Composição química e eficácia do óleo essencial e do extrato etanólico de Alpinia zerumbet sobre Staphylococcus aureus

Chemical composition and efficacy of essential oil and ethanol extract of Alpinia zerumbet on Staphylococcus aureus

Karina Neoob de Carvalho Castro David Fernandes Lima Luciene Costa Vasconcelos Raimunda Cardoso Santos Alitiene Moura Lemos Pereira Fabíola Helena dos Santos Fogaça Kirley Marques Canuto Edy Sousa de Brito Rodrigo Maciel Calvet Sobre os autores

RESUMO:

O presente trabalho descreve a atividade antibacteriana do óleo essencial e do extrato etanólico das folhas de Alpinia zerumbet (colônia) sobre cepas de Staphylococcus aureus isoladas de vacas com mastite subclínica e cepas padrão ATCC 29213 e ATCC 25923, por meio do método de difusão em ágar. Foram utilizados 10 tratamentos contendo diferentes concentrações do óleo essencial e do extrato etanólico (100,0; 50,0; 25,0; 12,5 e 6,3 mg.mL-1) e o grupo controle (álcool etílico a 50% e Tween a 1%). Os constituintes majoritários do óleo essencial foram p -cimeno (32,72%), 1,8-cineol (24,05%) e 4-terpineol (20,23%), sendo esses determinados por cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas e cromatografia a gás com detector de ionização de chama (CG-EM/DIC). No extrato etanólico foi detectado o ácido elágico e três flavonoides: rutina, quercetina e campferol, por meio de cromatografia a líquido de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de diodo (CLAE-DAD). Todas as cepas apresentaram sensibilidade aos tratamentos com óleo essencial e extrato etanólico. A melhor resposta foi obtida com o óleo essencial de A. zerumbet que, na concentração de 100 mg.mL-1 proporcionou inibição total do crescimento bacteriano. Esses resultados sugerem o potencial antibacteriano do óleo essencial e do extrato etanólico de A. zerumbet no controle da mastite bovina.

PALAVRAS-CHAVE:
Alpinia zerumbet; atividade antibacteriana; bovinos; planta medicinal

ABSTRACT:

The present work describes the antibacterial activity of the essential oil and the ethanol extract from leaves of Alpinia zerumbet (colônia) on Staphylococcus aureus strains isolated from cows with subclinical mastitis and standard strains ATCC 29213 and ATCC 25923, using the agar diffusion method. Ten treatments containing different concentrations of essential oil and ethanol extract (100.0; 50.0; 25.0; 12.5 and 6.3 mg.mL-1) and the control group (50% ethyl alcohol and 1% Tween solutions) were used for antimicrobial testing. The major constituents of the essential oil were p -cimeno (32.72%), 1.8-cineol (24.05%) and 4-terpineol (20.23%), which were determined by gas chromatographymass spectrometry and gas chromatography - flame ionization detector (CG-MS/FID). Ellagic acid and three flavonoids (rutin, quercetin and campferol) were detected in the ethanol extract by means of high performance liquid chromatography-photodiode array detector (HPLC-PDA). All strains showed sensitivity to the treatments with essential oil and the ethanol extract. The best response was obtained with A. zerumbet essential oil at a 100 mg.mL-1, showing complete inhibition of bacterial growth. These results demonstrate the antibacterial potential of essential oil and ethanol extract of A. zerumbet in the control of bovine mastitis.

KEYWORDS:
Alpinia zerumbet; antibacterial activity; bovine; medicinal plants

INTRODUÇÃO

A mastite é a doença mais importante em rebanhos leiteiros (Fagundes; Oliveira, 2004FAGUNDES, H.; OLIVEIRA, C.A.F. Infecções intramamárias causadas por Staphylococcus aureus e suas implicações em saúde pública. Ciência Rural , Santa Maria, v.34, n.4, p.1315-1320, 2004.) e, em razão de sua alta prevalência, estima-se que possam ocorrer perdas entre 12 e 15% da produção leiteira brasileira (Fonseca; Santos, 2000FONSECA, L.F.L.; SANTOS, M.V. Qualidade do leite e controle de mastite. São Paulo: Lemos Editorial, 2000. 175p.). A mastite subclínica responde por até 95% dos casos de mastite em um rebanho e seu diagnóstico é realizado geralmente a campo por meio da prova do California Mastitis Test (CMT) (Fonseca; Santos, 2000FONSECA, L.F.L.; SANTOS, M.V. Qualidade do leite e controle de mastite. São Paulo: Lemos Editorial, 2000. 175p.).

