CARACTERIZAÇÃO E EFICIÊNCIA DE ISOLADOS DE BEAUVERIA BASSIANA (BALS.) VUILL. NO CONTROLE DE COSMOPOLITES SORDIDUSRESUMO
Foram avaliados cinco isolados de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. provenientes de diversos centros de pesquisa do Brasil, no controle de Cosmopolites sordidus Germar, 1824. Conídios de cada linhagem foram aplicados em adultos sadios de C. sordidus, em condições de laboratório e campo, observando-se as respectivas taxas de mortalidade. Em seguida, os isolados foram caracterizados por eletroforese em gel de poliacrilamida, com sódio dodecil sulfato (PAGE/SDS). Apesar da caracterização mostrar que os isolados apresentaram algumas diferenças, não houve diferença quanto a virulência para C. sordidus.
PALAVRAS-CHAVE:
Cosmopolites sordidus; Beauveria bassiana, fungo entomopatogênico; isolados; controle biológico; PAGE/SDS.
ABSTRACT
An evaluation was made of five isolates of Beauveria bassiana (Bals.) Vuil that are used in the microbial contrai of Cosmopolites sordidus Germar, 1824, coming from several research centers of the Brazil. Conidia of each strain were applied in healthy adults of C. sordidus under laboratory and field conditions, observing the respective mortality rates of the insects. The isolates were characterized with sodium dodecil sulphate poliacrylamide gel-eletrophoresis (PAGE/SDS). In spite that the characterization had shown that the isolates presented some differences, there was no difference conceming the virulence for C. sordidus.
KEY WORDS:
Cosmopolites sordidus; Beauveria bassiana, entomopathogenic fungi; strains; biological contrai; PAGESDS.
INTRODUÇÃO
A broca da bananeira, Cosmopolites sordidus Germar, 1824, é um inseto que causa prejuízos consideráveis pelo ataque das larvas ao rizoma da bananeira. Arleu & Silveira Neto (1984) mencionam ser esta a principal praga da cultura, principalmente para as cultivares 'Maçã' e 'Terra', porém, sabese que a sua população pode ser bastante reduzida com práticas culturais como desbrota e limpeza do bananal.
No manejo integrado desta coleobroca tem sido dada grande atenção ao uso de agentes microbianos. Batista Filho et al. (1987) estudaram a patogenicidade dos fungos Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. em C. sordidus, verificando que os dois fungos causaram mortalidade acima de 85% quando cultivados em arroz ou em macerado de feijão estéril.
Busoli et. ai. (1989) avaliaram diversos isolados de B. bassiana e M. anisopliae provenientes de diferentes insetos hospedeiros, relacionando a dosagem e o tempo de mortalidade de C. sordidus, em condições de laboratório, e observaram uma relação direta entre a concentração de conídios e a mortalidade do hospedeiro.
Batista Filho et al. (1995) verificaram um aumento da atividade de B. bassiana (isolado CB-66), no controle de C. sordidus, quando utilizado em mistura com óleo mineral a 3%, com mortalidade de até 98% de adultos, em condições de laboratório. Mortalidades de 70 e 30% foram observadas respectivamente para os tratamentos com B. bassiana e óleo mineral, aplicados isoladamente.
Os padrões eletroforéticos de frações protéicas de fungos representam uma manifestação direta da sua constituição genética e podem ser muito valiosos quando utilizados para a caracterização taxonómica destes organismos (Gorinstein et al., 1996), principalmente quando estas diferenças se referem a grupos sub-específicos oriundos de hospedeiros ou localizações geográficas (Bridge, et al., 1990). Isolados de B. bassiana provenientes de diversas localidades do Brasil e Argentina foram caracterizados através de eletroforese e análise de isoenzimas e mostraram -se com alta variabilidade quanto à germinação e produção de conídios em meio de cultura artificial. O estudo permitiu a seleção de isolados deste fungo com potenciai de controle biológico para Diatraea saccharalis na Argentina (Lecuona et al., 1996). Soza-Gómez ( 1990) caracterizou isolados de Beauveria sp. através da temperatura, umidade e fotoperíodo de crescimento, avaliando as dimensões de conídios, atividade enzímica, atividade enzimática lipolítica, amilolíticas, proteolítica dos isolados e ainda o diâmetro do halo de crescimento. O autor observou diferentes padrões dos sistemas de a-esterases de isolados provenientes de diferentes localidades.
