ESTUDO DO DERIVADO DO ÓLEO DE RICINUS COMMUNIS L. (MAMONA) COMO AGENTE BIOCIDA E REDUTOR DA VISCOSIDADE PRODUZIDA POR LEUCONOSTOC MESENTEROIDES EM INDÚSTRIAS SUCROALCOOLEIRAS

STUDY OF A RICINUS COMMUNIS L. (CASTOR OIL) DERIVATIVE AS A BIOCIDAL AGENT AND VISCOSITY REDUCER ON LEUCONOSTOC MESENTEROIDES IN THE SUGAR AND ALCOHOL INDUSTRIES

M.A. Messetti A.M. dos Santos D.F de Angelis G.O. Chierice S. Claro NetoSobre os autores

RESUMO

Das sementes da mamona extrai-se o óleo de rícino, utilizado in natura ou em sua forma modificada nas áreas médica, farmacêutica e industrial. Um de seus derivados químicos - o Poliquilgerm® - evidencia propriedades antifúngicas sobre Candida albicans e bacteriostática/ bactericida sobre Escherichia coli no nível de 99,9%. Considerando-se essas propriedades, aplicouse o Poliquilgerm® em culturas de Leuconostoc mesenteroides, uma das espécies de bactéria contaminante dos mostos em indústrias sucroalcooleiras. Esta bactéria quando presente em mostos produz além do ácido láctico, a dextrana, que é um polímero da glicose que aumenta a viscosidade dos fluidos dos processos. No presente trabalho avaliou-se o efeito de diferentes concentrações do Poliquilgerm® sobre a viscosidade produzida por L. mesenteroides em diferentes meios de cultivo, condições de pH, e temperatura. Verificou-se 20,56% de diminuição da viscosidade quando se utilizou 1,0% do produto, além da inibição do crescimento da bactéria após 20 horas em contato com 1,0 e 0,2% de Poliquilgerm®. L. mesenteroides apresentou melhor crescimento em valores de pH 6,0, tanto a 28 como a 33º C, evidenciado pela maior produção de biomassa. Além disso, em meio de cultura neste pH verificou-se maior porcentagem de diminuição da viscosidade em ambas as concentrações utilizadas. Estas mesmas concentrações alcançaram até 100% de diminuição das UFC/mL após 24 horas em contato com o produto, evidenciado por quantificação da biomassa e confirmado mediante plaqueamento pela técnica “Pour Plate”.

PALAVRAS-CHAVE
Poliquilgerm®; Leuconostoc mesenteroides ; mamona; viscosidade

ABSTRACT

Castor-oil, extracted from seeds of Ricinus communis L., is normally used in natura or in its modified form in the medical, pharmaceutical and industrial areas. One of its chemical derivates – Poliquilgerm® – has shown antifungal properties on Candida albicans, and bacteriostatic/bactericide effects on Escherichia coli reaching 99.9%. Considering these features, in the present study Poliquilgerm® was applied in cultures of Leuconostoc mesenteroides, a frequent contaminant bacterium of musts in the sugar and alcohol industries. This bacterium, when a contaminant of must, produces lactic acid as well as dextran, a polymer of glucose which may increase the viscosity of fluids in the operation. The present study evaluated the effect of different concentrations of Poliquilgerm® on viscosity produced by L. mesenteroides cultures under different conditions of various culture media, pH and temperature. A 20.56% decrease in viscosity was verified when 1.0% of the product was used, and bacterium growth inhibition after 20 hours in media with 1.0 and 0.2% of Poliquilgerm®. L. mesenteroides showed a higher growth rate in pH 6.0, at both 28 and 33º C, evidenced by greater biomass production. Also, in the culture media at this pH a greater decrease in viscosity percentages was verified at both concentrations used. The media with these same concentrations reached up to 100% decrease of UFC/mL after 24 hours in the presence of the product, observed by biomass quantification and confirmed by the Pour Plate technique.

KEY WORDS
Poliquilgerm®; Leuconostoc mesenteroides ; castor oil; viscosity

INTRODUÇÃO

A fermentação etanólica no Brasil processa-se em condições não assépticas, sendo frequente a contaminação por bactérias. Esses contaminantes constituem um dos maiores problemas, tanto operacionais como econômicos na indústria. A situação nesta etapa agrava-se com o reciclo de células de levedura para aumentar a produtividade, pois também ocorre concentração das bactérias. A contaminação bacteriana origina-se durante as operações de transferência da cana-de-açúcar do campo até a unidade industrial, envolvendo corte, carregamento, transporte, descarregamento e armazenamento da matéria-prima (ROSALES, 1989ROSALES, S.Y.R. Contaminantes bacterianos da fermentação etanólica. isolamento em meios diferenciais, identificação e avaliação de desinfetantes. 1989. 200 f. Tese (Doutorado em Biologia Vegetal) - Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, 1989.).