O principal agente causador da mastite em bovinos é o Staphylococcus aureus, que se destaca como o micro-organismo de tratamento mais difícil, devido à elevada resistência aos antibióticos (Fagundes; Oliveira, 2004FAGUNDES, H.; OLIVEIRA, C.A.F. Infecções intramamárias causadas por Staphylococcus aureus e suas implicações em saúde pública. Ciência Rural , Santa Maria, v.34, n.4, p.1315-1320, 2004.). O aparecimento de cepas multirresistentes é favorecido pelo uso indiscriminado de antimicrobianos que, quando utilizados em animais de produção, pode levar ao acúmulo de resíduos nos alimentos, com sérias consequências para a saúde do consumidor (Mota et al., 2005MOTA, R.A.; SILVA, K.P.C.; FREITAS, M.F.L.; PORTO, W.J.N.; SILVA, L.B.G. Utilização indiscriminada de antimicrobianos e sua contribuição a multirresitência bacteriana. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science , v.42, n.6, p.465-470, 2005.). Portanto, faz-se necessária a descoberta de compostos novos e seguros para controle da mastite bovina (Fonseca et al., 2013FONSECA, A.P.; ESTRELA, F.T.; MORAES, T.S.; CARNEIRO, L.J.; BASTOS, J.K.; SANTOS, R.A.; AMBRÓSIO, S.R.; MARTINS, C.H.G.; VENEZIANI, R.C.S. In vitro antimicrobial activity of plant-derived diterpenes against bovine mastitis bacteria, Molecules ,v.18, n.7, p.7865-7872, 2013.).

O estudo de fitoterápicos tem sido considerado mundialmente importante, pela busca de substâncias menos tóxicas e mais eficazes contra resistência bacteriana (Ostrosky et al., 2008OSTROSKY, E.A.; MIZUMOTO, M.K.; LIMA, M.E.L.; KANEKO, T.M.; NISHIKAWA, S.O.; FREITAS, B.R. Métodos para avaliação da atividade antimicrobiana e determinação da concentração mínima inibitória (CMI) de plantas medicinais. Revista Brasileira de Farmacognosia , v.18, n.2, p.301-307, 2008. ). Muitas plantas medicinais já são utilizadas para o tratamento de animais (Marinho et al., 2007MARINHO M.L.; ALVES, M.S.; RODRIGUES, M.L.C.; ROTONDANO, T.E.F.; VIDAL I.F.; SILVA, W.W.; ATHAYDE, A.C.R. A utilização de plantas medicinais em medicina veterinária: um resgate do saber popular. Revista Brasileira de Plantas Medicinais , v.9, n.3, p.64-69, 2007.). Algumas delas têm atividade contra um grande número de bactérias (Bertini et al., 2005BERTINI, L.M.; PEREIRA, A.F.; OLIVEIRA, C.L.L.; MENEZES, E.A.; MORAIS, S.M.; CUNHA, F.A.; CAVALCANTI, E.S.B. Perfil de sensibilidade de bactérias frente a óleos essenciais de algumas plantas do nordeste do Brasil. Infarma , v.17, n.3-4, p.80-82, 2005.). Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm é uma espécie originária da Ásia, pertencente à família Zingiberaceae , e encontrada na literatura científica com as sinonímias de Alpinia speciosa K. Shum, Costus zerumbet Pers., Languas speciosa Small e Zerumbet speciosum J. C. Wendel (Lorenzi; Souza, 2001LORENZI, H.; SOUZA, H.M. Plantas ornamentais no Brasil: arbustivas, herbáceas e trepadeiras. 3a.ed. São Paulo: Instituto Plantarum, 2001. 1067p.). Essa planta é conhecida popularmente como colônia, sendo muito encontrada no Nordeste do Brasil, e utilizada como anti-hipertensiva, diurética e febrífuga (Correa et al., 2010CORREA, A.J.C.; LIMA, C.E.; COSTA, M.C.C.D. Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R. M. Sm. (Zingiberaceae): levantamento de publicações nas áreas farmacológica e química para o período de 1987 a 2008. Revista Brasileira de Plantas Medicinais , v.12, n.1, p.113-119, 2010.), havendo trabalhos que comprovam sua atividade antimicrobiana (Victório et al., 2009VICTÓRIO, C.P.; ALVIANO, D.S.; ALVIANO, C.S.; LAGE, C.L.S. Chemical composition of the fractions of leaf oil of Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm. and antimicrobial activity. Revista Brasileira de Farmacognosia , v.19, n.3, p.697-701, 2009.).

