DINÂMICA HEMOCITÁRIA EM DIATRAEA SACCHARALIS F. (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE) DESAFIADA IMUNOLOGICAMENTE PELOS FUNGOS BEAUVERIA BASSIANA (BALS.) VUILL. E METARHIZIUM ANISOPLIAE (METSCH.) SOROK.

HEMOCYTIC DYNAMICS IN DIATRAEA SACCHARALIS F. (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE) IMMUNOLOGICALLY CHALLENGED BY BEAUVERIA BASSIANA (BALS.) VUILL. AND METARHIZIUM ANISOPLIAE (METSCH.) SOROK. FUNGI.

RESUMO

A pesquisa objetivou analisar, morfológica e quantitativamente, os tipos de hemócitos em lagartas do terceiro ínstar de Diatraea saccharalis F., desafiadas imunologicamente por Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. e Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., nas concentrações 10³, 10⁵ e 10⁷ conídios mL^-1, em comparação a lagartas não tratadas. Foram coletados 10 µL de hemolinfa de cinco lagartas por tratamento, nos intervalos de 24, 36, 48, e 60 horas pós-inoculação, sendo contadas 300 células em campos aleatórios da lâmina, utilizando-se a objetiva de imersão (100X). Os hemócitos mais freqüentes foram os esferulócitos (34,8%), plasmatócitos (29,7%) e granulócitos (22,2%), enquanto os menos freqüentes foram os prohemócitos (8,3%), adipohemócitos (2,6%) e oenocitóides (2,4%). B. bassiana promoveu interferência efetiva na população de granulócitos na concentração de 10⁷ conídios mL^-1 (24 e 36h) e plasmatócitos nas concentrações 10³ conídios mL^-1 (60h) e 10⁷ conídios mL^-1 (24 e 36h), onde ocorreu aumento do número de granulócitos e redução do número de plasmatócitos na maior concentração e, ainda, o aumento do número de plasmatócitos na concentração 10³ conídios mL^-1. M. anisopliae não interferiu quantitativamente nos granulócitos e plasmatócitos. No que se refere aos esferulócitos, verificou-se maior tendência de redução do número dessas células no intervalo de 36h para ambos os fungos, porém, diferença significativa só ocorreu na concentração de 10⁵ conídios mL^-1 no intervalo de 60h, apresentando a menor média. Conclui-se que B. bassiana tem ação mais efetiva sobre a dinâmica populacional dos granulócitos e plasmatócitos em lagartas de D. saccharalis em relação ao M. anisopliae.

PALAVRAS-CHAVE
Hemócitos; fungos entomopatogênicos; morfologia; broca da cana-de-açúcar

ABSTRACT

This study was aimed to morphologically and quantitatively analyze the types of hemocytes in Diatraea saccharalis F. thirdinstar caterpillar immunologicaly challenged by Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. and Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. in concentrations of 10³, 10⁵ and 10⁷ conidia mL^-1, compared to nontreated specimens. A 10µL-sample of hemolymphs from five caterpillars for each treatment, in the intervals of 24, 36, 48 and 60h; 300 cells were counted in random fields of the lamina, using the immersion objective (100X). The most frequent hemocytes were the spherulocytes (34.8%), plasmatocytes (29.7%) and granulocytes (22.2%), while the least frequent were the prohemocytes (8.3%), the adipohemocytes (2.6%) and the oenocytoids (2.4%). B. bassiana promoted effective interference in the population of granulocytes at the concentration of 10⁷ conidia mL^-1 (24 and 36h) and of plasmatocytes at the concentrations of 10³ conidia mL^-1 (60h) and 10⁷ conidia mL^-1 (24 and 36h); there occurred an increase of the number of the granulocytes and a decrease of the number of plasmotocytes at the highest concentration, and an increase in the number of plasmatocytes at the concentration of 10³ conidia mL^-1. M. anisopliae do not interfere quantitatively in the granulocytes and plasmatocytes. Regarding the spherulocytes, there was observed a higher tendency of reduction in the number of these cells in the interval of 24 and 36h for both fungi, but a meaningful difference only occurred at the concentration of 10⁵ conidia mL^-1 in the 60h interval, presenting the smallest average. It was possible to conclude that B. bassiana has a more effective action over the populational dynamics of the granulocytes and plasmatocytes of D. saccharalis caterpillars in association with M. anisopliae.

KEY WORDS
Hemocytes; entomopathogenic fungi; morphology; sugarcane borer

INTRODUÇÃO

Os fungos entomopatogênicos são bastante conhecidos mundialmente por seu alto potencial no controle de diversas Ordens de insetos. De acordo com ALVES; PEREIRA (1998), esses fungos causam distúrbios fisiológicos que atingem o tegumento e os sistemas, circulatório, reprodutor, respiratório, nervoso e digestivo dos insetos atacados.