São as bactérias Gram-positivas que mais induzem problemas no processo fermentativo, provavelmente devido ao fato da parede celular das bactérias Gram-negativas ser rica em lipídeos, os quais são facilmente solubilizados em álcool, presente nas dornas de fermentação. Os trabalhos de RODINI (1985)RODINI, M.A.T. Isolamento, caracterização e identificação de bactérias contaminantes de dornas de fermentação nas destilarias de etanol. 1985. 92f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Agrícola) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 1985. e GALLO (1989)GALLO, C.R. Determinação da microbiota bacteriana de mosto e de dornas de fermentação alcoólica. 1989. 388 f. Tese (Doutorado em Ciências de Alimentos) – Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 1989. comprovaram a dominância das bactérias Gram-positivas. As bactérias contaminantes concorrem com a levedura Saccharomyces cerevisiae pelo açúcar disponível, realizando fermentações secundárias que resultam na produção de outros subprodutos que não o álcool. Estes subprodutos podem alterar características físico-químicas como pH, acidez, viscosidade; bem como a morfologia das leveduras, induzindo a floculação e à deformação celular devido à presença de gomas e ácidos orgânicos, respectivamente (ROSALES, 1989ROSALES, S.Y.R. Contaminantes bacterianos da fermentação etanólica. isolamento em meios diferenciais, identificação e avaliação de desinfetantes. 1989. 200 f. Tese (Doutorado em Biologia Vegetal) - Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, 1989.).

Leuconostoc mesenteroides é um dos contaminantes mais frequentes no processo de fermentação industrial para produção de etanol, pois produz, além do ácido láctico, a dextrana. A dextrana manifesta-se na forma de uma massa gelatinosa transparente conhecida na indústria como “goma” ou “canjica”; causando diversos prejuízos físicos devido ao aumento da viscosidade do mosto, com consequente entupimento dos trocadores de calor, tubulações e centrífugas, além de possíveis danos para a levedura. De acordo com HOLT et al. (1986)HOLT, J.G.; MAIR, N.S.; SHARPE, M.E.; SNEATH, P.H.A. Bergey‘s manual of systematic bacteriology. Baltimore: Williams & Wilkins, 1986. v.2., o gênero Leuconostoc é formado por bactérias Gram-positivas, anaeróbias facultativas. Sua sensibilidade a antibióticos e drogas é desconhecida visto que nenhuma espécie é confirmada como patogênica. A síntese de dextrana ocorre a partir de uma enzima extracelular, uma glicosiltransferase (dextranasacarase), que possui a propriedade de atuar sobre a molécula de sacarose, liberando a frutose e transferindo a molécula de glicose a uma molécula receptora, no caso moléculas de dextrana em expansão.

Muitas técnicas vêm sendo utilizadas para controlar a contaminação bacteriana, como a aplicação de ácido sulfúrico para baixar o pH e biocidas que favorecem a levedura. Rotineiramente utiliza-se o ácido sulfúrico após a centrifugação do fermento e antes dele ser submetido a uma nova etapa fermentativa (SILVA FILHO, 1993SILVA FILHO, E.A. Fermentação etanólica. influência do ácido sulfúrico sobre a viabilidade da levedura de processo e bactérias e leveduras contaminantes. 1993. 65f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Aplicada) – Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, 1993.). A acidez do meio é adequada para o desenvolvimento da levedura (pH 4,0-5,0), sendo prejudicial à maioria das bactérias contaminantes. Assim, a aplicação de ácido é empregada como medida preventiva e controladora de infecções, embora valores de pH muito baixos possam afetar a levedura (ROSALES, 1989ROSALES, S.Y.R. Contaminantes bacterianos da fermentação etanólica. isolamento em meios diferenciais, identificação e avaliação de desinfetantes. 1989. 200 f. Tese (Doutorado em Biologia Vegetal) - Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, 1989.). Segundo GUERRA (1995)GUERRA, E.J. Isolamento de bactérias contaminantes da fermentação etanólica que induzem a floculação de Saccharomyces cerevisiae e sua sensibilidade a agentes antimicrobianos. 1995. 150 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Aplicada) – Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, 1995., a utilização frequente de ácido sulfúrico pelas destilarias no intuito de combater as contaminações bacterianas pode gerar alguns problemas, como aqueles associados à qualidade do álcool, morte das leveduras, corrosão nos equipamentos, segurança pessoal e instabilidade do sistema. Como substâncias alternativas são utilizados antibióticos e biocidas para o controle das infecções.