O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antibacteriana do óleo essencial e do extrato etanólico de Alpinia zerumbet sobre cepas de Staphylococcus aureus, isoladas de mastite subclínica de vacas de um rebanho leiteiro e sobre cepas padrão ATCC.

MATERIAIS E MÉTODOS

As partes aéreas de Alpinia zerumbet (Pers.) B. L. Burtt & R. M. Sm. foram coletadas na Fazenda Tabuleiros II da empresa Anidro do Brasil Extrações S.A., Parnaíba, Piauí (latitude 03º01'27,5''S e longitude 41º44'53,5''W, a 35 m de altitude). As coletas foram realizadas no mês de julho de 2011, sempre no período da manhã. Uma exsicata do material botânico foi depositada no herbário da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (CEN), sob o nº de tombo 81.103.

O óleo essencial (OE) foi obtido a partir de folhas recém-colhidas de A. zerumbet, submetidas à destilação por arraste a vapor d'água (Simões; Spitzer, 1999SIMÕES, C.M.; SPITZER, V. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Rio Grande do Sul: Editora da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1999. 821p.; Matos, 2009MATOS, F.J.A Introdução à fitoquímica experimental. 3a.ed. Fortazela: UFC, 2009. 141p.). Após a condensação dos vapores, o óleo essencial foi separado da fase aquosa, obtendo-se o hidrolato e o óleo essencial bruto. Para preparo do extrato etanólico (EE), folhas verdes de A. zerumbet foram secas em estufa de circulação forçada de ar a 45ºC e, a seguir, trituradas em moinho de facas (peneira de 1 mm). Após esse procedimento, 150 g do material foram submetidos à maceração a frio em etanol P.A., de acordo com Matos (2009MATOS, F.J.A Introdução à fitoquímica experimental. 3a.ed. Fortazela: UFC, 2009. 141p.).

A análise cromatográfica do OE de A. zerumbet foi realizada por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) em cromatógrafo Varian CG-450/MS-240 (Palo Alto, EUA) com impacto de elétrons a 70 eV, coluna cromatográfica VF-5MS metilpolissiloxano (30 m x 0,25 mm x 1,0 µm; Varian Inc.), modo de injeção com divisão de fluxo de 1:100, gás carreador hélio com fluxo de 1 mL.min-1, temperatura do injetor 250ºC e temperatura da linha de transferência 250ºC. Programação do forno cromatográfico: temperatura inicial de 70ºC com rampa de aquecimento de 4ºC.min-1 até 180ºC, seguida por rampa de aquecimento de 10ºC.min-1 até 250ºC. A identificação dos compostos foi realizada pela análise dos padrões de fragmentação exibidos nos espectros de massas, sendo confirmada por comparação dos seus espectros de massas com aqueles presentes na base de dados fornecida pelo equipamento (NIST 287.324 compostos), bem como por meio da comparação dos seus índices de retenção com os de compostos conhecidos, obtidos por injeção de uma mistura de padrões contendo uma série homóloga de n- alcanos C7-C22, e dados da literatura (Adams, 2007ADAMS, R.P. Identification of essential oil components by gas chromatography mass spectrometry . 4. ed. Carol Stream: Allured Publ. Corp, 2007. 469p; Nist Chemistry webbook, 2011NIST CHEMISTRY WEBBOOK. 2011. Disponível em: <Disponível em: http://webbook.nist.gov/chemistry >. Acesso em: 13 out. 2013.
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). A análise por cromatografia gasosa acoplada com detector de ionização de chama (CG-DIC) foi realizada num instrumento Shimadzu QP-2010 Plus (Kioto, Japão), com detector de ionização por chama (DIC), coluna RTX-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm; Restek), modo de injeção com divisão de fluxo de 1:30, gás carreador nitrogênio com fluxo constante de 1,5 mL.min-1, temperatura do injetor 250ºC e temperatura do detector 280ºC. As condições de separação foram as mesmas empregadas no CG-EM. A contribuição de cada composto volátil na mistura foi dada pela área relativa (%) do seu respectivo pico no cromatograma, registrado por DIC.