Este trabalho teve por objetivo comparar a eficiência de diferentes isolados de B. bassiana (Deuteromycetes: Hyphomycetes) no controle microbiano de C. sordidus e caracterizar estes isolados através de eletroforese em gel de poliacrilamida/ SOS (PAGE/SDS).
MATERIAL E MÉTODOS
Bioensaios de laboratório
Foram utilizados insetos adultos de C. sordidus provenientes da região do Vale do Ribeira, município de Miracatu, SP, e que foram mantidos em laboratório para observação do estado de sanidade dos exemplares capturados.
Os isolados dos fungos, provenientes de diferentes instituições (Tabela 1), foram produzidos pelo método Biomax (Alves, 1986), sendo a concentração padronizada através da contagem dos conídios em câmara de Neubauer.
O experimento foi constituído por seis tratamentos, representados por cinco isolados de B. bassiana (Tabela 1) e uma testemunha (água destilada) e quatro repetições, com 10 insetos por parcela. Os insetos foram distribuídos em placas de Petri com papel de filtro umedecido. A concentração do fungo utilizada nos tratamentos foi de 2 x 108 conídios/mL. Cada lote de 10 insetos foi pulverizado com 2 mL de suspensão fúngica, sendo que a testemunha foi pulverizada somente com água. O delineamento experimental adotado foi inteiramente casualizado.
O ensaio foi conduzido a 25± l "C, umidade relativa de 70% e fotoperíodo de 12 horas. Nas avaliações registrou-se o número de insetos mortos que apresentaram crescimento micelial sobre o exoesqueleto.
Os dados obtidos foram transformados em are sen Sl(X/100) e submetidos à análise de Tukey a 5%.
Isolados de Beauveria bassiana avaliados quanto à virulência, e submetidos a eletroforese em gel de policriamida NDS.
Ensaios de campo
O experimento foi realizado em plantas de banana da cultivar "Nanicão" (Musa acuminata, grupo AAA, subgrupo Cavendish), localizadas no município de Miracatu, SP, num talhão de 3.000 m2 , que foi subdividido em três áreas de 1.000 m2• Em cada uma destas áreas foi realizada uma avaliação prévia da população de insetos através de iscas tipo "queijo" (Suplicy Filho & Sampaio, 1982). Em duas destas áreas, foram distribuídas 20 iscas tratadas com B. bassiana dos isolados CB 98 e ESALQ 604, na concentração de 1,9 x I 0 8 conídios/g. A terceira área serviu como testemunha. O patógeno, produzido na forma de pasta (Leite et al., 1992) foi aplicado na superfície das iscas seguindo a metodologia descrita por Batista Filho et al. (1991).
O experimento foi avaliado 24 dias, após o tratamento, através do registro do número de insetos mortos com a presença da doença.
Eletroforese
Os isolados de B. bassiana foram inoculados em meio de cultura líqüido, GYM (extrato de levedura 1 % e glicose 1 %), e incubados em câmara com agitação (200 rpm) a 25 ºC por 7 dias. Em seguida foram filtrados e macerados em tampão Tris-HCI (Tris 0,619M; pH = 6,8), sendo utilizado 0,5 mL da solução para cada 275 mg de micélio. Para a extração de proteína intramicelial, o macerado foi centrifugado a 12000 x g, por 40 min, a 4 ºC. Utilizou-se o sobrenadante, descartando-se o precipitado. As amostras protéicas foram dosadas pela técnica de Hartree ( 1972) em espectrofotômetro modelo B29511 (Micronal), sob transmitância de 500 nm. Através da diluição em tampão de amostra (Tris 0,063M; azul de bromofenol 0,002%; sacarose 0,292M; SOS 0,069M), obteve-se a concentração protéica final de 3,0 µg/ mL de proteína, seguido de aquecimento em banhomaria com água fervente por 5 minutos. Um volume de 30 µL das amostras da extração protéica de cada isolado foi submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida SOS, na concentração I 0% pelo sistema descontínuo e denaturante (Laemmli, 1970), com diferença de potencial de 140V em tampão tris-gl icina (Tris 0,25M; glicina 1,918M; SDS 0,035M; pH = 8,3). Em seguida, o gel foi retirado da placa e transferido para solução fixadora (etanol 50% e ácido acético 12% por um mínimo de 2 hora). A partir desta etapa foi submetido à coloração por prata (Bium et al.,1986).