O óleo de mamona destaca-se economicamente pela versatilidade química no ramo industrial. Segundo CHIERICE; CLARO-NETO (2001)CHIERICE, G.O.; CLARO-NETO, S. Aplicação industrial do óleo. In: AZEVEDO, D.M.P.; LIMA, E.F. (Ed.). O agronegócio da mamona no Brasil. Brasília: Embrapa, 2001. cap.5., este óleo é um triglicerídeo rico em ácido ricinoleico, presente em 89,5% de sua composição. A presença de hidroxila, insaturação e carboxila – que são três grupos funcionais altamente reativos no ácido ricinoleico - faz com que este óleo possa ser submetido a diversos processos químicos para a obtenção de subprodutos utilizados nas áreas farmacêutica, cosmética, de lubrificantes, polímeros e produção de biodiesel etc. Os polímeros de ácidos graxos são utilizados na elaboração de próteses e implantes, substituindo o silicone e outros materiais em cirurgias ósseas e de próstata. Em 1984, o Grupo de Química Analítica e Tecnologia de Polímeros (GQATP) do Instituto de Química da Universidade de São Paulo, em São Carlos, desenvolveu novos polióis derivados do óleo da mamona (IGNÁCIO, 1995 apud REZENDE et al., 2001REZENDE, C.M.F.; SILVA, M.C.; LARANJEIRA, M.G.; BORGES, A.P.B. Estudo experimental do poliuretano de óleo de mamona (Ricinus communis) como substituto parcial do tendão calcâneo comum em coelhos (Oryctolagus cuniculus). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.53, n.6, p.695-700, 2001.). Dentre os polióis desenvolvidos, o Endoquil® tem sido aplicado como bactericida na área odontológica, sendo utilizado em substituição ao hipoclorito de sódio para irrigação de canais e apresentando atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas (FERREIRA, 1996FERREIRA, C.M. Atividade antimicrobiana. Estudo “in vivo” da atividade antimicrobiana do gel de papaína a 0,4%, detergente de mamona a 10%, hipoclorito de sódio a 0,5% utilizados como soluções irrigantes em Endodontia. 1996. 85f. Monografia (Residência em Endodontia) – Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 1996., LEONARDO et al., 2001LEONARDO, M.R.; SILVA, L.A.B.; FILHO, M.T.; BONIFÁCIO, K.C.; ITO, I.Y. In vitro evaluation of the antimicrobial activity of a castor oil-based irrigant. Journal of Endodontics, v.27, n.12, p.717-719, 2001.). O grupo GQATP sintetizou outros produtos com aplicações na área médica, como a poliuretana partindo de polióis derivados do óleo de mamona para implantes em aves (BOLSON et al., 2005BOLSON, J.; SCHOSSLER, J.E.; ORNES, R.C.; MOTTIN, V.; ALBERTI, T. Análise clínica, radiológica, macroscópica e histológica do úmero de codornas domésticas (Coturnix japonica), submetido ao implante da poliuretana derivada do polímero de mamona (Ricinnus communis). Ciência Rural, v.35, n.5, p.1123-1130, 2005.; REZENDE et al., 2001REZENDE, C.M.F.; SILVA, M.C.; LARANJEIRA, M.G.; BORGES, A.P.B. Estudo experimental do poliuretano de óleo de mamona (Ricinus communis) como substituto parcial do tendão calcâneo comum em coelhos (Oryctolagus cuniculus). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.53, n.6, p.695-700, 2001.). Outro poliol, o Poliquilgerm®, foi avaliado por BERTOLETTI et al. (2004)BERTOLETTI, A.C.D.; SANTOS, A.M.; ANGELIS, D.F.; CHIERICE, G.O.; CLARO NETO, S. Viabilidade de Candida albicans CCT 0776 in vitro sob atividade antimicrobiana do Poliquilgerm® derivado do óleo de Ricinus communis L. (mamona). In: ENCONTRO DE BIÓLOGOS DO CONSELHO REGIONAL DE BIOLOGIA – 1, 15., 2004, São Pedro. Resumos. São Pedro: 2004. p.142. res. 11.28. e MESSETTI et al. (2005)MESSETTI, M.A.; SANTOS, A.M.; ANGELIS, D.F.; DALFRÉ, I.A.B.; CHIERICE, G.O.; CLARO NETO, S. Viabilidade de Escherichia coli CCT 1457 in vitro sob atividade antimicrobiana do Poliquilgerm® derivado do óleo de Ricinus communis L. (mamona). In: WORKSHOP INTERNACION AL SOBRE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL – “DESAFIOS E OPORTUNIDADES NA AMÉRICA DO SUL”, 2005, Campinas. Resumos. Campinas: Universidade Estadual de Campinas, 2005. 1 CD-ROM., que verificaram in vitro efeito microbiostático sobre Candida albicans e Escherichia coli CCT 1457. OLIVEIRA (2005)OLIVEIRA, M.G.R. Estudo da decomposição de sacarose por hidrólise utilizando uma mistura de ésteres derivados do óleo de mamona. 2005. 98f. Dissertação (Mestrado em Química Analítica) – Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2005., estudando a decomposição de sacarose por hidrólise, utilizou uma mistura de ésteres derivados do óleo de mamona e verificou a sua capacidade hidrolítica na formação de glicose e frutose. Assim, acredita-se que os ésteres atuem como “transferidores” de água para a molécula de sacarose, catalisando a reação hidrolítica ao romper a ligação glicosídica, que também está presente na parede celular das bactérias.

