Encefalopatia espongiforme bovina atípica: uma revisão

Atypical bovine spongiform encephalopathy: a review

Ellen Elizabeth Laurindo Ivan Roque de Barros FilhoSobre os autores

RESUMO:

A encefalopatia espongiforme bovina (EEB), causada por um príon infectante, surgiu na década de 1980 na Europa como uma nova doença nos rebanhos bovinos e, desde então, estão sendo tomadas várias ações para sua prevenção e controle. A restrição da alimentação de ruminantes com subprodutos de origem animal e a remoção e destruição dos materiais de risco específico para a doença das carcaças em frigoríficos se mostraram efetivas medidas para o controle da doença, além de reduzirem a exposição humana ao agente, pois se trata de uma importante zoonose. No entanto, em 2004 os primeiros casos atípicos de EEB foram diagnosticados, nos quais os agentes causais apresentavam alterações de peso molecular na prova de Western blot, em relação ao agente da forma clássica. Além das diferenças moleculares dos agentes, as apresentações clínicas mostraram-se diferenciadas nas formas atípicas, acometendo principalmente bovinos com idade superior a oito anos. Por se tratar de uma nova forma da doença, muitos estudos estão sendo conduzidos buscando elucidar a patogenia, epidemiologia e seu potencial zoonótico. Objetivou-se neste estudo revisar os principais aspectos relacionados às EEB atípicas enfatizando sua etiologia, epidemiologia, sinais clínicos, diagnóstico e medidas de controle.

PALAVRAS-CHAVE:
príon; bovinos; PrP SC; EEB tipo L; EEB tipo H; EEB tipo SW

ABSTRACT:

Bovine spongiform encephalopathy (BSE), caused by an infectious prion, emerged in the 1980s in Europe as a new disease in cattle and, since then, several actions are being taken for its prevention and control. Restricting the feeding of ruminants with animal by-products and the removal and destruction of specific risk materials (SRM) for the condition of carcasses in slaughterhouses have been proven effective to control the disease, in addition to the reduction of human exposure to the agent, as this is an important zoonosis. However, in 2004 the first atypical cases of BSE were diagnosed, in which the causative agents showed different molecular weights in Western blot (WB), compared to the classical form of the agent. In addition to the molecular differences, clinical presentations proved to be differentiated in atypical forms, affecting mainly cattle older than eight years. Because it is a new form of the disease, many studies are being conducted to elucidate the pathogenesis, epidemiology and zoonotic potential of atypical BSE. The aim of this study was to review the main aspects of atypical BSE emphasizing its etiology, epidemiology, clinical signs, diagnosis and control and prevention measures.

KEYWORDS:
prion; cattle; PrPSC; L-BSE; H-BSE; BSE-SW

INTRODUÇÃO

A encefalopatia espongiforme bovina (EEB), comumente conhecida como “doença da vaca louca”, é uma doença degenerativa fatal e transmissível do sistema nervoso central (SNC) de bovinos, com longo período de incubação (média de cinco anos), diagnosticada pela primeira vez em 1986 na Europa (ANDERSON et al., 1996ANDERSON, R.M.; DONNELLY, C.A.; FERGUSON, N.M.; WOOLHOUSE, M.E.; WATT, C.J.; UDY, H.J.; MAWHINNEY, S.; DUNSTAN, S.P.; SOUTHWOOD, T.R.; WILESMITH, J.W.; RYAN, J.B.; HOINVILLE, L.J.; HILLERTON, J.E.; AUSTIN, A.R.; WELLS, G.A. Transmission dynamics and epidemiology of BSE in British cattle. Nature, v.382, p.779-788, 1996.; WELLS et al., 1987WELLS, G.A.H.; SCOTT, A.C.; JOHNSON, C.T.; GUNNING, R.F.; HANCOCK, R.D.; JEFFREY, M.; DAWSON, M.; BRADLEY, R. A novel progressive spongiform encephalopathy in cattle. Veterinary Record, v.121, p.419-420, 1987.). Pertence ao grupo das encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET), doenças causadas por um agente chamado príon (PrPSC ), uma proteína de conformação espacial alterada e com potencial infeccioso (PRUSINER et al., 1982PRUSINER, S.B.; GADJUSEK, D.C.; ALPERS, M.P. Kuru with incubation periods exceeding two decades. Annals of Neurology, v.12, p.1-9, 1982.). Estudos epidemiológicos desenvolvidos após o aparecimento dos primeiros casos de EEB apontaram a via oral como a principal forma de transmissão do agente, pela ingestão de farinha de carne e ossos (FCO) contendo carcaças de animais positivos (WILESMITH et al., 1988WILESMITH, J.W.; WELLS, G.A.H.; CRANWELL, M.P.; RYAN, J.B. Bovine spongiform encephalopathy: epidemiological studies. Veterinary Record, v.123, p.638-644, 1988.). Os sinais clínicos mais característicos são as alterações comportamentais, a hipersensibilidade aos sons e toques e a apreensão (BRAUN et al., 1998BRAUN, U.; PUSTERLA, N.; SCHICKER, E. Bovine spongiform encephalopathy: diagnostic approach and clinical findings. Compendium on Continuing Education for the Practicing Veterinarian, v.20, p.270-278, 1998.), mas os sinais podem variar de acordo com a região cerebral afetada (SAEGERMAN et al., 2004SAEGERMAN, C.; SPEYBROECK, N.; ROELS, S.; VANOPDENBOSCH, E.; THIRY, E.; BERKVENS, D. Decision support tools for clinical diagnosis of disease in cows with suspected bovine spongiform encephalopathy. Journal of Clinical Microbiology, v.42, p.172-178, 2004.).

O pico da epidemia da EEB na Europa foi no ano de 1992, quando foram registrados 37.316 casos da doença (OIE, 2015). Apesar dos esforços para evitar a entrada de tecidos bovinos potencialmente infectados na cadeia alimentar humana, em 1996 foi comprovada a transmissão da EEB a humanos, causando a variante da doença de Creutzfeldt-Jakob (vDCJ) (WILL et al., 1996WILL, R.G.; IRONSIDE, J.W.; ZEIDLER, M.; ESTIBEIRO, K.; COUSENS, S.N.; SMITH, P.G., ALPEROVITCH, A.; POSER, S.; POCCHIARI, M.; HOFMAN, A. A new variant of Creutzfeldt-Jakob disease in UK. Lancet, v.347, p.921-925, 1996.), resultando em um impacto devastador na indústria pecuária do Reino Unido e no mundo (BROWN et al., 2001BROWN, P.; WILL, R.G.; BRADLEY, R.; ASHER, D.M.; DETWILER, L. Bovine spongiform encephalopathy and variant of Creutzfeldt-Jakob disease: background, evolution, and current concerns. Emerging Infectious Diseases, v.7, p.6-16, 2001.). Devido a esse grande impacto econômico e por ser uma zoonose, as autoridades sanitárias implantaram medidas para proteger a saúde humana e animal, que incluíram a proibição da alimentação de ruminantes com alguns subprodutos de origem animal, a proibição do consumo de carne e subprodutos de animais doentes, a remoção do material de risco específico (MRE) das carcaças de bovinos, vigilância epidemiológica e controle de subprodutos e importação de animais vivos (SEUBERLICH et al., 2010SEUBERLICH, T.; HEIM, D.; ZURBRIGGEN, A. Atypical transmissible spongiform encephalopathies in ruminants: a challenge for disease surveillance and control. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.22, p.823-842, 2010.). Devido a algumas características da doença, como o longo período de incubação, levaram-se mais de duas décadas para que ela fosse finalmente controlada. Contudo, apesar da EEB estar controlada, novas formas, chamadas de EEB atípicas, estão sendo diagnosticadas no mundo. Atualmente, o desafio é caracterizar essas formas atípicas, determinar se as medidas de controle da EEB clássica são efetivas para ambas as formas e mensurar seus possíveis impactos na saúde pública.

Até recentemente, estudos sobre a transmissão a partir de isolados de casos de EEB a campo e casos da vDCJ em seres humanos demonstraram apenas um agente causal (BRUCE et al., 1997BRUCE, M.E.; WILL, R.G.; IRONSIDE, J.W.; MCCONNEL, I.; DRUMMOND, D.; SUTTIE, A.; MCCARDLE, L.; CHREE, A.; HOPE, J.; BIRKETT, C.; COUSENS, S.; FRASER, H.; BOSTOCK, C.J. Transmissions to mice indicate that “new variant” CJD is caused by BSE agent. Nature, v.389, p.498-501, 1997.). Além disso, todos os PrPSC isolados do campo mostraram peso molecular e perfis de glicosilação semelhantes, utilizando técnicas de Western blot (WB) (GAVIER-WIDÉN et al., 2005GAVIER-WIDÉN, D.; STACK, M.J.; BARON, T.; BALACHANDRAN, A.; SIMMONS, M.M. Diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies in animals: a review. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.17, p.509-527, 2005.). Por essas razões, era amplamente aceita, pela comunidade científica, a existência de apenas uma forma de príon causador da EEB, ao contrário do que se observava na Scrapie desde a década de 1970 (FRASER; DICKINSON, 1973FRASER, H.; DICKINSON, A.G. Scrapie in mice: agent strain differences in the distribution and intensity of grey matter vacuolation. Journal of Comparative Pathology, v.83, p.29-40, 1973.).