RESULTADOS e DISCUSSÃO
Observou-se que não houve diferença significativa entre os isolados de B. bassiana ainda que o isolado CB 98 tenha sido, em termos numéricos, superior ao isolado EMCAPA 250 em mais de 20% (Tabela 2).
Mortalidade média de Cosmopolites sordidus observada 24 dias após a pulverização de conídios de Beauveria bassiana (Temperatura 25±lºC, Umidade Relativa 70±10% e Fotofase de 12 horas).
Os níveis de mortalidade obtidos neste trabalho estão próximos daqueles observados por Batista Filho et al. (1989) para o fungo CB 66 que teve o melhor comportamento dentre os isolados testados, infectando 40% da população em condições de laboratório. O isolado CB 66 só teve sua eficiência aumentada p'á.ra valores entre 70 e 98% quando associado a óleos minerais à 5% (Batista Filho et al., 1995).
Foi possívej;verificar que o isolado mais virulento nem sempre é aquele proveniente da mesma espécie do inseto avaliado. Esse comportamento também foi observado por Batista Filho et al. (1989) quando o isolado de B. bassiana originário de C. sordidus proveniente de Miracatu, SP, teve desempenho inferior ao CB 66 no controle do moleque-da-bananeira. O CB 66 foi isolado da broca-do-café coletada em São José do Rio Pardo, SP. Nesse caso, apesar do CB 98 ter sido avaliado sobre a mesma espécie de inseto da qual foi originado, e sobre populações do mesmo local de sua origem, foi menos virulento.
Em condições de campo, a mortalidade observada para os dois isolados foi de 32 e 38%, respectivamente, para CB 98 e ESALQ 604 (Fig. 1). Comparando-se esses valores com os observados por Batiata Filho et al. (1991) para o isolado CB 66 utilizado na mesma região, conclui-se que o nível de controle foi semelhante, haja vista que após 23 dias os autores detectaram 32% na redução populacional de adultos.
Mortalidade média de Cosmopolites sordidus, observada 24 dias após a aplicação da pasta fúngica do entomopatógeno, em isca tipo "queijo". Miracatu, SP, 1997.
É importante ressaltar que a mortalidade entre 32 e 38% permite a redução da população da praga para níveis abaixo do dano econômico (5 insetos/isca), conforme observado por Batista Filho et al. (1995), confirmando a viabilidade de uso do patógeno como ferramenta no manejo dessa coleobroca. A caracterização de isolados é de fundamental importância no desenvolvimento de bioinseticidas e na formação de um banco de entomopatógenos, pois somente pela caracterização é possível conhecer-se a identidade do isolado estudado, já que isolados coletados em regiões ,e hospedeiros diferentes possuem patogenicid de e virulência diferentes para cada inseto-praga estudado.
Eletroforese
Através da análise de perfil de proteínas miceliais de B. bassiana, por PAGE/SDS, foi possível observar algumas diferenças (tanto nas bandas de alto como nas bandas de baixo peso molecular). Porém, embora a técnica de PAGE/SDS seja importante na rápi-
da e correta caracterização de fungos entomopatogênicos, é necessário desenvolver um estudo com um maior número de isolados, originários de diferentes localidades e de maior número de hospedeiros. Uma outra alternativa seria utilizar a eletroforese de isoenzimas, a exemplo do que foi desenvolvido por Lecuona et al. (1996), com isolados de B. bassiana originários do Brasil e Argentina.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- ALVES, S.B. Produção de fungos entomopatogênicos. In: ALVES, S.B. (Ed.) Controle microbiano de insetos. São Paulo: Manole, 1986. p. 311-323.
- ARLEU, R.J. & SILVEIRA NETO, S. Broca da bananeira Cosmopolites sordidus (Germ., 1824) (Coleoptera: Curculionidae). Turrialba, v. 34, n. 3,p.359-367, 1984.
- BATISTA FILHO, A.; CAMARGO, L. M.P.C.A.A.; MYAZAKI, I.; CRUZ, B.P.B.; OLIVEIRA, D.A. Controle biológico do "moleque" da bananeira (Cosmopolites sordidus, GERMAR, 1824) pelo uso de fungos entomopatógenos, no laboratório. Biológico, São Paulo, v. 53, n. 1/6, p. 1-6, 1987.