O presente estudo propõe a utilização do derivado do óleo de mamona – Poliquilgerm® - como agente biocida no controle das contaminações pela bactéria L. mesenteroides em indústrias sucro-alcooleiras, visando a diminuição da viscosidade do mosto contaminado. Para tanto, avaliou-se o efeito de diferentes concentrações de Poliquilgerm® sobre L. mesenteroides, com relação às mudanças de viscosidade dos meios de cultura e a verificação do crescimento da bactéria.

MATERIAL E MÉTODOS

A bactéria Leuconostoc mesenteroides (B512) foi inoculada em meio de cultura MAYEUX; COLMER (1961)MAYEUX, J.V.; COLMER, A.R. Selective medium for Leuconostoc detection. Journal of Bacteriology, v.81, n.6, p1009–1011, 1961. para produção de goma e incubada por 24 horas a 30 ± 1º C. A partir deste inóculo, a bactéria foi cultivada em erlenmeyers de 125 mL contendo 50 mL do mesmo meio de cultura, no qual foram acrescidos diferentes concentrações de Poliquilgerm®. No primeiro experimento, foram utilizadas as concentrações 2,0 e 1,0%. Nos experimentos seguintes, optou-se por manter a concentração 1,0% e avaliar uma concentração mais baixa do produto, no caso 0,2%. As culturas e os controles (contendo apenas meio de cultura) foram mantidos em "shaker" a 100 rpm, na temperatura de 30 ± 1º C por 24 horas. Decorrido o tempo de cultivo, mediu-se a viscosidade utilizando-se viscosímetro de Cannon-Fenske, a 21 ± 1º C. O crescimento de L. mesenteroides, na ausência e presença de 1,0 e 0,2% de Poliquilgerm®, foi verificado por meio de espectrofotometria, mediante medidas de absorbância a λ = 540 nm nos tempos 0, 6, 20 e 26 horas.

Em etapa posterior, preparou-se meio de caldo de cana suplementado com nutrientes (CSN) nos pHs 3,0; 4,0; 5,0 e 6,0, onde adicionou-se 0,2 e 1,0% de Poliquilgerm®, na ausência e presença da cultura de L.mesenteroides. Os controles e as culturas foram incubados em "shaker" a 100 rpm nas temperaturas de 33 ± 1º C e 28 ± 1º C por 24 horas. Em seguida, mediu-se a viscosidade utilizando-se viscosímetro de Cannon-Fenske a 21 ± 1º C, e efetuou-se a verificação do crescimento da cultura mediante análise da biomassa.

Todos os experimentos foram realizados em triplicata e as análises estatísticas efetuadas através do software The SAS System 9.1, utilizando-se análises de variância (ANOVA) com modelos fatoriais e teste de Tukey, com nível de significância de 0,05.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Atividade do Poliquilgerm® sobre culturas de L. mesenteroides, em meio Mayeux e Colmer.

Quantificação comparativa da viscosidade

A viscosidade das culturas de L. mesenteroides diminuiu após 24 horas em contato com o produto, e a porcentagem de diminuição foi calculada com base na viscosidade das amostras controle. No primeiro experimento houve 18,13% de diminuição da viscosidade da cultura quando se adicionou 1,0% de Poliquilgerm® e 9,91% quando foi adicionado 2,0% (Fig. 1).

Fig. 1
Porcentagem de diminuição da viscosidade das culturas de Leuconostoc mesenteroides acrescidas de 1,0 e 2,0% de Poliquilgerm®.

No segundo e terceiro experimentos, realizados em concentrações mais baixas do produto, verificouse 20,56 e 13,92% de diminuição da viscosidade da cultura quando adicionou-se 1,0% de Poliquilgerm®; e 16,90 e 8,97% quando foi adicionado 0,2%, respectivamente (Fig. 2).

Fig. 2
Porcentagem de diminuição da viscosidade das culturas de Leuconostoc mesenteroides acrescidas de 1,0 e 0,2% de Poliquilgerm®.