Os primeiros casos atípicos de EEB foram diagnosticados, quase que simultaneamente, na França e Itália, em 2004. O caso francês demonstrou a existência de uma porção não glicosilada do PrPSC com peso molecular mais alto do que o observado na EEB clássica, sendo então classificado como EEB tipo H (BIACABE et al., 2004BIACABE, A.G.; LAPLANCHE, J.L.; RYDER, S.; BARON, T. Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases. EMBO Rep, v.5, n.1, p.110-115, 2004.). Em contraste, o peso molecular da porção não glicosilada do PrPSC encontrado no caso italiano era menor do que o da EEB clássica, sendo classificado como EEB tipo L (CASALONE et al., 2004CASALONE, C.; ZANUSSO, G.; ACUTIS, P.; FERRARI, S.; CAPUCCI, L.; TAGLIAVINI, F.; MONACO, S.; CARAMELLI, M. Identification of a second bovine amyloidotic spongiform encephalopathy: molecular similarities with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.101, p.3065-3070, 2004.). No início de 2016 foi relatada a identificação de uma terceira forma de EEB atípica, classificada como EEB tipo SW, porém essa nunca foi observada em casos de campo (MASUJIN et al., 2016MASUJIN, K.; OKADA, H.; MIYAZAWA, K.; MATSUURA, Y.; IMAMURA, M.; IWAMARU, Y.; MURAYAMA, Y.; YOKOYAMA, T. Emergence of a novel bovine spongiform encephalopathy (BSE) prion from an atypical H-type BSE. Nature Scientific Report, v.6, 22753, 2016. DOI: 10.1038/srep22753
https://doi.org/10.1038/srep22753...
).

As duas primeiras formas receberam a denominação L e H em referência a essa característica molecular encontrada no exame de WB, onde L refere-se a lower, ou seja, menor, e H (higher), ao maior peso molecular (BUSCHMANN et al., 2006BUSCHMANN, A.; GRETZSCHEL, A.; BIACABE, A.G.; SCHIEBEL, K.; CORONA, C.; HOFFMANN, C.; EIDEN, M.; BARON, T.; CASALONE, C.; GROSCHUP, M.H. Atypical BSE in German - Proof of transmissibility and biochemical characterization. Veterinary Microbiology, v.117, p.103-116, 2006.). A terceira forma atípica, identificada em 2016, recebeu a denominação SW em referência às características clínicas observadas nos animais infectados experimentalmente, como curto período de incubação e perda de peso. Neste caso, S refere-se a short incubation period (curto período de incubação) e W refere-se a weight loss (perda de peso) (MASUJIN et al., 2016MASUJIN, K.; OKADA, H.; MIYAZAWA, K.; MATSUURA, Y.; IMAMURA, M.; IWAMARU, Y.; MURAYAMA, Y.; YOKOYAMA, T. Emergence of a novel bovine spongiform encephalopathy (BSE) prion from an atypical H-type BSE. Nature Scientific Report, v.6, 22753, 2016. DOI: 10.1038/srep22753
https://doi.org/10.1038/srep22753...
).

Na EEB tipo L, exames de imunohistoquímica (IHQ) revelaram a presença de placas amiloidóticas, semelhantes às observadas em outras EET em seres humanos, como na doença de Creutzfeldt-Jacob (DCJ), na nova vCJD, na doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS) e Kuru, que, até então, nunca haviam sido reportadas em animais. Assim, os pesquisadores italianos também denominaram esse novo fenótipo de doença como encefalopatia espongiforme amiloidótica bovina (BASE) (CASALONE et al., 2004CASALONE, C.; ZANUSSO, G.; ACUTIS, P.; FERRARI, S.; CAPUCCI, L.; TAGLIAVINI, F.; MONACO, S.; CARAMELLI, M. Identification of a second bovine amyloidotic spongiform encephalopathy: molecular similarities with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.101, p.3065-3070, 2004.).

Apesar do primeiro caso atípico ter sido diagnosticado na França em 2004, um estudo retrospectivo, utilizando material de casos positivos diagnosticados nesse país desde 2001, revelou que o primeiro caso de EEB tipo H ocorreu, na verdade, no ano 2000 (BIACABE et al., 2008BIACABE, A.G.; MORIGNAT, E.; VULIN, J.; CALAVAS, D.; BARON, T. Atypical bovine spongiform encephalopathies, France, 2001-2007. Emerging Infectious Diseases, v.14, n.2, p.298-300, 2008.). Isso demonstra que as formas atípicas da EEB não são recentes, elas somente não foram devidamente diferenciadas em anos anteriores.

Da mesma forma que no tipo H, há indícios que a EEB tipo L já tenha ocorrido em anos anteriores. Apesar dela ter sido oficialmente diagnosticada apenas em 2004, trabalhos anteriores já demonstravam a existência de placas amiloides em casos positivos de EEB nos anos de 1991 e 1995 (WELLS; WILESMITH, 1995WELLS, G.A.H.; WILESMITH, J.W. The neuropathology and epidemiology of bovine spongiform encephalopathy. Brain Pathology, v.5, p.91-103, 1995.), porém, a ausência de exames de WB inviabilizou a diferenciação do agente à época. Ainda não se têm estudos retrospectivos disponíveis relacionados à EEB tipo SW.

A identificação de outras formas de EEB pode ser atribuída ao aumento da vigilância das EET em todo o mundo, especialmente na Europa (SEUBERLICH et al., 2010SEUBERLICH, T.; HEIM, D.; ZURBRIGGEN, A. Atypical transmissible spongiform encephalopathies in ruminants: a challenge for disease surveillance and control. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.22, p.823-842, 2010.). A descoberta de formas atípicas da EEB em vários países sugere claramente que sua ocorrência não está restrita a uma região geográfica (BUSCHMANN et al., 2006BUSCHMANN, A.; GRETZSCHEL, A.; BIACABE, A.G.; SCHIEBEL, K.; CORONA, C.; HOFFMANN, C.; EIDEN, M.; BARON, T.; CASALONE, C.; GROSCHUP, M.H. Atypical BSE in German - Proof of transmissibility and biochemical characterization. Veterinary Microbiology, v.117, p.103-116, 2006.). Alguns casos atípicos diagnosticados no mundo estão descritos na Tabela 1.

Tabela 1:
Sumário dos casos de encefalopatia espongiforme bovina atípicas diagnosticados em bovinos.

Ambos os tipos de EEB já foram diagnosticados no mundo todo, em animais idosos, e sua baixa prevalência pode indicar que se trata de formas espontâneas da doença no rebanho (BIACABE et al., 2008BIACABE, A.G.; MORIGNAT, E.; VULIN, J.; CALAVAS, D.; BARON, T. Atypical bovine spongiform encephalopathies, France, 2001-2007. Emerging Infectious Diseases, v.14, n.2, p.298-300, 2008.). Porém, o alcance estatístico de estudos epidemiológicos envolvendo as formas atípicas de EEB ainda é limitado devido ao baixo número de casos e à escassez de informações epidemiológicas sobre eles (SALA et al., 2012SALA, C.; MORIGNAT, E.; OUSSAÏD, N.; GAY, E.; ABRIAL, D.; DUCROT, C.; CALAVAS, D. Individual factors associated with L- and H-type Bovine Spongiform Encephalopathy in France. BMC Veterinary Research, v.8, p.74-79, 2012.).

Uma das características das formas atípicas da EEB é a ocorrência em animais idosos (acima de oito anos de idade). O primeiro estudo sobre a epidemiologia das EEB atípicas analisou os casos franceses e demonstrou que a média de idade dos bovinos acometidos pelas formas atípicas (tipo H e L) era de 12 anos (variando entre 7 e 18 anos para o tipo L e 8 a 19 anos para o tipo H), sendo significativamente maior do que a média de idade da EEB clássica (média de 7 anos, variando entre 3 e 15 anos) (SALA et al., 2012SALA, C.; MORIGNAT, E.; OUSSAÏD, N.; GAY, E.; ABRIAL, D.; DUCROT, C.; CALAVAS, D. Individual factors associated with L- and H-type Bovine Spongiform Encephalopathy in France. BMC Veterinary Research, v.8, p.74-79, 2012.). Não houve diferença significativa entre as médias de idade de ocorrência das EEB tipos L e H.

Para muitos cientistas, a hipótese mais aceitável para a origem das EEB atípicas é a forma espontânea, podendo refletir um processo natural de envelhecimento e, talvez, tenha algumas características em comum com outras doenças neurodegenerativas em humanos, como o mal de Alzheimer (CISSE; MUCKE, 2009CISSE, M.; MUCKE, L. Alzheimer’s disease: a prion protein connection. Nature, v.457, p.1090-1091, 2009.). Essa hipótese é reforçada pela idade avançada dos animais acometidos, sua distribuição geográfica heterogênea e pela ausência de ligações epidemiológicas com outras EET (SEUBERLICH et al., 2010SEUBERLICH, T.; HEIM, D.; ZURBRIGGEN, A. Atypical transmissible spongiform encephalopathies in ruminants: a challenge for disease surveillance and control. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.22, p.823-842, 2010.).