Dentre os fungos entomopatogênicos, Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. e Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. são utilizados como potentes agentes no controle biológico de insetos (HEGEDUS; KHACHATOURIANS 1996).

Nos insetos, os principais mecanismos de defesa são desempenhados pelos hemócitos, células livres circulantes na hemolinfa, cujo número e tipos diferem não só com a espécie estudada como também com a idade e desenvolvimento do indivíduo. Essas células fornecem uma resposta ágil e eficiente contra os patógenos que atingem a hemocele, participando ativamente dos mecanismos de defesa tais como: reconhecimento, fagocitose, encapsulação, coagulação, formação dos nódulos e citotoxicidade (GUPTA 1985).

Os hemócitos reconhecem uma variedade de corpos estranhos, pela interação direta de receptores de superfície celular com moléculas do organismo invasor, ou indiretamente pelo reconhecimento de receptores da resposta humoral que opsonizam a superfície do invasor (LAVINE; STRAND 2002). O sucesso das respostas de defesa depende do número e dos tipos de hemócitos envolvidos nestes mecanismos (RUSSO et al., 2001).

Nos últimos anos, tem havido um enorme progresso no conhecimento das defesas imunológicas dos insetos (HOCH et al., 2004; LEE et al., 2005). A biodiversidade desses organismos tem proporcionado modelos importantes para estudar as suas estratégicas antimicrobianas, as quais podem fornecer informações relevantes para o desenvolvimento de metodologias de controle biológico por patógeno. Neste sentido, sabe-se que as proteases extracelulares produzidas por M. anisopliae e B. bassiana parecem participar na supressão da resposta imunológica celular na hemolinfa de larvas de Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Noctuidae) (GRIESCH; VILCINSKAS 1998).

Alterações na morfologia, função e quantidade de hemócitos em insetos, ocasionadas por fungos entomopatogênicos, têm sido relatadas por vários pesquisadores. BALAVENKATASUBBAIAH; NATARAJU (2005) verificaram susceptibilidade deBombyx moriL. (Lepidoptera: Bombycidae) a B. bassiana por este provocar uma interferência no número de alguns hemócitos com o progresso da infecção. O processo de adesão dos hemócitos foi afetado em Manduca sexta L. (Lepidoptera: Sphingidae) após inoculação com B. bassiana (DEANA et al., 2004). Modificações na morfologia e ausência da atividade fagocitária dos plasmatócitos em G. mellonella quando inoculadas com M. anisopliae foram descritas por VILCINSKAS et al., (1997a; b).

Assim, o objetivo do presente trabalho foi analisar, morfológica e quantitativamente, os tipos de hemócitos em lagartas do terceiro ínstar de Diatraea saccharalis F. (Lepidoptera: Crambidae), submetidas aos fungos entomopatogênicos M. anisopliae e B. bassiana.

MATERIAL E MÉTODOS

Obtenção dos insetos: As lagartas de D. saccharalis foram obtidas da criação existente em laboratório.

Obtenção dos isolados de B. bassiana e M. anisopliae: Os isolados utilizados foram B. bassiana (447) obtido de Selenopsis invicta (Buren) e M. anisopliae (E9) obtido de Deois flavopicta (Stal.), provenientes da micoteca da Esalq, e mantidos no Laboratório de Patologia de Insetos a uma temperatura de 6 ± 2º C em tubos de vidro com meio de cultura Batata-Dextrose-Ágar, acrescido do antibiótico sulfato de estreptomicina (BDA+A) e óleo Nujol.

As suspensões dos fungos foram preparadas a partir de placas de Petri contendo meio de cultura (BDA + A) com os conídios, adicionando-se 20mL de água destilada esterilizada para B. bassiana e 15 mL para M. anisopliae acrescido de espalhante adesivo Tween 80 a 0,01% (ADE+E), sendo filtradas em gaze esterilizada e as concentrações para ambos os isolados foram aferidas em 10³, 10⁵, e 10⁷ conídios mL^-1, mediante o uso da câmara de Neubauer, conforme metodologia desenvolvida por ALVES et al. (1998). A viabilidade de conídios foi avaliada por meio de plaqueamento em BDA+A, após 24h, em estufa incubadora BOD a 26 ± 1º C e 12h de fotofase, fazendo-se a contagem de conídios germinados e não germinados em microscópio de luz.