As concentrações 0,2; 1,0 e 2,0% do produto não diferiram estatisticamente entre si. Entretanto, a concentração 1,0% de Poliquilgerm® foi a que apresentou as maiores porcentagens em diminuição da viscosidade. Pode-se concluir por meio desta análise que a adição de Poliquilgerm® nas culturas de L. mesenteroides induz a diminuição da viscosidade do meio, independente da dosagem utilizada.

A viscosidade causada por bactérias lácteas nos fluidos dos processos industriais assume importância quando estes devem ser agitados ou transferidos dos reatores para outros locais na indústria. A presença de alta viscosidade torna os processos energeticamente onerosos e isto reflete no custo geral dos produtos.

Crescimento da cultura de L. mesenteroides mediante quantificação da absorbância

A análise por espectrofotometria na região do visível (λ = 540 nm) nos intervalos 0; 6; 20 e 26 horas mostrou diminuição do crescimento do micro-organismo de 53,86, 67,59 e 56,56%, respectivamente, após 6, 20 e 26 horas em contato com 0,2% de Poliquilgerm®. Quando em contato com 1,0% de Poliquilgerm®, verificou-se diminuição do crescimento do micro-organismo de 22,39 e 17,97%, respectivamente após 20 e 26 horas (Fig. 3). A maior diminuição ocorreu em 20 horas para ambas as concentrações do produto, sendo que a menor concentração de Poliquilgerm® (0,2%) mostrou-se mais eficiente para promover o controle de L. mesenteroides. Segundo HOLT et al. (1986)HOLT, J.G.; MAIR, N.S.; SHARPE, M.E.; SNEATH, P.H.A. Bergey‘s manual of systematic bacteriology. Baltimore: Williams & Wilkins, 1986. v.2., a sensibilidade do gênero Leuconostoc a antibióticos e drogas é desconhecida, visto que nenhuma espécie é confirmada como patogênica.

Fig. 3
Quantificação da absorbância nas culturas de Leuconostoc mesenteroides acrescidas de 1,0 e 0,2% de Poliquilgerm®.

A análise de variância mostrou que todas as variáveis analisadas apresentaram-se estatisticamente significativas. Os valores de absorbância nas concentrações de 0,0; 0,2 e 1,0% diferiram entre si. A maior média dos valores de absorbância foi obtida na ausência do produto (0,5798 nm), e a menor média na presença de 0,2% de Poliquilgerm® (0,1560 nm). Como a medida de absorbância por espectrofotometria é indicativa de crescimento de micro-organismos, estes resultados mostram o maior crescimento de L. mesenteroides na ausência do produto. Com a adição de 0,2% de Poliquilgerm® registrou-se menor crescimento do micro-organismo, indicando ação inibitória do produto adicionado quando presente em menor concentração. Os valores de absorbância também diferiram estatisticamente em relação ao tempo de incubação. A maior média de absorbância e, consequentemente o maior crescimento de L. mesenteroides, ocorreu no tempo de 26 horas. Verificou-se que o crescimento da bactéria ocorreu gradativamente ao longo do tempo, condição normal na curva de crescimento dos micro-organismos. A presença ou ausência do inóculo apresentou resultado estatisticamente significativo para a variável absorbância, sendo que a maior média foi obtida na presença do inóculo.

É bastante frequente a utilização do ácido sulfúrico, muitas vezes combinado com antibióticos, para combater a contaminação nas dornas de fermentação de indústrias sucroalcooleiras. Os baixos valores de pH (cerca de 2,0 a 3,0) podem diminuir a viabilidade celular da levedura. Quanto maior o tempo de exposição, que varia entre 0,5 a 2 horas, maior o impacto no metabolismo da levedura (LUDWIG, 1998LUDWIG, K.M. Floculação de Saccharomyces cerevisiae – caracterização e ação de enzimas desfloculantes. 1998. 134f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Aplicada) – Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, 1998.). STUPIELLO (1993)STUPIELLO, M. G. Avaliação de metodologia para estudo da ação de alguns antimicrobianos frente às bactérias gram (.) isoladas da fermentação alcoólica. 1993. 96f. Dissertação (Mestrado em Ciências e Tecnologia de Alimentos), Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 1993. em seu trabalho estudou os agentes antimicrobianos mais utilizados e seu modo de ação sobre bactérias Gram positivas. Como biocidas químicos, a autora encontrou fenol e compostos fenólicos, álcoois, halogênicos e halogenados, metais pesados e seus compostos, corantes, detergentes, composto de amônia quaternária, aldeídos e agentes gasosos. Os antibióticos mais utilizados nos processos fermentativos foram tetraciclina, cloranfenicol, penicilina e virginiamicina.

