology, v.148, p. 357-372, 2003.
  • COSTA, A.S.; KITAJIMA, E.W.; ARRUDA, S.C. Moléstias de vírus e de micoplasmas do milho em São Paulo. Revista da Sociedade Brasileira de Fitopatologia, v.4, p.39-41, 1971.
  • FERNANDES, F.T.; OLIVEIRA, E. Principais doenças na cultura do milho Brasília: EMBRAPA, 1997. (Circular Técnica n.26).
  • GONÇALVES, M.C.; SANTOS, A.S.; MAIA, I.G., CHAGAS, C.M.; HARAKAVA, R. Caracterização de um isolado do Sugarcane mosaic virus que quebra a resistência de variedades comerciais de cana-de-açúcar. Fitopatologia Brasileira, v.32, p.32-39, 2007.
  • GRISHAM, M.P.; PAN, Y. Identification of virus isolates causing mosaic of sugarcane in Lousiana. In: INTERNATIONAL CONGRESS ON PLANT PATHOLOGY, 8., 2003, Christchurch, New Zealand. Abstracts Christchurch: 2003. p.308.
  • HOLLINGS, M.; BRUNT, A.A. Potyviruses. In: KURSTAK, E. (Ed.). Handbook of plant virus infections: comparative diagnosis. Amsterdam: Elsevier/North-Holland, 1981. p.731-807.
  • KITAJIMA, E.W. A rapid method to detect particles of some spherical plant viruses in fresh preparations. Journal of Electron Microscopy, v. 14, p.119-121, 1965.
  • MILNE, R.G.; LESEMANN, D.E. Na imuno-electron microscope investigation of oat sterile dwarf and related viruses. Virology, v.90, p.299-304, 1978.
  • PINTO, N.F.J.A. Vírus do mosaico comum da cana-deaçúcar em sorgo (Sorghum bicolor (..) Moench): caracterização de isolados. reação de cultivares e herança de resistência Piracicaba: 1984. 136p. Tese (Doutorado) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Univ. São Paulo, Piracicaba, 1984.
  • SEIFERS, D.L.; SALOMON, R.; MARIE-JANE, V.; ALLIOT, B.; SIGNORET, P.; HABER, S.; LOBODA, A.; ENS, W.; SHE, Y-M.; STANDING, K. G. Characterization of a novel potyvirus isolated from maize in Israel. Phytopathology, v.90, p.505-513, 2000.
  • SHUKLA, D.D.; WARD, C.W.; BRUNT, A.A. The Potyviridae In: CAB International. Cambridge: Cambridge University Press, 1994. p.360-371.
  • YANG, Z. N.; MIRKOV, T. E. Sequence and relationships of sugarcane mosaic and sorghum mosaic virus strains and development of RT-PCRbased RFLPs for strains discrimination. Phytopathology, v.87, p.932-939, 1997.

Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    02 Jul 2021
  • Data do Fascículo
    Jan-Mar 2008

Histórico

  • Recebido
    06 Mar 2007
  • Aceito
    14 Mar 2008
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