A análise cromatográfica do EE de A. zerumbet foi realizada por eluição em um cartucho C18 de extração em fase sólida (500 mg, SampliQ, Agilent), utilizando-se como fase móvel água e metanol nas seguintes proporções de solvente orgânico: 0% (EE-F1); 25% (EE-F2); 50% (EE-F3); 75% (EE-F4); 100% (EE-F5). As frações obtidas foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), por meio de um cromatógrafo Varian 920-LC acoplado a um detector de arranjo de diodo (DAD) e munido de coluna de fase inversa (Microsorb 100 C18, 250 x 4,6 mm, 5 µm), termostatizada a 30ºC. A fase móvel foi constituída por H2O ultrapura (Milli-Q), acidificada com 0,1% de ácido fosfórico (Vetec, Rio de Janeiro) e metanol grau HPLC (Tedia). As separações foram efetuadas com alíquotas de 20 µL, fluxo de 1mL.min-1 e gradiente de eluição 0-95% MeOH (0-35 min), seguido por corrida isocrática a 95% por 5 min. A identificação dos constituintes foi baseada no tempo de retenção e espectros de ultravioleta de 12 padrões analíticos: ácido gálico, ácido elágico, ácido ferúlico, ácido o -cumárico, ácido p -hidroxibenzoico, ácido trans -cinâmico, ácido vanílico, catequina, rutina, quercetina, epicatequina e campferol. As amostras, padrões e solventes foram previamente filtradas em membranas de nylon de 0,45 µm (Millipore).

Para aquisição das amostras de bactérias, realizou-se a triagem dos tetos mamários de vacas mestiças girolando em lactação, pertencentes ao rebanho experimental da Embrapa Meio-Norte, Unidade de Execução de Pesquisa Parnaíba, por meio do CMT, conforme descrição de Schalm et al. (1971SCHALM, O.W.; CARROL, E.J.; JAIN, N.C. Bovine mastitis . Philadelphia: Lea and Febiger, 1971. Chap. 11, p.249-282.). Nesse rebanho, dois tetos, um de cada vaca, apresentaram reação positiva, sendo identificados para a coleta das amostras, após lavagem com água e sabão, secagem com papel toalha e desinfecção do óstio do teto, utilizando-se álcool 70%. Foram coletados 10 mL de leite por teto mamário em tubos de ensaio esterilizados e identificados, sendo, em seguida, acondicionados sob refrigeração e encaminhados para o Laboratório de Bacteriologia da Embrapa Meio-Norte, Unidade de Execução de Pesquisa Parnaíba.

Para realização das análises microbiológicas, as amostras de leite das tetas das vacas positivas ao CMT foram homogeneizadas e alíquotas de 0,1 mL foram transferidas para placas de Petri contendo ágar Baird Parker (BP), ágar Nutriente e ágar Mac Conkey (Oxoid, U.K(r)). A seguir, as placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas. Após o crescimento microbiano, foi realizada a identificação das bactérias, por meio da observação das características morfológicas e microscópicas das colônias, utilizando-se a coloração de Gram (Quinn et al., 1994QUINN, P.J.; CARTER, M.E.; MARKEY, B.K.; CARTER, G.R. Clinical veterinary microbiology . London: Wolf, 1994. 648p.).

As colônias típicas e atípicas de Staphylococcus sp em ágar BP foram identificadas, transferidas para tubos de ensaio contendo caldo infusão de cérebro e coração e incubadas em estufa a 37ºC por 24 horas. A seguir, foram realizados testes de coagulase livre (Plasma Coagulase EDTA, Coagu-Plasma LB, Laborclin, Brasil), provas de catalase e colorações de Gram (Brasil, 2003BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução normativa nº 62, de 26 de agosto de 2003. Oficializa os métodos analíticos oficiais para análises microbiológicas para controle de produtos de origem animal e água. Diário Oficial da União, Brasília, 18 de setembro de 2003.). As provas de produção de acetoína, fermentação da glicose (aerobiose) e do manitol (aerobiose e anaerobiose) foram realizadas segundo Mac Faddin (1980MAC FADDIN, J.F. Biochemical test for identification of medical bacteria . 2nd ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980. 527p.) e os materiais isolados foram classificados de acordo com Baird-Parker (1990BAIRD-PARKER, A.C. The Staphylococci: an introduction. Journal for Applied Bacteriology symposium series , v.19, p.1S-8S, 1990.) como S. aureus .