OLIVA-NETO; YOKOYA (2001)OLIVA-NETO, P.; YOKOYA, F. Susceptibility of Saccharomyces cerevisiae and lactic acid bacteria from the alcohol industry to several antimicrobial compounds. Brazilian Journal of Microbiology, v.32, p.10-14, 2001. avaliaram diversos compostos antimicrobianos sobre Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus fermentum e Leuconostoc mesenteroides, dentre eles sulfito, nitrito, sulfato de cobre, penicilina V ácida e clindamicina. Vários destes biocidas afetaram seriamente o crescimento de S. cerevisiae, nas dosagens similares àquelas que inibiram as bactérias. Os autores concluem que estes produtos deveriam ser evitados ou usados somente em condições especiais; e que para esta etapa o controle de contaminantes por antibióticos é mais efetivo. MENEGHIN et al. (2007)MENEGHIN, S.P.; REIS, F.C.; ALMEIDA, P.G.; CECCATO-ANTONINI, S.R. Avaliação do emprego de dióxido de cloro como antibacteriano na fermentação alcoólica. In: SIMPÓSIO NACIONAL DE BIOPROCESSOS, 16., 2007. Curitiba. Anais. Curitiba: 2007. 7p. 1 CD ROM. avaliaram o dióxido de cloro como biocida alternativo sobre o fermento: Bacillus subtilis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, comparando com a ação de Kamoran a 3ppm (indicado pelo fabricante). Obtiveram o mesmo efeito inibidor sobre as bactérias em concentrações que variaram de 50 a 200 ppm de dióxido de cloro. Os autores concluem que o dióxido de cloro deve ser usado com cautela, pois valores maiores que 50 ppm também inibiram a levedura.

Verificação do crescimento de L. mesenteroides em diferentes pHs e temperaturas, em meio CSN

Quantificação comparativa da viscosidade

Na Figura 4, verifica-se que houve maior diminuição da viscosidade nos pHs 3,0 e 6,0. As maiores diminuições ocorreram quando se utilizou 1,0% de Poliquilgerm® (8,52% em pH 3,0 e 7,07% em pH 6,0). Em pH 4,0 verificou-se diminuição de 2,69%. Para as culturas com 0,2% de Poliquilgerm®, verificou-se maior diminuição da viscosidade nos pHs 3,0 e 5,0 (5,98 e 3,20%, respectivamente). Houve um pequeno aumento na viscosidade das culturas com 0,2% do produto no pH 4,0 e com 1,0% do produto no pH 5,0 (0,38 e 0,15%, respectivamente).

Fig. 4
Quantificação comparativa da diminuição da viscosidade das culturas de Leuconostoc mesenteroidesacrescidas de Poliquilgerm®, em diferentes pHs a 33º C.

A Figura 4 indica ainda que L. mesenteroides tem sua atividade metabólica ativa nos pHs de 3,0 a 6,0, na temperatura de 33º C. Isso explica a maior formação de dextrana no processo de produção de etanol quando prevalecem essas condições de pH e temperatura.

No mesmo experimento, repetido em temperatura de 28º C, pode-se verificar na Figura 5 que os maiores valores de diminuição da viscosidade também ocorreram nas culturas em pHs 3,0 e 6,0. Em pH 6,0 foram registrados 16,84 e 16,71% de diminuição da viscosidade quando utilizados, respectivamente, 1,0 e 0,2% de Poliquilgerm®, sendo este o melhor resultado em ambos os experimentos. Em pH 3,0, houve 3,24% de diminuição quando utilizados 0,2% do produto, e 1,78% quando utilizados 1,0%. Em pHs 4,0 e 5,0, os valores encontrados foram baixos, e houve aumento na viscosidade quando utilizou-se 1,0 e 0,2% de Poliquilgerm® em pH 5,0 (0,54 e 4,20%, respectivamente).

Fig. 5
Quantificação comparativa da diminuição da viscosidade das culturas de Leuconostoc mesenteroidesacrescidas de Poliquilgerm®, em diferentes pHs a 28º C.

Os dados de diferentes pHs e concentrações de Poliquilgerm® foram analisados através da análise de variância. O teste de Tukey, realizado para os dados de ambos os experimentos, revelou que o parâmetro inóculo foi significativo, e a maior média de viscosidade foi encontrada na presença de inóculo (1,4083 cp a 33º C e 1,4102 cp a 28º C) (Tabela 1). Em relação ao parâmetro pH, os valores de viscosidade não diferiram em valores de pHs 3,0 e 4,0 a 33º C. Por outro lado, os pHs 5,0 e 6,0 diferiram entre si e entre os demais. A 28º C os valores de viscosidade não diferiram nos pHs 4,0 e 6,0, assim como nos pHs 5,0 e 6,0. No entanto, houve diferenças entre os valores de viscosidade nos pHs 4,0 e 5,0, e os valores para pH 3,0 diferiram de todos os demais (Tabela 2). Lembrando que esta análise foi realizada a partir dos valores em viscosidade (cp), razão pela qual apresentou resultados que diferem da observação realizada quando se calculou os valores de porcentagem de diminuição da viscosidade.