Tratamento tópico de D. saccharalis: As lagartas de terceiro ínstar de D. saccharalis foram pulverizadas com os fungos M. anisopliae e B. bassiana nas concentrações de 10³, 10⁵, e 10⁷ conídios mL^-1, respectivamente. A testemunha foi pulverizada com água destilada esterilizada mais espalhante adesivo Tween 80, totalizando sete tratamentos.

Foram utilizadas 140 lagartas sendo 20 para cada tratamento, divididas em grupos de cinco indivíduos, a fim de permitir a coleta da hemolinfa, em diferentes intervalos de tempo (24, 36, 48 e 60 horas), sendo cada lagarta considerada uma repetição. Estas foram acondicionadas em bandeja de plástico com compartimentos, contendo colmo de milho como substrato alimentar. A inoculação foi realizada através de pulverização com o auxílio de um microatomizador de marca Paasche “VL”, sendo utilizado 1 mL da suspensão por tratamento. Em seguida, os insetos foram mantidos em condição de laboratório a uma temperatura de 27 ± 2º C, 70 ± 5% de UR e 12 horas de fotofase.

Coleta da hemolinfa para análise morfológica e contagem diferencial dos hemócitos: Amostras de 10 µL de hemolinfa foram coletadas de cinco lagartas por tratamento, nos intervalos de 24, 36, 48, e 60 horas. Para isso realizou-se uma incisão na região mesopleural da lagarta e, com o auxílio de uma micropipeta, colheu-se a hemolinfa.

O material foi colocado sobre uma lâmina contendo 10 µL de solução salina (62 mM NaCl + 100 mM glicose + 10 mM EDTA + 30 mM citrato de sódio + 26 mM ácido cítrico + pH 4,6) para evitar a coagulação. Em seguida, procedeu-se o esfregaço, que foram mantidos por aproximadamente 20 minutos à temperatura ambiente para permitir uma melhor adesão dos hemócitos à lâmina. O esfregaço foi fixado em metanol, por cinco minutos, sendo em seguida submetido à coloração pelo Giemsa, também por cinco minutos. A análise morfológica foi realizada utilizando microscópio de luz, da marca Olympus BX-49, e fotografados em fotomicroscópio OLYMPUS BX-51. Para contagem diferencial dos hemócitos empregou-se metodologia descrita por FALLEIROS et al. (2003), sendo contadas 300 células em campos aleatórios da lâmina, utilizando-se a objetiva de imersão (100X).

Análise estatística: A partir da contagem de 300 células por amostra, foi obtida a proporção de hemócitos (contagem diferencial) para cada tratamento e intervalo após tratamento. Assim, as porcentagens de cada tipo de hemócito foram submetidas à análise de variância (ANOVA) em esquema fatorial considerando 7 tratamentos e 4 intervalos de avaliação após tratamento como fatores principais. Havendo significância entre fatores principais, bem como de suas interações, ANOVA simples foi conduzida comparando as porcentagens entre tratamentos para cada intervalo de avaliação ou para cada tratamento em função dos respectivos intervalos de avaliação. Em seguida, quando foi caracterizada significância dos fatores pela ANOVA, as médias de tratamentos ou de intervalo de avaliação foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Todas as análises foram conduzidas empregando o programa estatístico SAS (SAS INSTITUTE, 2001).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As células mais freqüentes foram os esferulócitos, plasmatócitos e granulócitos, com percentuais de 34,8%, 29,7% e 22,2%, respectivamente, enquanto que os hemócitos menos freqüentes foram os prohemócitos (8,3%), adipohemócitos (2,6%) e oenocitóides (2,4%) (Fig. 1). Tal observação corrobora com os dados descritos por RATCLIFFE (1993) e STRAND; PECH (1995), os quais relataram que nos estágios larvais em lepidópteros normalmente as células granulares e os plasmatócitos compreendem mais de 50% dos hemócitos circulantes, tendo a capacidade de adesão na superfície de corpos estranhos. Os outros hemócitos descritos em lepidópteros são células não adesivas, correspondendo aos esferulócitos, oenocitóides e prohemócitos.

Fig. 1
Tipos de hemócitos observados na hemolinfa de lagartas do terceiro ínstar de D. saccharalis: Prohemócito (PR), Plasmatócito (PL), Granulócito (GR), Adipohemócito (AD), Oenocitóide (OE) e Esferulócito (SP). Barras = 10 µm.

Da mesma forma, FALLEIROS et al. (2003), trabalhando com microscopia de transmissão e varredura, também observaram maior freqüência de plasmatócitos, granulócitos e esferulócitos na hemolinfa de larvas de D. saccharalis. Segundo SASS et al. (1994), os esferulócitos estão envolvidos no transporte de componentes cuticular, o que pode explicar o seu maior percentual entre os hemócitos, pois as lagartas encontravam-se próximas à ecdise. Já os oenocitóides contêm precursores da fenoloxidase que provavelmente desempenha uma função na melanização (JIANG et al., 1997). Os prohemócitos são relatados como células-tronco que se diferenciam em um ou mais tipos de hemócitos.