O estudo da atividade antibacteriana foi realizado por meio do teste de difusão em ágar, de acordo com as recomendações da National Committee for Clinical Standards (NCCLS, 2003NCCLS. NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard. 6th ed Wayne: NCCLS, 2003.). Foram utilizadas cepas de S. aureus isoladas de duas vacas com mastite subclínica, denominadas isolado da vaca 1 (IV1) e isolado da vaca 2 (IV2), e cepas padrão de S. aureus ATCC 25923 (CP 25) e ATCC 29213 (CP 29). Foram preparadas suspensões de cada cepa em 5,0 mL de solução salina estéril a 0,85% (p/v), padronizadas e comparadas visualmente à escala 0,5 de Mc Farland (BioMéreux(r)). Com o auxílio de um swab estéril, a suspensão bacteriana foi semeada nas superfícies de placas para cultura de células com seis poços contendo ágar Muller-Hinton (Merck(r)). Em seguida, procedeu-se a perfuração de orifícios de 5,0 mm de diâmetro nos centros dos poços, com auxílio de uma ponteira estéril. Em cada orifício foram inoculados 100 µL das diferentes concentrações (100,0; 50,0; 25,0; 12,5 e 6,3 mg.mL-1) do OE e do EE ou controle (álcool etílico a 50% e Tween a 1%) com auxílio de micropipeta. Posteriormente, cada placa foi incubada a 37ºC por 24h. A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada medindo-se os halos de inibição de crescimento bacteriano formados ao redor dos orifícios. Todos os ensaios foram feitos em quadruplicata.

Como parâmetro para a atividade antimicrobiana do OE e do EE de A. zerumbet , foram utilizados os padrões de sensibilidade adotados por Ponce et al. (2003PONCE, A.G.; FRITZ, R.; DELVALLE, C.; ROURA, S.L. Antimicrobial activity of essential oils on native microbial population of organic SwissChard. Lebensmittel-Wissenschaft & Technologie , v.36, n.7, p.679-684, 2003.). Assim, a atividade das diferentes concentrações do OE e do EE foi classificada de acordo com o tamanho do halo de inibição, como não sensível (-), sensível (+), muito sensível (++) e extremamente sensível (+++), para diâmetros respectivos de ≤8; 9 a 14; 15 a 19; e ≥20 mm.

Na análise estatística foi utilizado um delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 x 6 x 4, constituído pelo extrato etanólico e óleo essencial, em 6 concentrações (incluindo o controle), sobre 4 cepas de S. aureus, com 4 repetições. O resultado final, determinado pela média aritmética dos halos de inibição (mm), foi submetido à análise de variância (p<0,01) e teste de Tukey (p<0,05), usando-se o programa ASSISTAT (Silva; Azevedo, 2009SILVA, F.A.S.; AZEVEDO, C.A.V. Principal components analysis in the software Assistat-Statistical Attendance. In: WORLD CONGRESS ON COMPUTERS IN AGRICULTURE, 7., 2009, Orlando. Proceedings. .. Reno: American Society of Agricultural and Biological Engineers, 2009. CD-ROM.).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As análises de CG-EM/DIC do OE das folhas de A. zerumbet permitiram a identificação de 23 compostos voláteis, correspondendo a aproximadamente 98,7% da constituição química, em termos de área relativa dos picos (Tabela 1). O OE de A. zerumbet foi constituído basicamente por monoterpenos (21), sendo p -cimeno (32,72%), 1,8-cineol (24,05%) e 4-terpineol (20,23%) os constituintes majoritários, além de 2 sesquiterpenos. Segundo dados da literatura, 1,8-cineol e 4-terpineol são comumente os principais componentes do óleo essencial dessa planta (Zoghbi et al., 1999ZOGHBI, M.G.B.; ANDRADE, E.H.A.; MAIA, J.G.S. Volatile constituents from leaves and flowers of Alpinia speciosa K. Schum. and A. pupurata (Viell.) Schum. Flavour and Fragrance Journal v.14, n.6, p.411-414, 1999.), enquanto que p -cimeno, em teores significativos, somente foi detectado em espécies cultivadas na ilha de Okinawa, Japão (Murakami et al., 2009MURAKAMI, S.; LI, W.; MATSUURA, M.; SATOU, T.; HAYASHI, S.; KOIKE, K. Composition and seasonal variation of essential oil in Alpinia zerumbet from Okinawa Island. Journal of Natural Medicines , v.63, n.2, p.204-208, 2009.).