- BATISTA FILHO, A.; LEITE, L. G.; RAGA, A.; SATO, M. E. Virulência de diferentes isolados DE Eeauveria bassiana (Bals.) Vuill. a Cosmopolites sordidus Germar, 1824. In REUNIÃO ANUAL DO INSTITUTO BIOLÓGICO, 2., 1989, São Paulo, Resumos. Arq. lnst. Eiol. 56, p. 46, 1989. (Suplemento)
- BATISTA FILHO, A.; LEITE, L.G.; RAGA, A.; SATO, M.E. Utilização de Eeauveria bassiana (Bals.) Vuill. no controle do moleque da bananeira Cosmopolites sordidus Germar, 1824 (Coleoptera, Curculionidae). Rev. Eras. Frutic., Cruz das Almas, v. 13, p. 35-40, 1991.
- BATISTA FILHO, A.; LEITE, L.G.; RAGA, A.; SATO, M.E. Enhanced activity of Eeauveria bassiana (Bals.) Vuill. associated with mineral oil against Cosmopolites sordidus (Germar) adults. Anais Soe. Entomol. Eras., v. 24, n. 2, p. 405-408, 1995.
- BATISTA FILHO, A.; LEITE, L.G.; RAGA, A.; SATO, M.E.; OLIVEIRA, J. A. Utilização de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. no manejo de Cosmopolites sordidus Germar, 1824 em Miracatu, SP. Biológico, São Paulo, v. 57, n. 1/ 2, p. 17-19, 1995.
- BLUM, H.; BEIER, H.D.; GRÓSS, H.J. Improved silver staining ofplant proteins, RNA and DNA in poliacrilamide gels. Electrophoresis, v. 8, n. 2, p. 93-99, 1986.
- BRIDGE, P.D.; ABRAHAM, Y.J.; CORNISH, M.C.; PRIOR, C.; MOORE, D. The chemotaxonomy of Eeauveria bassiana (Deuteromycotina: Hyphomycetes) isolates from the coffee berry borer Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae). Mycopathologia, v. 111, n. 2, p. 85-90, 1990.
- BUSOLI, A.C.; FERNANDES, O.A.; TAYRA, O. Controle da broca da bananeira Cosmopolites sordidus Germar, 1824 (Coleoptera, Curculionidae), através dos fungos entomopatogênicos Eeauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorok. (Hyphomycetes). An. Soe. Entomol. Eras., v. 18, p. 33-41, 1989. (Suplemento)
- GORINSTEIN, S.; PACCOLA-MEIRELLES, L.D.; BELO, V.A.; AZEVEDO, J.L. Characterization of Eeauveria bassiana and Aspergillus nidulans through electrophoretic pattems of their protein fractions. J. Ferment. and Eioeng., Osaka, v. 82, n. 2,p. 89-92, 1996.
- HARTREE, E.F. Determination of protein: a modification of the method of the Lowry that gives a linear photometric response. Anal. Biochem., v. 48, n. 2, p. 422-427, 1972.
- LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly ofthe head ofbacteriophage T4. Nature, v. 227, p. 680-685, 1970.
- LECUONA, R.E.; TIGANO, M.S.; DIAZ, B.M. Characterization and pathogenicity of Beauveria bassiana against Diatraea saccharalis (F.) (Lepidoptera: Pyralidae) in Argentina. An. Soe. Entomol. Eras., v. 25, n. 2, p. 299-307, 1996.
- LEITE, L. G.; BATISTA FILHO, A.; CRUZ, B. P. B.; MACHADO, L. A. Produção de fungos entomopatogênicos para o controle biológico de pragas. In CICLO DE PALESTRAS SOBRE CONTROLE BIOLÓGICO DE PRAGAS, 2., 1991, Campinas, SP. Anais. Campinas: Fundação Cargill, 1992. p. 79-92.
- SOZA-GÓMEZ, D.R. Caracterização de isolados de Beauveria spp. e determinação das exigências térmicas e hídricas de Eeauveria bassiana (Bals.) Vuill. Piracicaba: 1990. 98p. [Tese (Doutorado) - ESALQ-USP].
- SUPLICY FILHO, N. & SAMPAIO, A. S. Pragas da bananeira. Biológico, São Paulo, v. 48, p. 169-182, 1982 (Divulgação Técnica).