Apesar dessas afirmações sobre a origem das EEB atípicas, alguns autores consideram prematuro atribuir a essas doenças uma origem espontânea, até que se tenham mais estudos sobre as formas de transmissão (SEUBERLICH et al., 2010SEUBERLICH, T.; HEIM, D.; ZURBRIGGEN, A. Atypical transmissible spongiform encephalopathies in ruminants: a challenge for disease surveillance and control. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.22, p.823-842, 2010.).

Em vários casos de EEB tipos L e H, houve o sequenciamento do gene PrP buscando identificar alguma mutação que pudesse dar origem à doença. Mas, com exceção de um caso detectado nos Estados Unidos (RICHT et al., 2007RICHT, J.A.; KUNKLE, R.A.; ALT, D.; NICHOLSON, E.M.; HAMIR, A.N.; CZUB, S.; KLUGE, J.; DAVIS, A.J.; HALL, M. Identification and characterization of two bovine spongiform encephalopathy cases diagnosed in the United States. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.19, p.142-154, 2007.), que apresentava uma mutação responsável por codificar lisina no lugar do ácido glutâmico no códon 211 (primeiro caso de EET de origem genética em bovinos), não foram observadas diferenças dos casos clássicos (BRUNELLE et al., 2007BRUNELLE, B.W.; HAMIR, A.N.; BARON, T.; BIACABE, A.G.; RICHT, J.A.; KUNKLE, R.A.; CUTLIP, R.C.; MILLER, J.M.; NICHOLSON, E.M. Polymorphisms of the prion gene promoter region that influence classical bovine spongiform encephalopathy susceptibility are not applicable to other transmissible spongiform encephalopathies in cattle. Journal of Animal Science, v.85, n.12, p.3142-3147, 2007.; BUSCHMANN et al., 2006BUSCHMANN, A.; GRETZSCHEL, A.; BIACABE, A.G.; SCHIEBEL, K.; CORONA, C.; HOFFMANN, C.; EIDEN, M.; BARON, T.; CASALONE, C.; GROSCHUP, M.H. Atypical BSE in German - Proof of transmissibility and biochemical characterization. Veterinary Microbiology, v.117, p.103-116, 2006.; CLAWSON et al., 2008CLAWSON, M.L.; RICHT, J.A.; BARON, T.; BIACABE, A.G.; CZUB, S.; HEATON, M.P.; SMITH, T.P.L.; LAEGREID, W.W. Association of a bovine prion gene haplotype with atypical BSE. PLoS ONE, v.3, e1830, 2008.). Dessa forma, pode-se praticamente descartar a hipótese de origem genética das EEB atípicas (BUSCHMANN et al., 2006BUSCHMANN, A.; GRETZSCHEL, A.; BIACABE, A.G.; SCHIEBEL, K.; CORONA, C.; HOFFMANN, C.; EIDEN, M.; BARON, T.; CASALONE, C.; GROSCHUP, M.H. Atypical BSE in German - Proof of transmissibility and biochemical characterization. Veterinary Microbiology, v.117, p.103-116, 2006.).

O estudo pioneiro sobre a epidemiologia das EEB atípicas foi realizado em 2012, na França, e demonstrou que, ao contrário da EEB clássica, as formas atípicas eram mais frequentes em bovinos de aptidão corte quando comparados com os de aptidão leite (81,8% dos casos de EEB tipo H e 83,3% de EEB tipo L foram diagnosticados em bovinos de corte, contra 20,3% de casos de EEB clássica nessa mesma categoria) (SALA et al., 2012SALA, C.; MORIGNAT, E.; OUSSAÏD, N.; GAY, E.; ABRIAL, D.; DUCROT, C.; CALAVAS, D. Individual factors associated with L- and H-type Bovine Spongiform Encephalopathy in France. BMC Veterinary Research, v.8, p.74-79, 2012.).

Ainda na França, pesquisas demonstraram que a incidência de EEB tipo L e tipo H foram constantes ao longo dos anos, e que não estão relacionadas aos casos clássicos da doença (BIACAGE et al., 2008BIACABE, A.G.; MORIGNAT, E.; VULIN, J.; CALAVAS, D.; BARON, T. Atypical bovine spongiform encephalopathies, France, 2001-2007. Emerging Infectious Diseases, v.14, n.2, p.298-300, 2008.).

De qualquer forma, independente da determinação de sua prevalência ou incidência, o fato das EEB atípicas não estarem relacionadas aos casos clássicos da doença reforça a hipótese que essas representam formas esporádicas de EET, porém, não é possível nesse momento excluir outras origens (SEUBERLICH et al., 2010SEUBERLICH, T.; HEIM, D.; ZURBRIGGEN, A. Atypical transmissible spongiform encephalopathies in ruminants: a challenge for disease surveillance and control. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.22, p.823-842, 2010.).

As pesquisas sobre a neuropatologia e distribuição do PrPSC da EEB, tanto do tipo H quanto do L, são limitadas (SEUBERLICH et al., 2010SEUBERLICH, T.; HEIM, D.; ZURBRIGGEN, A. Atypical transmissible spongiform encephalopathies in ruminants: a challenge for disease surveillance and control. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.22, p.823-842, 2010.). Isso se deve ao fato de não se ter encéfalos e/ou carcaças inteiras oriundas de bovinos positivos disponíveis para estudo pois, na vigilância de rotina (onde normalmente se detecta esses casos), somente a região do óbex é coletada para análise, sendo que as demais partes do encéfalo, bem como a carcaça, acabam sendo destruídas (OKADA et al., 2011OKADA, H.; IWAMARU, Y.; IMAMURA, M.; MASUJIN, K.; MATSUURA, Y.; SHIMIZU, Y.; AKSAI, K.; MOHRI, S.; YOKOYAMA, T.; CZUB, S. Experimental H-type bovine spongiform encephalopathy characterized by plaques and glial- and stellate-type prion protein deposits. Veterinary Research, v.42, p.79-89, 2011.). Além da escassez de material para pesquisas, muitos casos atípicos são oriundos de animais caídos e, normalmente, o tecido coletado desses indivíduos já está em algum estado de decomposição, comprometendo ainda mais estudos sobre patogenia e transmissibilidade (KONOLD et al., 2012KONOLD, T.; BONE, G.E.; CLIFFORD, D.; CHAPLIN, M.J.; CAWTHRAW, S.; STACK, M.J.; SIMMONS, M.M. Experimental H-type and L-type bovine spongiform encephalopathy in cattle: observation of two clinical syndromes and diagnostic challenges. Veterinary Research, v.8, p.22-33, 2012.).

Considerando essas limitações, todo o conhecimento que se tem atualmente sobre transmissão e patogenia das EEB atípicas baseia-se em experimentos realizados por inoculações experimentais em camundongos, primatas não humanos e bovinos, utilizando inóculos a partir de material positivo de bovinos diagnosticados durante as ações de vigilância para a EEB. A maioria dos experimentos de transmissibilidade utiliza inoculações pelas vias intracerebral e intraperitoneal (pela reduzida quantidade de material biológico positivo), não refletindo as reais barreiras interespecíficas observadas numa infecção oral (SEUBERLICH et al., 2010SEUBERLICH, T.; HEIM, D.; ZURBRIGGEN, A. Atypical transmissible spongiform encephalopathies in ruminants: a challenge for disease surveillance and control. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.22, p.823-842, 2010.).

Apesar da infecção por via oral não ser capaz de definir a virulência dos agentes das EEB (clássica, tipo H ou tipo L) (MANUELIDIS, 2010MANUELIDIS, L. Transmissible encephalopathy agents: virulence, geography and clockwork. Virulence, v.1, p.101-104, 2010.), seu conhecimento é importante para a definição das medidas de controle da doença. Dessa forma, várias linhas de pesquisa sobre a transmissibilidade das EEB atípicas estão trabalhando com desafios orais, considerando que esta é a via mais importante de transmissão do agente e, consequentemente, seu conhecimento é necessário para a prevenção de futuras epidemias. Devido ao longo período de incubação da EEB, há poucos estudos concluídos sobre transmissão oral dessas formas (SEUBERLICH et al., 2010SEUBERLICH, T.; HEIM, D.; ZURBRIGGEN, A. Atypical transmissible spongiform encephalopathies in ruminants: a challenge for disease surveillance and control. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.22, p.823-842, 2010.).

Estudos já demonstraram que, assim como o príon causador da EEB clássica, os agentes causadores das EEB tipos L e H também conseguem infectar outras espécies (BÉRINGUE et al., 2007BÉRINGUE, V.; ANDRÉOLETTI, O.; LEDUR, A.; ESSALMANI, R.; VILOTTE, J.L.; LACROUX, C.; REINE, F.; HERZOG, L.; BIACABE, A.G.; BARON, T.; CARAMELLI, M.; CASALONE, C.; LAUDE, H. A bovine prion acquires an epidemic bovine spongiform encephalopathy strain-like phenotype on interspecies transmission. The Journal of Neuroscience, v.27, p.6965-6971, 2007.; BARON et al., 2006BARON, T.G.M.; BIACABE, A.G.; BENCSIK, A.; LANGEVELD, P.M. Transmission of new bovine prion to mice. Emerging Infectious Diseases, v.12, n.7, p.1125-1128, 2006.).