Monoterpenos oxigenados são indicados como os principais responsáveis pela atividade antimicrobiana de óleos extraídos de A. zerumbet (Victório et al., 2009VICTÓRIO, C.P.; ALVIANO, D.S.; ALVIANO, C.S.; LAGE, C.L.S. Chemical composition of the fractions of leaf oil of Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm. and antimicrobial activity. Revista Brasileira de Farmacognosia , v.19, n.3, p.697-701, 2009.). Janssen; Scheffer (1985JANSSEN, A.M.; SCHEFFER, J.J. Acetoxychavicol acetate, an antifungal component of Alpinia galanga Planta Médicav.51, n.6, p.507-511, 1985.) e Matasyoh et al. (2007MATASYOH, J.C.; KIPLIMO, J.J.; KARUBIU, N.M.; HAILSTORKS, T.P. Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil of Tarchonanthus camphorates Food Chemistryv.101, n.3, p.1183-1187, 2007.) atribuem a 4-terpineol e 1,8-cineol a capacidade de inibir vários micro-organismos agindo, esse último, também contra S. aureus (Gachkar et al., 2007GACHKAR, L.; YADEGARI, D.; REZAEI, M.B.; TAGHIZADEH, M.; ASTANEH, S.A.; RASOOLI, I. Chemical and biological characteristics of Cuminum cyminum and Rosmarinus officinalis essential oils. Food Chemistry v.102, n.3, p.898-904, 2007.). Segundo Oonmetta-Aree et al. (2006OONMETTA-AREE, J.; SUZUKI, T.; GASALUCK, P.; EUMKEB, G. Antimicrobial properties and action of galangal (Alpinia galanga Linn.) on Staphylococcus aureus LWT - Food Science and Technology,v.39, n.10, p.1214-1220, 2006.), a ação antimicrobiana pode estar relacionada à presença de sesquiterpenos em folhas, raízes e flores de espécies da família Zingiberaceae. Por sua vez, há evidências de que o p -cimeno interfira em atividade antimicrobiana, quando junto a outros constituintes, agindo por meio de um efeito sinérgico (Paster et al., 1995PASTER, N.; MENASHEROV, M.; RAVID, U.; JUVEN, B. Antifungal activity of oregano and thyme essential oils applied as fumigants against fungi attacking stored grain. Journal of Food Protection , v.58, n.1, p.81-85, 1995.). Mesmo aquelas substâncias que estão em pequenas proporções na planta podem ser responsáveis pela atividade biológica (Lima et al., 2014LIMA, A.S.; SOUSA FILHO, J.G.M.; PEREIRA, S.G.; GUILLON, G.M.S.P.; SANTOS, L.S.; COSTA JUNIOR, L.M. Acaricide activity of different extracts from Piper tuberculatum fruits against Rhipicephalus microplus . Parasitology Research , v.113, n.1, p.107-112, 2014.), dependendo do potencial de ação da mesma e de seu sinergismo com as demais substâncias do óleo. Há uma ampla variedade de compostos com atividade antimicrobiana no OE de A. Zerumbet (Victório et al., 2009VICTÓRIO, C.P.; ALVIANO, D.S.; ALVIANO, C.S.; LAGE, C.L.S. Chemical composition of the fractions of leaf oil of Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm. and antimicrobial activity. Revista Brasileira de Farmacognosia , v.19, n.3, p.697-701, 2009.), o que indica seu grande potencial para desenvolvimento de novas drogas.

As análises de CLAE-DAD revelaram que o EE das folhas de A. zerumbet era rico em compostos fenólicos. As frações derivadas continham o ácido elágico e ao menos três flavonoides: rutina, quercetina e campferol (Tabela 2). No extrato aquoso das folhas de A. zerumbet , Mpalantinos et al. (1998MPALANTINOS, M.A.; SOARES DE MOURA, R.; PARENTE, J.P.; KUSTER, R.M. Biologically active flavonoids and kava pyrones from the aqueous extract of Alpinia zerumbet Phytotherapy Research, v.12, n.6, p.442-444, 1998.) identificaram a presença de rutina e derivados glicosilados de campferol, além de catequinas. Por sua vez, no extrato de acetato de etila das folhas de A. zerumbet,Elzaawely et al. (2007ELZAAWELY, A.A.; XUAN, T.D.; TAWATA, S. Essential oils, kava pyrones and phenolic compounds from leaves and rhizomes of Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt. & R.M. Sm. and their antioxidant activity. Food Chemistry , v.103, n.2, p.486-494, 2007.) encontraram vários ácidos fenólicos, tais como ácido siríngico, ácido ferúlico, ácido p -cumárico, ácido p -hidroxi-benzoico, ácido cinâmico, ácido vanílico, enquanto que somente o ácido elágico foi detectado no presente trabalho. Essas diferenças nos constituintes dos óleos e extratos podem ser atribuídas à origem da planta e época de colheita, pois a composição das substâncias é dependente de fatores como luminosidade, calor, constituição do solo e umidade (Lapa et al., 1999LAPA, A.J.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P.R. Farmacologia e toxicologia de produtos naturais. In: SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P. R. (eds). Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre: UFRGS, 1999. p.181-196. ).