Após inoculação com o fungo B. bassiana, diferenças significativas só ocorreram para os granulócitos na concentração de 10⁷ conídios mL^-1 (24 e 36h) e para os plasmatócitos nas concentrações 10³ conídios mL ^-1 (60h) e 10⁷ conídios mL^-1 (24 e 36h), onde houve um aumento do número de granulócitos e redução do número de plasmatócitos na maior concentração, e aumento do número de plasmatócitos na concentração 10³ conídios mL^-1 (Tabela 1).

O fungo M. anisopliae não interferiu significativamente nos granulócitos e plasmatócitos. No que se refere aos esferulócitos, verificou-se uma tendência de redução do número dessas células no intervalo de 24 e 36h para ambos os fungos, porém, diferença significativa só ocorreu na concentração de 10⁵ conídios mL ^-1 no intervalo de 60h, resultando na menor média para esse tipo de hemócito quando desafiados pelo M. anisopliae. Não foram observadas alterações morfológicas nessas células após inoculação com os fungos entomopatogênicos em relação à testemunha.

De acordo com HAN et al. (1998), os hemócitos podem ser capazes de responder rapidamente às mudanças ambientais, devido às várias funções fisiológicas desempenhadas por essas células na hemolinfa, onde o número e proporção de cada tipo de hemócito liberado de órgãos hematopoéticos podem mudar rapidamente em respostas as várias reações imunes contra patógenos.

Os dados desta pesquisa mostraram uma pequena flutuação populacional dos hemócitos em respostas as diferentes concentrações dos fungos B. bassiana e M. anisopliae nos intervalos de 24, 36, 48 e 60h.

Apenas o fungo B. bassiana. na concentração 10⁷ conídios mL^-1 nos intervalos de 24 e 36h, demonstrou uma interferência mais efetiva na população dos granulócitos e plasmatócitos de D. saccharalis. Esses resultados estão de acordo com os obtidos por HUNG; BOUCIAS (1996), os quais relataram um aumento do número de granulócitos em Spodoptera exigua (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) e no gafanhoto Melanoplus sanguinipes F. (Orthoptera: Acrididae) inoculados com B. bassiana, enquanto que LEE et al. (2005) observaram uma diminuição do número de plasmatócitos em Mamestra brassicae L. (Lepidoptera: Noctuidae), quando inoculadas com Nomuraea rileyi (Farlow) Samson e B. bassiana.

Segundo FUGUET; VEY (2004), a redução dos plasmatócitos pode estar relacionada ao envolvimento dessas células no processo inicial de nodulação, enquanto que os granulócitos só participam dos estágios finais desse processo, o que justificaria o seu aumento. Esses mesmos autores sugerem ainda que o declínio do número de plasmatócitos em infecções com fungos pode estar relacionado à sua suscetibilidade aos metabólicos secundários tóxicos produzidos por estes.

Tabela 1
Médias (± EP) dos números de granulócitos (GR), plasmatócitos (PL) e esferulócitos (SP) da hemolinfa de lagartas do terceiro instar de D. saccharalis, desafiadas imunologicamente pelos fungos B. bassiana (B.b.) e M. anisopliae (M.a.).