Sobre a patogenia das EEB atípicas, os primeiros relatos dessas doenças já demonstraram que a distribuição do PrPSC em diferentes regiões do cérebro não seguiam o padrão determinado nos casos de EEB clássica (CASALONE et al., 2004CASALONE, C.; ZANUSSO, G.; ACUTIS, P.; FERRARI, S.; CAPUCCI, L.; TAGLIAVINI, F.; MONACO, S.; CARAMELLI, M. Identification of a second bovine amyloidotic spongiform encephalopathy: molecular similarities with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.101, p.3065-3070, 2004.; BIACAGE et al., 2004BIACABE, A.G.; LAPLANCHE, J.L.; RYDER, S.; BARON, T. Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases. EMBO Rep, v.5, n.1, p.110-115, 2004.).

O primeiro estudo sobre a patogenia das EEB atípicas foi desenvolvido em 2011, com desafios utilizando os agentes das EEB tipos L e H em bovinos por via intracerebral (BALKEMA-BUSCHMANN et al., 2011aBALKEMA-BUSCHMANN, A.; FAST, C.; KAATZ, M.; EIDEN, M.; ZIEGLER, U.; MCINTYRE, L.; KELLER, M.; HILLS, B.; GROSCHUP, M.H. Pathogenesis of classical and atypical BSE in cattle. Preventive Veterinary Medicine, v.102, p.112-117, 2011a.). Não se verificaram diferenças na distribuição do PrPSC das formas atípicas em relação à EEB clássica, sendo mínima a concentração em todos os tecidos periféricos analisados. Outra pesquisa também não detectou a presença do agente em nenhum tecido linfoide ou tecido nervoso entérico dos animais desafiados com EEB tipos L e H (KONOLD et al., 2012KONOLD, T.; BONE, G.E.; CLIFFORD, D.; CHAPLIN, M.J.; CAWTHRAW, S.; STACK, M.J.; SIMMONS, M.M. Experimental H-type and L-type bovine spongiform encephalopathy in cattle: observation of two clinical syndromes and diagnostic challenges. Veterinary Research, v.8, p.22-33, 2012.).

Em relação ao SNC, foram observadas alterações na distribuição do agente da EEB tipos L e H em relação à forma clássica apenas no encéfalo, em desafios intracerebrais, havendo maior vacuolização nas regiões rostrais do encéfalo, especialmente no córtex frontal (KONOLD et al., 2012KONOLD, T.; BONE, G.E.; CLIFFORD, D.; CHAPLIN, M.J.; CAWTHRAW, S.; STACK, M.J.; SIMMONS, M.M. Experimental H-type and L-type bovine spongiform encephalopathy in cattle: observation of two clinical syndromes and diagnostic challenges. Veterinary Research, v.8, p.22-33, 2012.). Apesar da distribuição mais rostral desses agentes no SNC, ambos foram detectados no óbex de todos os animais desafiados.

Encefalopatia espongiforme bovina tipo L

A EEB tipo L só conseguiu ser transmitida a camundongos comuns após a segunda passagem, ao contrário do observado com os tipos H e clássico (CAPOBIANCO et al., 2007CAPOBIANCO, R.; CASALONE, C.; SUARDI, S.; MANGIERI, M.; MICCOLO, C.; LIMIDO, L.; CATANIA, M.; ROSSI, G.; DI FEDE, G.; GIACONNE, G.; BRUZZONE, M.G.; MINATI, L.; CORONA, C.; ACUTIS, P.; GELMETTI, D.; LOMBARDI, G.; GROSCHUP, M.H.; BUSCHMANN, A.; ZANUSSO, G.; MONACO, S.; CARAMELLI, M.; TAGLIAVINI, F. Conversion of the BASE prion protein into the BSE strain: the origin of BSE? PLoS Pathogens, v. 3, p. 1-8, 2007.), porém, desenvolveram sinais clínicos após um período médio de 185 dias de incubação, enquanto o período de incubação foi de 230 dias na clássica (BUSCHMANN et al., 2006BUSCHMANN, A.; GRETZSCHEL, A.; BIACABE, A.G.; SCHIEBEL, K.; CORONA, C.; HOFFMANN, C.; EIDEN, M.; BARON, T.; CASALONE, C.; GROSCHUP, M.H. Atypical BSE in German - Proof of transmissibility and biochemical characterization. Veterinary Microbiology, v.117, p.103-116, 2006.). Nesses animais, o PrPSC da EEB tipo L adquire características moleculares e fenótipos neuropatológicos semelhantes à EEB clássica (BÉRINGUE et al., 2006BÉRINGUE, V.; BENCSIK, A.; LE DUR, A.; REINE, F.; LAÏ, T.L.; CHENAIS, N.; TILLY, G.; BIACABE, A.G.; BARON, T.; VILOTTE, J.L.; LAUDE, H. Isolation from cattle of a prion strain distinct from that causing bovine spongiform encephalopathy. PLoS Pathogens, v.2, e112, 2006.), podendo ter uma importante implicação em relação à origem da EEB em bovinos e das EET em outras espécies, incluindo seres humanos (CAPOBIANCO et al., 2007CAPOBIANCO, R.; CASALONE, C.; SUARDI, S.; MANGIERI, M.; MICCOLO, C.; LIMIDO, L.; CATANIA, M.; ROSSI, G.; DI FEDE, G.; GIACONNE, G.; BRUZZONE, M.G.; MINATI, L.; CORONA, C.; ACUTIS, P.; GELMETTI, D.; LOMBARDI, G.; GROSCHUP, M.H.; BUSCHMANN, A.; ZANUSSO, G.; MONACO, S.; CARAMELLI, M.; TAGLIAVINI, F. Conversion of the BASE prion protein into the BSE strain: the origin of BSE? PLoS Pathogens, v. 3, p. 1-8, 2007.). Apesar desses achados em camundongos, não se observou a conversão do príon em sua forma clássica em inoculações intracerebrais em bovinos (IWAMARU et al., 2010IWAMARU, Y.; IMAMURA, M.; MATSUURA, Y.; MASUJIN, K.; SHIMIZU, Y.; SHU, Y.; KURACHI, M.; KASAI, K.; MURAYAMA, Y.; FUKUDA, S.; ONOE, S.; HAGIWARA, K.; YAMAKAWA, Y.; SATA, T.; MOHRI, S.; OKADA, H.; YOKOYAMA, T. Accumulation of L-type bovine prions in peripheral nerve tissues. Emerging Infectious Diseases, v.16, n.7, p.1151-1154, 2010.; BALKEMA-BUSCHMANN et al., 2011bBALKEMA-BUSCHMANN, A.; ZIEGLER, U.; MCINTYRE, L.; KELLER, M.; HOFFMANN, C.; ROGERS, R.; HILLS, B.; GROSCHUP, M.H. Experimental challenge of cattle with german atypical BSE isolates. Journal of Toxicology and Environmental Health, v.74, p.103-109, 2011b.; KONOLD et al., 2012KONOLD, T.; BONE, G.E.; CLIFFORD, D.; CHAPLIN, M.J.; CAWTHRAW, S.; STACK, M.J.; SIMMONS, M.M. Experimental H-type and L-type bovine spongiform encephalopathy in cattle: observation of two clinical syndromes and diagnostic challenges. Veterinary Research, v.8, p.22-33, 2012.), mesmo após uma segunda passagem (KONOLD et al., 2014KONOLD, T.; PHELAN, L.J.; CLIFFORD, D.; CHAPLIN, M.J.; CAWTHRAW, S.; STACK, M.J.; SIMMONS, M.M. The pathological and molecular but not clinical phenotypes are maintained after second passage of experimental atypical bovine spongiform encephalopathy in cattle. BMC Veterinary Research, v.10, e.243, 2014.).

Outro estudo demonstrou um reduzido envolvimento do núcleo motor dorsal do nervo vago e do tronco encefálico na patogenia da EEB tipo L em bovinos, sugerindo que a rota de disseminação do agente não se dá pelo trato digestório, podendo indicar que se trata de uma doença de ocorrência esporádica no rebanho (CASALONE et al., 2004CASALONE, C.; ZANUSSO, G.; ACUTIS, P.; FERRARI, S.; CAPUCCI, L.; TAGLIAVINI, F.; MONACO, S.; CARAMELLI, M. Identification of a second bovine amyloidotic spongiform encephalopathy: molecular similarities with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.101, p.3065-3070, 2004.).

O agente da EEB tipo L pode ser transmitido a camundongos Tg650 PrP humano, sem barreira interespecífica significante, pois experimentalmente houve 100% de taxa de ataque, além de não haver alterações no perfil eletroforético do PrP após seguidas passagens (BÉRINGUE et al., 2008BÉRINGUE, V.; HERZOG, L.; REINE, F.; LEDUR, A.; CASALONE, C.; VILOTTE, J.L.; LAUDE, H. Transmission of atypical bovine prions to mice transgenic for human prion protein. Emerging Infectious Diseases, v.14, n.12, p.1898-1901, 2008.). Além disso, outro experimento demonstrou que esse agente tem tropismo por tecidos linfoides quando inoculado por via intracerebral em camundongos transgênicos para PrPC humana (KONG et al., 2008KONG, Q.; ZHENG, M.; CASALONE, C.; QING, L.; HUANG, S.; CHAKRABORTY, B.; WANG, P.; CHEN, F.; CALI, I.; CORONA, C.; MARTUCCI, F.; IULINI, B.; ACUTIS, P.; WANG, L.; LIANG, J.; WANG, M.; LI, X.; MONACO, S.; ZANUSSO, G.; ZOU, W.Q.; CARAMELLI, M.; GAMBETTI, P. Evalution of the human transmission risk of an atypical bovine spongiform encephalopathy prion strain. Journal of Virology, v.82, n.7, p.3697-3701, 2008.).