Extratos de diversas espécies medicinais, que contêm flavonoides, possuem ação contra S. aureus (Pinho et al., 2012PINHO, L.; SOUZA, P.N.S.; SOBRINHO, E.M.; ALMEIDA, A.C.; MARTINS, E.R. Atividade antimicrobiana de extratos hidroalcoólicos das folhas de alecrim-pimenta, aroeira, barbatimão, erva baleeira e do farelo da casca de pequi. Ciência Rural , Santa Maria, v.42, n.2, p.326-331, 2012.). Alguns trabalhos relatam a capacidade dos flavonoides de inibir a função da membrana citoplasmática, com consequente destruição da integridade celular das bactérias, além da inibição do metabolismo energético e inibição da síntese de DNA das mesmas. Os flavonoides detectados neste trabalho são reportados por possuírem ação antimicrobiana (Cushnie; Lamb, 2005CUSHNIE T.P.; LAMB, A.J. Antimicrobial activity of flavonoids. International Journal of Antimicrobial Agents , v.26, n.5, p.343-356, 2005. ). Além disso, a atividade antimicrobiana determinada pelo ácido elágico já foi descrita por Chung (1998CHUNG, J.G. Inhibitory actions of ellagic acid on growth and arylamine N-acetyltransferase activity in strains of Helicobacter pylori from peptic ulcer patients. Microbios , v.93, n.375, p.115-127, 1998.) e Vattem; Shetty (2005VATTEM, D.A.; SHETTY, K. Biological functionality of ellagic acid: a review. Journal of Food Biochemistry , v.29, n.3, p.234-266, 2005. ).

A atividade antibacteriana das cinco concentrações do OE e do EE das folhas de A. zerumbet contra as cepas de S. aureus é apresentada na Tabela 3. O maior halo de inibição (35 mm) foi obtido por ação do OE contra a cepa IV2, havendo inibição total do crescimento bacteriano induzida pela concentração de 100 mg.mL-1. Esses resultados foram superiores aos apresentados por Lobato et al. (1989LOBATO, A.M.; RIBEIRO, A.; PINHEIRO, M.F.S.; MAIA, J.G.S. Atividade antimicrobiana de óleos essenciais da Amazônia. Acta Amazônica , v.19, n.1, p.355-363, 1989.) que, ao avaliarem o OE das folhas de A. zerumbet sobre S. aureus, obtiveram halos de inibição que variaram de 0,7 a 14 mm. Essa diferença de ação pode ser atribuída à origem diversa, que determina diferença na composição dos mesmos (Lapa et al., 1999LAPA, A.J.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P.R. Farmacologia e toxicologia de produtos naturais. In: SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P. R. (eds). Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre: UFRGS, 1999. p.181-196. ).

Os halos de inibição do OE foram significativamente superiores (p<0,01) em relação àqueles induzidos pelo EE de A. zerumbet diante das cepas CP25 (100 mg.mL-1), IV1 (100,0; 50,0 e 12,5 mg.mL-1) e IV2 (em todas as concentrações). De forma geral, o OE exibiu maior atividade do que o EE (Tabela 3), sugerindo que haja maior concentração de compostos químicos ativos contra o S. aureus no OE do que no EE de A. zerumbet . Resultados similares foram observados, cuja ação de OE se sobrepõe aos de extratos obtidos com a mesma espécie medicinal, diante de S. aureus (Vukovic et al., 2007VUKOVIC, N.; MILOSEVIC, T.; SUKDOLAK, S.; SOLUJIC, S. Antimicrobial activities of essential oil and methanol extract of Teucrium montanum Evidence-Based of Complementary Alternative Medicine , v.4, suppl.1, p.17-20, 2007.; Gonçalves et al., 2008GONÇALVES, F.A.; ANDRADE NETO, M.; BEZERRA, J.N.S.; MACRAE, A.; SOUSA, O.V.; FONTELES-FILHO, A.A.; VIEIRA, R.H.S.F. Antibacterial activity of guava, Psidium guajava Linnaeus, leaf extracts on diarrhea-causing enteric bacteria isolated from Seabob shrimp, Xiphopenaeus kroyeri (Heller). Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo , v.50, n.1, p.11-15, 2008.).