Tabela 1
Valores das médias de viscosidade utilizadas na análise estatística (Teste de Tukey), para o parâmetro inóculo.
Tabela 2
Valores das médias de viscosidade utilizadas na análise estatística (Teste de Tukey), para o parâmetro pH.

O parâmetro concentração de Poliquilgerm® apresentou diferenças significativas para os valores de viscosidade em ambos os experimentos. A 33º C a ausência do produto apresentou a maior média de viscosidade (1,3914 cp) diferindo das demais, que não apresentaram diferenças (1,3744 cp a 0,2% do produto e 1,3592 a 1,0% do produto). A 28º C a ausência e a presença de 1,0% de Poliquilgerm® não apresentaram diferenças estatísticas (1,3904 cp a 0,0% e 1,3838 cp a 1,0% do produto). A presença de 0,2% de Poliquilgerm® foi significativa para os valores de viscosidade, que foram os menores valores encontrados (1,3539 cp) (Tabela 3).

Tabela 3
Valores das médias de viscosidade utilizadas na análise estatística (Teste de Tukey), para o parâmetro Concentração.

Embora a análise estatística indique não significância entre a temperatura e viscosidade, as Figuras 4 e 5 deixam claro que diferentes pHs e temperaturas podem influenciar a viscosidade do meio.

Análise da biomassa

A Figura 6 revela que houve maior crescimento da cultura em pHs 6,0 e 5,0, alcançando 12,95 e 7,00 x 108 UFC/mL, respectivamente.

Houve 97,1 e 100% de diminuição do crescimento de L. mesenteroides quando utilizados 1,0% de Poliquilgerm® e 98,1 e 99,8% para 0,2% do produto, respectivamente, nos pHs 6,0 e 5,0. Estes resultados evidenciam forte inibição do crescimento de L. mesenteroides pelo Poliquilgerm®. Em valores de pH 4,0 e 3,0, o crescimento da bactéria foi menor (0,47 e 0,30 x 108 UFC/mL). O pequeno aumento evidenciado na biomassa da cultura quando se adicionou 1,0% do produto (0,78 e 0,73 x 108 UFC/mL) pode indicar que o Poliquilgerm® teria ação menos efetiva em meio ácido, na temperatura de 33º C.

Os resultados para o crescimento da cultura em 28º C (Fig. 7) mostram, à semelhança da Figura 6, que houve maior crescimento em pHs 6,0 e 5,0, alcançando 6,73 e 6,86 x 108 UFC/mL, respectivamente.

Fig. 6
Quantificação comparativa da biomassa de Leuconostoc mesenteroides nas concentrações 0,0; 0,2 e 1,0% de Poliquilgerm®, em diferentes pHs a 28º C.
Fig. 7
Quantificação comparativa da biomassa de Leuconostoc mesenteroides nas concentrações 0,0; 0,2 e 1,0% de Poliquilgerm®, em diferentes pHs a 28º C.

No pH 6,0 houve 100% de diminuição do crescimento de L. mesenteroides em ambas as concentrações de Poliquilgerm®. Em pH 5,0, houve diminuição de 13,3 e 20,3% quando utilizados 1,0 e 0,2% do produto. Nos valores de pHs 3,0 e 4,0, o crescimento foi menor (0,73 e 0,65 x 108 UFC/mL). Houve aumento na biomassa da cultura quando se adicionou 1,0% do produto em pH 3,0 (2,47 x 108 UFC/mL) e quando acrescentou-se 0,2% do produto em pH 4,0 (0,54 x 108 UFC/mL). Entretanto, são valores menores de crescimento, uma vez que a cultura encontra-se em condições desfavoráveis de pH.

O teste de Tukey realizado para o experimento a 33º C mostrou que apenas os pHs 3,0 e 4,0 não diferiram significativamente em relação à biomassa produzida. A 28ºC todos os pHs diferiram entre si, sendo que o maior valor de biomassa foi encontrado em pH 5,0 (6,09 x 108 UFC/mL). Para o parâmetro concentração de Poliquilgerm®, o teste de Tukey mostrou que a ausência do produto foi significativa para o experimento a 33º C, no entanto não houve diferenças entre as concentrações do produto utilizadas (1,0 e 0,2% de Poliquilgerm®). A 28º C, os resultados foram significativos paras todas as concentrações nos diferentes pHs, sendo que a maior média dos valores de biomassa foram encontradas na ausência do produto (3,74 x 108 UFC/mL), seguida de 1,0 e 0,2% de Poliquilgerm®, respectivamente (2,15 e 1,72 x 108 UFC/mL).