Tratamento	Tempo após tratamento (horas)				Estatística1
	24	36	48	60	F3, 17P
Granulócitos
Testemunha	15,0 ± 2,52 b2	19,7 ± 4.05 b	24,3 ± 9,95	30,7 ± 2,73 ab	-3
B.b. 103	28,3 ± 3,33 ab	34,7 ± 2,33 b	37,7 ± 6,36	32,7 ± 3,76 ab	-3
B.b. 105	29,3 ± 2,90 ab	34,3 ± 4,98 b	34,3 ± 8,35	39,0 ± 4,58 a	-3
B.b. 107	44,3 ± 8,68 aAB	61,7 ± 9,17 aA	27,3 ± 1,45 B	31,3 ± 4,10 abB	5,370,0256
M.a. 103	23,7 ± 2,96 bAB	33,0 ± 2,00 bA	30,7 ± 0,33 B	20,7 ± 2,73 bB	4,930,0316
M.a. 105	31,7 ± 0,88 ab	42,3 ± 5,81 ab	29,7 ± 4,63	43,7 ± 1,85 a	-3
M.a. 107	26,0 ± 0,58 abB	34,3 ± 1,85 bAB	35,7 ± 2,90 A	39,7 ± 1,45 aA	9,210,0057
F6, 14;P	4,960,0064	6,600,0018	-3	5,620,0037
Plasmatócitos
Testemunha	36,0 ± 3,46 a	33,7 ± 3,2 a	27,7 ± 5,36	21,7 ± 4,25 b	-3
B.b. 103	32,7 ± 6,12 a	29,0 ± 4,58 ab	33,0 ± 3,51	38,3 ± 3,18 a	-3
B.b. 105	35,3 ± 3,48 a	26,0 ± 0,58 ab	30,7 ± 2,60	26,0 ± 1,53 ab	-3
B.b. 107	13,3 ± 3,18 bB	13,7 ± 3,84 bB	31,7 ± 4,41 A	27,0 ± 4,58 abAB	4,920,0318
M.a. 103	36,3 ± 0,33 a	28,0 ± 6,24 ab	28,7 ± 4,48	31,7 ± 1,45 ab	-3
M.a. 105	38,7 ± 1,45 a A	27,7 ± 1,67 abB	40,3 ± 3,38 A	35,0 ± 3,21 abAB	5,230,0273
M.a. 107	27,0 ± 1,15 aB	33,0 ± 1,00 aAB	32,7 ± 1,76 AB	35,3 ± 1,67 ab A	6,400,0161
F6, 14;P	8,230,0006	3,840,0179	-3	3,800,0185
Esferulócitos
Testemunha	40,0 ± 2,08	34,7 ± 8,76	30,0 ± 6,80	34,3 ± 6,43 a	-3
B.b. 103	31,0 ± 4,58	24,7 ± 5,60	24,3 ± 2,18	23,0 ± 1,53 ab	-3
B.b. 105	27,3 ± 6,56	29,0 ± 3,00	27,7 ± 6,89	27,0 ± 5,13 ab	-3
B.b. 107	23,3 ± 10,90	14,7 ± 4,05	30,3 ± 4,84	24,7 ± 5,90 ab	-3
M.a. 103	33,0 ± 3,51	24,7 ± 4,33	30,3 ± 7,36	33,0 ± 1,53 a	-3
M.a. 105	23,7 ± 2,33	12,3 ± 5,49	20,0 ± 1,53	10,7 ± 3,18 b	-3
M.a. 107	33,3 ± 2,03	27,7 ± 1,20	29,7 ± 4,63	21,0 ± 2,52 ab	-3
F6, 14;P	-3	-3	-3	4,220,0124	-

• ¹
  Resultado da análise de variância (F do teste de Fisher) e respectivas significâncias (valor de P sobrescrito), para aqueles resultados significativos (P < 0,05).
• ²
  Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (P > 0,05).
• ³
  Resultados não significativos pela ANOVA, portanto, não possuem letras minúsculas ou maiúsculas de diferenciação nas linha e colunas, respectivamente.

A menor interferência do fungo M. anisopliae na população dos granulócitos e plasmatócitos pode estar relacionada ao isolado e/ou concentração, pois, segundo SEWIFY; HASHEM (2001), quando G. mellonella foi inoculada com M. anisopliae, na concentração de 10⁷ conídios mL^-1, ocorreu um aumento significativo do número de granulócitos. No entanto, GILLESPIE et al. (2000) observaram no gafanhoto Schistocerca gregaria (Forskal) (Orthoptera: Acrididae), uma redução significativa do número de granulócitos e plasmatócitos quando inoculados com M. anisopliae var. acridum, na concentração 7,5 ´ 10⁴ conídios mL^-1.

CONCLUSÃO

A infecção de larvas de D. saccharalis com B. bassiana e M. anisopliae alterou a dinâmica populacional dos granulócitos e plasmócitos. No entanto, B. bassiana mostrou ação mais efetiva sobre esta dinâmica do que M. anisopliae. Não foi observado efeito significativo das concentrações de conídios na resposta hematocitária, sendo que apenas a maior concentração promoveu uma pequena alteração nesta resposta.

AGRADECIMENTOS

Aos pesquisadores Drs. Fábio André Brayner dos Santos e Luiz Carlos Alves, Pesquisadores do CPqAM— FIOCRUZ/UFPE- Recife, PE, pela contribuição científica para realização deste trabalho e ao Prof. Dr. Jorge Braz Torres, do Curso de Pós-Graduação em Entomologia Agrícola da UFRPE, pelas análises estatísticas.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Jul 2021
• Data do Fascículo
  Apr-Jun 2008

Histórico

• Recebido
  07 Mar 2007
• Aceito
  19 Maio 2008