Estudos posteriores demonstraram que não houve depósito de PrPSC da EEB tipo L nos tecidos linfoides e linfonodos dos macacos inoculados com esse agente (ONO et al., 2011ONO, F.; TASE, N.; KUROSAWA, A.; HIYAOKA, A.; OHYAMA, A.; TEZUKA, Y.; WADA, N.; SATO, Y.; TOBIUME, M.; HAGIWARA, K.; YAMAKAWA, Y.; TERAO, K.; SATA, T. Atypical L-type bovine spongiform encephalopathy (L-BSE) transmission to Cynomolgus Macaques, a non-human primate. Japanese Journal of Infectious diseases, v.64, p.81-84, 2011.), porém, o desenvolvimento dos sinais clínicos nesses animais foi mais precoce (21 meses) quando comparados aos desafiados com a forma clássica e com a vDCJ, com tempo de sobrevida significativamente menor (COMOY et al., 2008COMOY, E.E.; CASALONE, C.; ETCHEGARAY, N.L.; ZANUSSO, G.; FREIRE, S.; MARCE, D.; AUVRE, F.; RUCHOUX, M.M.; FERRARI, S.; MONACO, S.; SALES, N.; CARAMELLI, M.; LEBOULCH, P.; BROWN, P.; LASMÉZAS, C.I.; DESLYS, J.P. Atypical BSE (BASE) transmitted from asymptomatic aging cattle to a primate. PLoS ONE, v.3, e3017, 2008.).

Em resumo, todos os experimentos de transmissão da EEB tipo L para camundongos transgênicos humanos (KONG et al., 2008KONG, Q.; ZHENG, M.; CASALONE, C.; QING, L.; HUANG, S.; CHAKRABORTY, B.; WANG, P.; CHEN, F.; CALI, I.; CORONA, C.; MARTUCCI, F.; IULINI, B.; ACUTIS, P.; WANG, L.; LIANG, J.; WANG, M.; LI, X.; MONACO, S.; ZANUSSO, G.; ZOU, W.Q.; CARAMELLI, M.; GAMBETTI, P. Evalution of the human transmission risk of an atypical bovine spongiform encephalopathy prion strain. Journal of Virology, v.82, n.7, p.3697-3701, 2008.) e primatas (COMOY et al., 2008COMOY, E.E.; CASALONE, C.; ETCHEGARAY, N.L.; ZANUSSO, G.; FREIRE, S.; MARCE, D.; AUVRE, F.; RUCHOUX, M.M.; FERRARI, S.; MONACO, S.; SALES, N.; CARAMELLI, M.; LEBOULCH, P.; BROWN, P.; LASMÉZAS, C.I.; DESLYS, J.P. Atypical BSE (BASE) transmitted from asymptomatic aging cattle to a primate. PLoS ONE, v.3, e3017, 2008.; ONO et al., 2011ONO, F.; TASE, N.; KUROSAWA, A.; HIYAOKA, A.; OHYAMA, A.; TEZUKA, Y.; WADA, N.; SATO, Y.; TOBIUME, M.; HAGIWARA, K.; YAMAKAWA, Y.; TERAO, K.; SATA, T. Atypical L-type bovine spongiform encephalopathy (L-BSE) transmission to Cynomolgus Macaques, a non-human primate. Japanese Journal of Infectious diseases, v.64, p.81-84, 2011.) revelaram que esse agente é muito mais virulento nessas espécies do que se observa na forma clássica da EEB. Essa característica é uma forte indicação de um alto potencial zoonótico da EEB tipo L, em relação à EEB clássica (BALKEMA-BUSCHMANN et al., 2011aBALKEMA-BUSCHMANN, A.; FAST, C.; KAATZ, M.; EIDEN, M.; ZIEGLER, U.; MCINTYRE, L.; KELLER, M.; HILLS, B.; GROSCHUP, M.H. Pathogenesis of classical and atypical BSE in cattle. Preventive Veterinary Medicine, v.102, p.112-117, 2011a.). No entanto, é necessária a realização de experimentos utilizando a inoculação do agente da EEB tipo L por via oral para uma melhor avaliação da transmissão do agente para seres humanos a partir de produtos de ruminantes infectados (ONO et al., 2011ONO, F.; TASE, N.; KUROSAWA, A.; HIYAOKA, A.; OHYAMA, A.; TEZUKA, Y.; WADA, N.; SATO, Y.; TOBIUME, M.; HAGIWARA, K.; YAMAKAWA, Y.; TERAO, K.; SATA, T. Atypical L-type bovine spongiform encephalopathy (L-BSE) transmission to Cynomolgus Macaques, a non-human primate. Japanese Journal of Infectious diseases, v.64, p.81-84, 2011.).

Em bovinos, estudos demonstraram que não houve transformação do príon da EEB tipo L para a sua forma clássica (EEB clássica) e que o período de incubação da doença atípica foi significativamente menor. Não houve detecção do PrPSC nos tecidos linfoides de nenhum animal desafiado (forma clássica e tipo L), porém, observou-se atrofia muscular nos músculos glúteo médio, psoas maior, longuissimus dorsis e tríceps (LOMBARDI et al., 2008LOMBARDI, G.; CASALONE, C.; D’ANGELO, A.; GELMETTI, D.; TORCOLI, G.; BARBIERI, I.; CORONA, C.; FASOLI, E.; FARINAZZO, A.; FIORINI, M.; GELATI, M.; IULINI, B.; TAGLIAVINI, F.; FERRARI, S.; CARAMELLI, M.; MONACO, S.; CAPUCCI, L.; ZANUSSO, G. Intraspecies transmission of BASE induces clinical dullness and amyotrophic changes. PLoS Pathogens, v.4, e1000075, 2008.). Já outro trabalho demonstrou que o período de incubação de ambas as formas atípicas é mais prolongado, quando comparado a forma clássica da EEB em bovinos, o que justifica a ocorrência dessas formas em animais mais velhos (acima de oito anos) (BALKEMA-BUSCHMANN et al., 2011bBALKEMA-BUSCHMANN, A.; ZIEGLER, U.; MCINTYRE, L.; KELLER, M.; HOFFMANN, C.; ROGERS, R.; HILLS, B.; GROSCHUP, M.H. Experimental challenge of cattle with german atypical BSE isolates. Journal of Toxicology and Environmental Health, v.74, p.103-109, 2011b.).

Em inoculações intracerebrais em bovinos, o agente da EEB tipo L se propaga, inicialmente, no SNC e, da mesma forma que o observado na forma clássica (HOFFMANN et al., 2007HOFFMANN, C.; ZIEGLER, U.; BUSCHMANN, A.; WEBER, A.; KUPFER, L.; OELSCHLEGEL, A.; HAMMERSCHMIDT, B.; GROSCHUP, M.H. Prions spread via the autonomic nervous system from the gut to the central nervous system in cattle incubating bovine spongiform encephalopathy. Journal of General Virology, v.88, p.1048-1055, 2007.), na fase terminal da doença há uma difusão centrífuga pelas terminações nervosas a outros tecidos nervosos (IWAMARU et al., 2010IWAMARU, Y.; IMAMURA, M.; MATSUURA, Y.; MASUJIN, K.; SHIMIZU, Y.; SHU, Y.; KURACHI, M.; KASAI, K.; MURAYAMA, Y.; FUKUDA, S.; ONOE, S.; HAGIWARA, K.; YAMAKAWA, Y.; SATA, T.; MOHRI, S.; OKADA, H.; YOKOYAMA, T. Accumulation of L-type bovine prions in peripheral nerve tissues. Emerging Infectious Diseases, v.16, n.7, p.1151-1154, 2010.). O conhecimento sobre a difusão do agente da EEB tipo L nos tecidos dos bovinos é importante para que haja a correta definição dos MRE a serem removidos e destruídos, garantindo a proteção dos consumidores (IWAMARU et al., 2010IWAMARU, Y.; IMAMURA, M.; MATSUURA, Y.; MASUJIN, K.; SHIMIZU, Y.; SHU, Y.; KURACHI, M.; KASAI, K.; MURAYAMA, Y.; FUKUDA, S.; ONOE, S.; HAGIWARA, K.; YAMAKAWA, Y.; SATA, T.; MOHRI, S.; OKADA, H.; YOKOYAMA, T. Accumulation of L-type bovine prions in peripheral nerve tissues. Emerging Infectious Diseases, v.16, n.7, p.1151-1154, 2010.).