Comparando-se os resultados de crescimento de L. mesenteroides nas temperaturas de 33 e 28º C, podese inferir que a bactéria tem preferência a temperaturas mais elevadas e que o pH é limitante. O crescimento da bactéria manifestado no pH 3,0 em ambas as temperaturas mostra que a ação do Poliquilgerm® neste pH tem menor eficiência.

Os melhores resultados deste experimento, em temperaturas de 33 e 28º C, foram obtidos quando a cultura de L. mesenteroides cresceu em pH 6,0. Neste pH houve maior produção de biomassa e os melhores valores para diminuição da viscosidade quando aplicado Poliquilgerm® (28º C). Nestes experimentos em pHs mais baixos a bactéria tem menor tolerância e produz menos biomassa. No entanto, em temperatura de 33º C, verificou-se os melhores resultados de diminuição da viscosidade em pH 3,0 (Fig. 4), mesmo a bactéria produzindo pouquíssima biomassa (Fig. 6). Uma hipótese é a de que o micro-organismo em condições desfavoráveis de pH seja estimulado para sua defesa em aumentar a produção de dextrana e, consequentemente, a viscosidade do meio de cultura.

BREGAGNOLI (2006)BREGAGNOLI, F.C.R. Comportamento fisiológico de microrganismos submetidos a biocidas convencional e natural na produção de cachaça. 2006. 69f. Tese (Doutorado em Microbiologia Agropecuária) – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2006. verificou que a própolis apresentou o mesmo efeito que a ampicilina quando aplicada com finalidade de combater a contaminação por microrganismos na produção de cachaça. Desse modo, a aplicação de biocidas naturais para combater contaminações em indústrias de fermentação mostra-se potencialmente viável, já que podem ser uma alternativa em substituição aos biocidas já utilizados, economicamente mais onerosos.

BERTOLETTI (2008)BERTOLETTI, A.C.D. Ação biocida do Poliquilgerm® derivado do óleo de Ricinus communis L. (mamona. sobre bactérias contaminantes da fermentação etanólica. 2008. 74f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Aplicada) – Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, 2008. verificou que o produto Poliquilgerm® apresenta ação biocida sobre S. cerevisiae apenas quando utilizado na concentração de 200 ppm, sendo que até a concentração de 1 ppm a viabilidade da levedura não é afetada a níveis significativos nas primeiras 24 horas. Em L. fermentum o produto mostrou ação bactericida na concentração de 50 ppm. Com 24 horas de tempo de contato nesta concentração a inviabilização do crescimento celular foi total. A autora conclui que o Poliquilgerm® pode ser efetivo no controle de L. fermentum e de bactérias contaminantes da fermentação etanólica, uma vez que a diminuição na produção de ácido lático atingiu cerca de 50% na concentração de 0,5 ppm do biocida e 90% em 20 ppm. Além disso, verificou que o rendimento alcoólico não é prejudicado com a adição do produto.

CONCLUSÕES

O acréscimo de 0,2; 1,0 e 2,0% de Poliquilgerm® provocou diminuição da viscosidade das culturas de L. mesenteroides após 24 horas, tanto em meio Mayeux e Colmer como em meio CSN. Verificou-se inibição do crescimento da bactéria quando se utilizou a menor concentração do produto (0,2%) após as primeiras 6 horas, e após 20 horas em contato com 1,0 e 0,2% de Poliquilgerm®. Em meio de cultivo com pH 3,0 e 4,0, L. mesenteroides sofre menor inibição do crescimento em 28 e 33º C, evidenciando ação menos efetiva do produto sobre a bactéria em valores de pH baixos.

Estes resultados mostram que o produto Poliquilgerm® pode vir a ser uma alternativa no controle de contaminações por L. mesenteroides em indústrias sucroalcooleiras, já que se mostrou eficaz no controle do crescimento da bactéria nas primeiras 6 horas. A diminuição da viscosidade também assume importância na medida em que os experimentos evidenciaram ação do produto em valores de pH 3,0, condição frequente no processo de fermentação do etanol.

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela bolsa concedida e ao Grupo de Química Analítica e Tecnologia de Polímeros(GQATP) do Instituto de Química da USP de São Carlos que, coordenado pelo Prof. Dr. Gilberto OrivaldoChierice, gentilmente cedeu o produto para a realização deste trabalho.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    16 Nov 2020
  • Data do Fascículo
    Apr-Jun 2010

Histórico

  • Recebido
    05 Fev 2009
  • Aceito
    14 Abr 2010
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