De acordo com a classificação de PONCE et al. (2003PONCE, A.G.; FRITZ, R.; DELVALLE, C.; ROURA, S.L. Antimicrobial activity of essential oils on native microbial population of organic SwissChard. Lebensmittel-Wissenschaft & Technologie , v.36, n.7, p.679-684, 2003.), na concentração de 100 mg.mL-1 todas as cepas de S. aureus foram extremamente sensíveis (halo de 20 mm) ao OE de A. zerumbet , exceto a cepa CP29, que foi muito sensível (halo de 15 a 19 mm), enquanto que, mesmo com a concentração reduzida para 50 mg.mL-1, as cepas IV1 e IV2 permaneceram extremamente sensíveis (halo de 20 mm) (Tabela 3). Todas as cepas apresentaram sensibilidade ao EE de A. zerumbet (halo de 9 a 14 mm) na concentração de 50 mg.mL-1, enquanto que as cepas CP25 e IV2 foram muito sensíveis (halo de 15 a 19 mm), quando utilizada a concentração de 100 mg.mL-1. Esses dados confirmam o potencial do OE e do EE no controle de S. aureus.

A ação antibacteriana de extratos de plantas do gênero Alpinia pode variar amplamente de acordo com a espécie, partes da planta, origem, método de extração e solvente utilizado. Esses fatores podem interferir na composição química e proporção de metabólitos secundários dos extratos (Czelusniak et al., 2012CZELUSNIAK, K.E.; BROCCO, A.; PEREIRA, D.F.; FREITAS, G.B.L. Farmacobotânica, fitoquímica e farmacologia do Guaco: revisão considerando Mikania glomerata Sprengel e Mikania laevigata Schulyz Bip. ex Baker. Revista Brasileira de Plantas Medicinais , v.14, n.2, p.400-409, 2012.). Extratos hidroalcoólicos das raízes de Alpinia officinarum determinaram ação sobre S. aureus, proporcionalmente superior àquela induzida pelo EE de A. zerumbet (Srividya et al., 2010SRIVIDYA, A.R.; Dhanabal, s.p.; misra, v.k.; suja, g. Antioxidant and antimicrobial activity of Alpinia officinarum . Indian Journal of Pharmaceutical Science v.72, n.1, p.145-148, 2010.). Extratos metanólicos e aquosos de Alpinia allughas e Alpinia calcarata induziram maiores inibições sobre S. aureus , quando preparados a partir das raízes em comparação com aqueles produzidos com folhas das mesmas espécies (Bhunia; Mondal, 2012BHUNIA, D.; MONDAL, A.K. Antibacterial Activity of Alpinia L. (Zingiberaceae) from Santal and Lodha Tribal Areas of Paschim Medinipur District in Eastern India. Advances in Bioresearch ,v.3, n.1, p.54-63, 2012.). Por outro lado, os autores avaliaram também a ação de extratos de Alpinia galanga e obtiveram melhores resultados com as folhas, em comparação àqueles preparados com as raízes. É possível que em determinadas espécies de Alpinia haja maior concentração de substâncias ativas contra S. aureus nas raízes. No entanto, a elaboração de extratos a partir de folhas tem a vantagem de promover a sobrevivência da planta (Pinho et al., 2012PINHO, L.; SOUZA, P.N.S.; SOBRINHO, E.M.; ALMEIDA, A.C.; MARTINS, E.R. Atividade antimicrobiana de extratos hidroalcoólicos das folhas de alecrim-pimenta, aroeira, barbatimão, erva baleeira e do farelo da casca de pequi. Ciência Rural , Santa Maria, v.42, n.2, p.326-331, 2012.), sendo, portanto, uma prática sustentável que deve ser estimulada.

Novos estudos devem ser realizados para avaliar o potencial do OE e do EE das folhas de A. zerumbet em formulações para infusão intramamária, em modelos com bovinos.

CONCLUSÃO

O OE e o EE das folhas de A. zerumbet possuem ação significativa contra Staphylococcus aureus, portanto, possuem importante potencial como fonte de novos compostos antibacterianos para o controle da mastite bovina.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Antônio Almeida de Paz Neto e João Batista Alves de Souza pela colaboração nos experimentos.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    2016

Histórico

  • Recebido
    28 Fev 2014
  • Aceito
    09 Dez 2015
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