Encefalopatia espongiforme bovina tipo H

O agente da EEB tipo H foi transmitido experimentalmente em camundongos normais (BARON et al., 2006BARON, T.G.M.; BIACABE, A.G.; BENCSIK, A.; LANGEVELD, P.M. Transmission of new bovine prion to mice. Emerging Infectious Diseases, v.12, n.7, p.1125-1128, 2006.; CAPOBIANCO et al., 2007CAPOBIANCO, R.; CASALONE, C.; SUARDI, S.; MANGIERI, M.; MICCOLO, C.; LIMIDO, L.; CATANIA, M.; ROSSI, G.; DI FEDE, G.; GIACONNE, G.; BRUZZONE, M.G.; MINATI, L.; CORONA, C.; ACUTIS, P.; GELMETTI, D.; LOMBARDI, G.; GROSCHUP, M.H.; BUSCHMANN, A.; ZANUSSO, G.; MONACO, S.; CARAMELLI, M.; TAGLIAVINI, F. Conversion of the BASE prion protein into the BSE strain: the origin of BSE? PLoS Pathogens, v. 3, p. 1-8, 2007.) e em camundongos transgênicos PrP bovino e ovino (BÉRINGUE et al., 2006BÉRINGUE, V.; BENCSIK, A.; LE DUR, A.; REINE, F.; LAÏ, T.L.; CHENAIS, N.; TILLY, G.; BIACABE, A.G.; BARON, T.; VILOTTE, J.L.; LAUDE, H. Isolation from cattle of a prion strain distinct from that causing bovine spongiform encephalopathy. PLoS Pathogens, v.2, e112, 2006.; 2007BÉRINGUE, V.; ANDRÉOLETTI, O.; LEDUR, A.; ESSALMANI, R.; VILOTTE, J.L.; LACROUX, C.; REINE, F.; HERZOG, L.; BIACABE, A.G.; BARON, T.; CARAMELLI, M.; CASALONE, C.; LAUDE, H. A bovine prion acquires an epidemic bovine spongiform encephalopathy strain-like phenotype on interspecies transmission. The Journal of Neuroscience, v.27, p.6965-6971, 2007.). Nesses experimentos não houve conversão do agente ou alteração fenotípica para o tipo clássico, como se observou na EEB tipo L. Porém, estudos posteriores demonstraram que o agente da EEB tipo H foi capaz de se converter no tipo clássico após sucessivas passagens em camundongos comuns (BARON et al., 2011BARON, T.; VULIN, J.; BIACABE, A.G.; LAKHDAR, L.; VERCHERE, J.; TORRES, J.M.; BENCSIK, A. Emergence of classical BSE strain properties during serial passages of H-BSE in wild type mice. PLoS ONE, v.6, e15839, 2011.); e em camundongos transgênicos para PrPC bovino (TgBov) (TORRES et al., 2011TORRES, J.M.; ANDREOLETTI, O.; LACROUX, C.; PRIETO, I.; LORENZO, P.; LARSKA, M.; BARON, T.; ESPINOSA, J.C. Classical bovine spongiform encephalopathy by transmission of H-type prion in homologous prion protein context. Emerging Infectious Diseases, v.17, n.9, p.1636-1644, 2011.). Esses resultados demonstram a capacidade do príon da EEB tipo H adquirir características da forma clássica, quando da presença de proteína PrPC bovina. Isso reforça a hipótese de que o agente que originou a epidemia de EEB clássica pode ter se originado a partir dessa forma atípica (TORRES et al., 2011TORRES, J.M.; ANDREOLETTI, O.; LACROUX, C.; PRIETO, I.; LORENZO, P.; LARSKA, M.; BARON, T.; ESPINOSA, J.C. Classical bovine spongiform encephalopathy by transmission of H-type prion in homologous prion protein context. Emerging Infectious Diseases, v.17, n.9, p.1636-1644, 2011.).

Em inoculações intracerebrais em camundongos transgênicos tg650 PrP humano, o isolado de EEB tipo H não infectou nem transmitiu a doença a esses animais. Esse resultado reforça a hipótese de que há uma forte barreira de transmissão desse tipo de EEB entre os bovinos e seres humanos (BÉRINGUE et al., 2008BÉRINGUE, V.; HERZOG, L.; REINE, F.; LEDUR, A.; CASALONE, C.; VILOTTE, J.L.; LAUDE, H. Transmission of atypical bovine prions to mice transgenic for human prion protein. Emerging Infectious Diseases, v.14, n.12, p.1898-1901, 2008.).

Após sucessivas passagens do agente da EEB tipo H em cérebros de camundongos transgênicos TgBov e posterior inoculação intracerebral em bovinos, um estudo demonstrou a alteração do príon para a forma de EEB tipo SW. Nesse caso, o período de incubação, tanto nos camundongos transgênicos como nos bovinos, foi menor do que o observado nas formas clássica, tipo L e tipo H, indicando maior virulência dessa nova forma (MASUJIN et al., 2016MASUJIN, K.; OKADA, H.; MIYAZAWA, K.; MATSUURA, Y.; IMAMURA, M.; IWAMARU, Y.; MURAYAMA, Y.; YOKOYAMA, T. Emergence of a novel bovine spongiform encephalopathy (BSE) prion from an atypical H-type BSE. Nature Scientific Report, v.6, 22753, 2016. DOI: 10.1038/srep22753
https://doi.org/10.1038/srep22753...
).

Em inoculação intracerebral em bovinos, estudos demonstraram que o agente da EEB tipo H teve distribuição mais cortical (córtex frontal, tálamo e hipotálamo) e com escore de lesão vacuolar superior ao observado nos casos de EEB clássica (OKADA et al., 2011OKADA, H.; IWAMARU, Y.; IMAMURA, M.; MASUJIN, K.; MATSUURA, Y.; SHIMIZU, Y.; AKSAI, K.; MOHRI, S.; YOKOYAMA, T.; CZUB, S. Experimental H-type bovine spongiform encephalopathy characterized by plaques and glial- and stellate-type prion protein deposits. Veterinary Research, v.42, p.79-89, 2011.).

SINAIS CLÍNICOS

De forma geral, as EEB atípicas, ao contrário da forma clássica, não estão sendo diagnosticadas em animais com sinais clínicos neurológicos, mas sim em bovinos aparentemente saudáveis encaminhados ao abate de rotina, ao abate de emergência ou em bovinos em decúbito, sugerindo que sua apresentação clínica é diferente da EEB clássica (KONOLD et al., 2012KONOLD, T.; BONE, G.E.; CLIFFORD, D.; CHAPLIN, M.J.; CAWTHRAW, S.; STACK, M.J.; SIMMONS, M.M. Experimental H-type and L-type bovine spongiform encephalopathy in cattle: observation of two clinical syndromes and diagnostic challenges. Veterinary Research, v.8, p.22-33, 2012.).

Apesar de estudos demonstrarem não haver diferença estatística entre a síndrome nervosa observada em bovinos inoculados com as formas atípicas e clássicas de EEB, há diferenças notáveis em relação à forma clássica: a ausência de tremores, a dificuldade de levantar e a dismetria já nas fases iniciais da doença, em todas as formas atípicas (KONOLD et al., 2012KONOLD, T.; BONE, G.E.; CLIFFORD, D.; CHAPLIN, M.J.; CAWTHRAW, S.; STACK, M.J.; SIMMONS, M.M. Experimental H-type and L-type bovine spongiform encephalopathy in cattle: observation of two clinical syndromes and diagnostic challenges. Veterinary Research, v.8, p.22-33, 2012.).

Em relação aos sinais clínicos, postulou-se que as forma clássica e atípicas de EEB em bovinos parecem produzir dois fenótipos clínicos principais: a forma nervosa ou a forma “apática”, sendo a EEB clássica a que apresenta os sinais clínicos mais intensos e uniformes (especialmente em relação ao nervosismo) (KONOLD et al., 2012KONOLD, T.; BONE, G.E.; CLIFFORD, D.; CHAPLIN, M.J.; CAWTHRAW, S.; STACK, M.J.; SIMMONS, M.M. Experimental H-type and L-type bovine spongiform encephalopathy in cattle: observation of two clinical syndromes and diagnostic challenges. Veterinary Research, v.8, p.22-33, 2012.). O desenvolvimento da forma apática só foi observado em bovinos com curso clínico prolongado, e que previamente apresentaram a forma nervosa da doença. Isso pode sugerir que todos os bovinos acometidos com as formas atípicas da EEB podem eventualmente desenvolver a forma apática, caso não sejam sacrificados ou abatidos antes (KONOLD et al., 2012KONOLD, T.; BONE, G.E.; CLIFFORD, D.; CHAPLIN, M.J.; CAWTHRAW, S.; STACK, M.J.; SIMMONS, M.M. Experimental H-type and L-type bovine spongiform encephalopathy in cattle: observation of two clinical syndromes and diagnostic challenges. Veterinary Research, v.8, p.22-33, 2012.).

Nos estudos realizados até o presente momento, todos os bovinos inoculados com as EEB atípicas apresentaram dificuldades para levantar (BALKEMA-BUSCHMANN et al., 2011bBALKEMA-BUSCHMANN, A.; ZIEGLER, U.; MCINTYRE, L.; KELLER, M.; HOFFMANN, C.; ROGERS, R.; HILLS, B.; GROSCHUP, M.H. Experimental challenge of cattle with german atypical BSE isolates. Journal of Toxicology and Environmental Health, v.74, p.103-109, 2011b.; KONOLD et al., 2012KONOLD, T.; BONE, G.E.; CLIFFORD, D.; CHAPLIN, M.J.; CAWTHRAW, S.; STACK, M.J.; SIMMONS, M.M. Experimental H-type and L-type bovine spongiform encephalopathy in cattle: observation of two clinical syndromes and diagnostic challenges. Veterinary Research, v.8, p.22-33, 2012.). Essa característica clínica explica a razão pela qual a maior parte dos casos de EEB atípicas diagnosticados a campo estarem relacionados a animais caídos (RICHT et al., 2007RICHT, J.A.; KUNKLE, R.A.; ALT, D.; NICHOLSON, E.M.; HAMIR, A.N.; CZUB, S.; KLUGE, J.; DAVIS, A.J.; HALL, M. Identification and characterization of two bovine spongiform encephalopathy cases diagnosed in the United States. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.19, p.142-154, 2007.; STACK et al., 2009STACK, M.J.; FOCOSI-SNYMAN, R.; CAWTHRAW, S.; DAVIS, L.; CHAPLIN, M.J. Third atypical BSE case in Great Britain with H-type molecular profile. Veterinary Record, v.165, p.605-606, 2009.; GAVIER-WIDÉN et al., 2008GAVIER-WIDÉN, D.; NÖREMARK, M.; LANGEVELD, J.P.M.; STACK, M.; BIACABE, A.G.; VULIN, J.; CHAPLIN, M.; RICHT, J.A.; JACOBS, J.; ACÍN, A.; MONLEÓN, E.; RENSTRÖM, L.; KLINGEBORN, B.; BARON, T.G.M. Bovine spongiform encephalopathy in Sweden: an H-type variant. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.20, p.2-10, 2008.).

A duração dos sinais clínicos das formas atípicas de EEB foi de 4 a 10 meses para a EEB tipo L, e 2 a 7 meses para a EEB tipo H, (KONOLD et al., 2012KONOLD, T.; BONE, G.E.; CLIFFORD, D.; CHAPLIN, M.J.; CAWTHRAW, S.; STACK, M.J.; SIMMONS, M.M. Experimental H-type and L-type bovine spongiform encephalopathy in cattle: observation of two clinical syndromes and diagnostic challenges. Veterinary Research, v.8, p.22-33, 2012.) sendo mais longa quando comparada a outros estudos (LOMBARDI et al., 2008LOMBARDI, G.; CASALONE, C.; D’ANGELO, A.; GELMETTI, D.; TORCOLI, G.; BARBIERI, I.; CORONA, C.; FASOLI, E.; FARINAZZO, A.; FIORINI, M.; GELATI, M.; IULINI, B.; TAGLIAVINI, F.; FERRARI, S.; CARAMELLI, M.; MONACO, S.; CAPUCCI, L.; ZANUSSO, G. Intraspecies transmission of BASE induces clinical dullness and amyotrophic changes. PLoS Pathogens, v.4, e1000075, 2008.; FUKUDA et al., 2009FUKUDA, S.; IWAMARU, Y.; IMAMURA, M.; MASUJIN, K.; SHIMIZU, Y.; MATSUURA, Y.; SHU, Y.; KURACHI, M.; KASAI, K.; MURAYAMA, Y.; ONOE, S.; HAGIWARA, K.; SATA, T.; MOHRI, S.; YOKOAMA, T.; OKADA, H. Intraspecies transmission of L-type-like bovine spongiform encephalopathy detected in Japan. Microbiology and Immunology, v.53, p.704-707, 2009.) e menor quando comparada ao estudo de OKADA et al. (2011OKADA, H.; IWAMARU, Y.; IMAMURA, M.; MASUJIN, K.; MATSUURA, Y.; SHIMIZU, Y.; AKSAI, K.; MOHRI, S.; YOKOYAMA, T.; CZUB, S. Experimental H-type bovine spongiform encephalopathy characterized by plaques and glial- and stellate-type prion protein deposits. Veterinary Research, v.42, p.79-89, 2011.). Essas variações na duração clínica da doença podem ser atribuídas às raças dos bovinos utilizadas nesses estudos (KONOLD et al., 2012KONOLD, T.; BONE, G.E.; CLIFFORD, D.; CHAPLIN, M.J.; CAWTHRAW, S.; STACK, M.J.; SIMMONS, M.M. Experimental H-type and L-type bovine spongiform encephalopathy in cattle: observation of two clinical syndromes and diagnostic challenges. Veterinary Research, v.8, p.22-33, 2012.), da mesma forma que ocorreu com estudos da forma clássica da EEB (WILESMITH et al., 1992WILESMITH, J.W.; HOIVILLE, L.J.; RYAN, J.B.; SAYERS, A.R. Bovine spongiform encephalopathy: aspects of the clinical picture and analyses of possible changes 1986-1990. Veterinary Record, v.130, p.197-201, 1992.).

Observa-se que ainda não é possível definir claramente quais os sinais clínicos característicos das formas atípicas, bem como seu período de incubação e tempo de manifestação clínica, pois poucos estudos chegam à mesma conclusão.

DIAGNÓSTICO

Até 2004, pensava-se que a conformação no WB era única para todos os PrPSC tanto na EEB natural quanto na experimental (STACK, 2004STACK, M. Western immunoblotting techniques for the study of transmissible spongiform encephalopathies. In: STACK, M. Methods and tools in biosciences and medicine - techniques in prion research. Berlim: Birkhäuser Verlag, 2004. p.97-116.). Estudos posteriores demonstraram a existência de outras conformações no WB, relacionadas a formas atípicas de EEB, o que criou um desafio no campo diagnóstico.

O diagnóstico clínico das formas atípicas de EEB é bastante limitado, pois ainda estão sendo definidos quais sinais são característicos dessas enfermidades (SEUBERLICH et al., 2010SEUBERLICH, T.; HEIM, D.; ZURBRIGGEN, A. Atypical transmissible spongiform encephalopathies in ruminants: a challenge for disease surveillance and control. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.22, p.823-842, 2010.). Outro estudo concluiu ser impossível o diagnóstico das formas atípicas apenas com os achados clínicos (BALKEMA-BUSCHMANN et al., 2011bBALKEMA-BUSCHMANN, A.; ZIEGLER, U.; MCINTYRE, L.; KELLER, M.; HOFFMANN, C.; ROGERS, R.; HILLS, B.; GROSCHUP, M.H. Experimental challenge of cattle with german atypical BSE isolates. Journal of Toxicology and Environmental Health, v.74, p.103-109, 2011b.).

Com base nos estudos de sinais clínicos já realizados, pode-se considerar as EEB atípicas em diagnósticos clínicos diferenciais em bovinos idosos (com mais de oito anos) encontrados caídos, com dificuldade de se levantar e com histórico ou presença de reações exacerbadas a estímulos externos (KONOLD et al., 2012KONOLD, T.; BONE, G.E.; CLIFFORD, D.; CHAPLIN, M.J.; CAWTHRAW, S.; STACK, M.J.; SIMMONS, M.M. Experimental H-type and L-type bovine spongiform encephalopathy in cattle: observation of two clinical syndromes and diagnostic challenges. Veterinary Research, v.8, p.22-33, 2012.).

Considerando que estudos de patogenia e distribuição do agente das EEB atípicas demonstraram que os depósitos do PrPSC estão distribuídos nas porções mais craniais do encéfalo e também no cerebelo, pode ser considerada a possibilidade de se ampliar os materiais de eleição para diagnóstico nas ações de vigilância ativa de EEB, incluindo o cerebelo (que pode ser retirado, da mesma forma que o tronco encefálico, pelo forame magno, sem a necessidade da abertura da cabeça) (KONOLD et al., 2012KONOLD, T.; BONE, G.E.; CLIFFORD, D.; CHAPLIN, M.J.; CAWTHRAW, S.; STACK, M.J.; SIMMONS, M.M. Experimental H-type and L-type bovine spongiform encephalopathy in cattle: observation of two clinical syndromes and diagnostic challenges. Veterinary Research, v.8, p.22-33, 2012.).

O diagnóstico diferencial das atípicas baseia-se nas características moleculares do PrPRES identificadas através da técnica de WB (MELONI et al., 2012MELONI, D.; DAVIDSE, A.; LANGEVELD, J.P.M.; VARELLO, K.; CASALONE, C.; CORONA, C.; BALKEMA-BUSCHMANN, A.; GROSCHUP, M.H.; INGRAVALLE, F.; BOZZETTA, E. EU-approved rapid tests for bovine spongiform encephalopathy detect atypical forms: a study for their sensitivities. PLoS ONE, v.7, e43133, 2012.). Após a digestão pela proteinase K, o PrPRES pode apresentar três glicoformas: a não glicosilada, a monoglicosilada e a diglicosilada. Dependendo da quantidade de cada uma dessas glicoformas e sua posição na banda do WB, faz-se a separação dos agentes da EEB nos tipos clássico, H (higher) e L (lower) (JACOBS et al., 2007JACOBS, J.G.; LANGERVELD, J.P.; BIACABE, A.G.; ACUTIS, P.L.; POLAK, M.P.; GAVIER-WIDÉN, D.; BUSCHMANN, A.; CARAMELLI, A.; CASALONE, C.; MAZZA, M.; GROSCHUP, M.; ERKENS, J.H.F.; DAVIDSE, A.; VAN ZIJDERVELD, F.G.; BARON, T. Molecular discrimination of atypical bovine spongiform encephalopathy strains from a geographical region spanning a wide area in Europe. Journal of Clinical Microbiology, v.45, p.1821-1829, 2007.) e SW (MASUJIN et al., 2016MASUJIN, K.; OKADA, H.; MIYAZAWA, K.; MATSUURA, Y.; IMAMURA, M.; IWAMARU, Y.; MURAYAMA, Y.; YOKOYAMA, T. Emergence of a novel bovine spongiform encephalopathy (BSE) prion from an atypical H-type BSE. Nature Scientific Report, v.6, 22753, 2016. DOI: 10.1038/srep22753
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).

As EEB tipos H e L apresentam massa molecular maior e menor, respectivamente, nas porções não glicosiladas do PrPRES pela técnica de WB em relação à forma clássica. Já a forma SW é mais leve do que a forma H e mais semelhante à clássica (MASUJIN et al., 2016MASUJIN, K.; OKADA, H.; MIYAZAWA, K.; MATSUURA, Y.; IMAMURA, M.; IWAMARU, Y.; MURAYAMA, Y.; YOKOYAMA, T. Emergence of a novel bovine spongiform encephalopathy (BSE) prion from an atypical H-type BSE. Nature Scientific Report, v.6, 22753, 2016. DOI: 10.1038/srep22753
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). Além disso, a EEB tipo L tem uma menor proporção de PrPRES diglicosilado, sendo a característica molecular mais marcante desse agente (CASALONE et al., 2004CASALONE, C.; ZANUSSO, G.; ACUTIS, P.; FERRARI, S.; CAPUCCI, L.; TAGLIAVINI, F.; MONACO, S.; CARAMELLI, M. Identification of a second bovine amyloidotic spongiform encephalopathy: molecular similarities with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.101, p.3065-3070, 2004.).

MEDIDAS DE CONTROLE

Desde 2004, alguns autores reforçam a possibilidade da EEB ter diferentes manifestações, o que poderia impactar nas medidas de controle da doença em vigor já naquela época. Além disso, reiteraram a necessidade da realização de novos estudos para determinar a frequência desses príons atípicos na população bovina e outros achados biológicos envolvendo essa cepa infectante (BIACAGE et al., 2004BIACABE, A.G.; LAPLANCHE, J.L.; RYDER, S.; BARON, T. Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases. EMBO Rep, v.5, n.1, p.110-115, 2004.).

Considerando uma possível origem espontânea e esporádica das formas atípicas, é factível que elas persistam nos rebanhos bovinos mesmo após a erradicação da forma clássica da EEB. Considerando que tanto o agente da EEB tipo L (BÉRINGUE et al., 2006BÉRINGUE, V.; BENCSIK, A.; LE DUR, A.; REINE, F.; LAÏ, T.L.; CHENAIS, N.; TILLY, G.; BIACABE, A.G.; BARON, T.; VILOTTE, J.L.; LAUDE, H. Isolation from cattle of a prion strain distinct from that causing bovine spongiform encephalopathy. PLoS Pathogens, v.2, e112, 2006.) quanto o tipo H (GULDIMANN et al., 2012GULDIMANN, C.; GSPONER, M.; DROGEMULLER, C.; OEVERMANN, A.; SEUBERLICH, T. Atypical H-type bovine spongiform encephalopathy in a cow born after the reinforced feed ban on meat-and-bone meal in Europe. Journal of Clinical Microbiology, v.50, p.4171-4174, 2012.) se converteram na forma clássica após passagens em camundongos, há um risco constante da reemergência da EEB clássica caso a proibição do uso de subprodutos de origem animal na alimentação de ruminantes (feed ban) seja diminuída ou revogada.

Apesar da ausência de estudos que esclareçam a manifestação e patogenia da EEB tipo SW, a manutenção das ações de prevenção da EEB, como o feedban, é necessária mesmo após a erradicação da EEB clássica (MASUJIN et al., 2016MASUJIN, K.; OKADA, H.; MIYAZAWA, K.; MATSUURA, Y.; IMAMURA, M.; IWAMARU, Y.; MURAYAMA, Y.; YOKOYAMA, T. Emergence of a novel bovine spongiform encephalopathy (BSE) prion from an atypical H-type BSE. Nature Scientific Report, v.6, 22753, 2016. DOI: 10.1038/srep22753
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). Assim, algumas medidas de mitigação de risco deverão ser continuamente e permanentemente mantidas, até que se tenha maior conhecimento sobre o potencial infeccioso e zoonótico das EEB atípicas (GULDIMANN et al., 2012GULDIMANN, C.; GSPONER, M.; DROGEMULLER, C.; OEVERMANN, A.; SEUBERLICH, T. Atypical H-type bovine spongiform encephalopathy in a cow born after the reinforced feed ban on meat-and-bone meal in Europe. Journal of Clinical Microbiology, v.50, p.4171-4174, 2012.).

O conhecimento sobre a patogenia das formas atípicas da EEB é fundamental para a determinação das medidas de controle da doença, em especial o potencial risco da exposição humana ao agente. Atualmente, assume-se que a distribuição do agente das atípicas, no SNC, é semelhante ao observado nos casos clássicos. Porém, se for comprovado que essa distribuição é diferenciada, principalmente no que se refere aos MRE, poderemos ter problemas de saúde pública e na mitigação de risco (SEUBERLICH et al., 2010SEUBERLICH, T.; HEIM, D.; ZURBRIGGEN, A. Atypical transmissible spongiform encephalopathies in ruminants: a challenge for disease surveillance and control. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.22, p.823-842, 2010.).

É interessante ressaltar que o número de casos de EEB atípicas é infinitamente inferior aos casos clássicos durante a epidemia nos anos 1990. Por essa razão a demonstração do possível caráter zoonótico das EEB atípicas pode não acarretar na pronta mudança nas ações de mitigação de risco dessa doença, pois o risco de exposição a esses agentes é baixo (SEUBERLICH et al., 2010SEUBERLICH, T.; HEIM, D.; ZURBRIGGEN, A. Atypical transmissible spongiform encephalopathies in ruminants: a challenge for disease surveillance and control. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.22, p.823-842, 2010.).

Embora já se tenha confirmado a ligação entre a EEB clássica e a vCJD em seres humanos (WILL et al., 1996WILL, R.G.; IRONSIDE, J.W.; ZEIDLER, M.; ESTIBEIRO, K.; COUSENS, S.N.; SMITH, P.G., ALPEROVITCH, A.; POSER, S.; POCCHIARI, M.; HOFMAN, A. A new variant of Creutzfeldt-Jakob disease in UK. Lancet, v.347, p.921-925, 1996.), não foi identificada nenhuma associação entre as EEB atípicas e as EET humanas: não há ligação epidemiológica que indique que se trata de zoonoses. Porém, as características moleculares da EEB tipo L são semelhantes à DCJ, além disso, os estudos utilizando camundongos transgênicos de PrP humano e primatas demonstraram que o agente da EEB tipo L se replica com mais eficiência do que o da EEB clássica (BÉRINGUE et al., 2008BÉRINGUE, V.; HERZOG, L.; REINE, F.; LEDUR, A.; CASALONE, C.; VILOTTE, J.L.; LAUDE, H. Transmission of atypical bovine prions to mice transgenic for human prion protein. Emerging Infectious Diseases, v.14, n.12, p.1898-1901, 2008.; COMOY et al., 2008COMOY, E.E.; CASALONE, C.; ETCHEGARAY, N.L.; ZANUSSO, G.; FREIRE, S.; MARCE, D.; AUVRE, F.; RUCHOUX, M.M.; FERRARI, S.; MONACO, S.; SALES, N.; CARAMELLI, M.; LEBOULCH, P.; BROWN, P.; LASMÉZAS, C.I.; DESLYS, J.P. Atypical BSE (BASE) transmitted from asymptomatic aging cattle to a primate. PLoS ONE, v.3, e3017, 2008.; KONG et al., 2008KONG, Q.; ZHENG, M.; CASALONE, C.; QING, L.; HUANG, S.; CHAKRABORTY, B.; WANG, P.; CHEN, F.; CALI, I.; CORONA, C.; MARTUCCI, F.; IULINI, B.; ACUTIS, P.; WANG, L.; LIANG, J.; WANG, M.; LI, X.; MONACO, S.; ZANUSSO, G.; ZOU, W.Q.; CARAMELLI, M.; GAMBETTI, P. Evalution of the human transmission risk of an atypical bovine spongiform encephalopathy prion strain. Journal of Virology, v.82, n.7, p.3697-3701, 2008.).

BROWN et al. (2006BROWN, P.; MCSHANE, L.M.; ZANUSSO, G.; DETWILER, L. On the question of sporadic or atypical bovine spongiform encephalopathy and Creutzfeldt-Jakob disease. Emerging Infectious Diseases, v.12, p.1816-1821, 2006.) ponderaram que existe a possibilidade de que ao menos alguns casos de DCJ esporádica possam ser relacionados à infecção humana pelo consumo de animais infectados EEB atípicas, porém, não há ligações epidemiológicas visto que não há comprovação, em nenhum dos casos, de exposição a animais infectados. Atribui-se a dificuldade de se estabelecer ligações entre a EEB atípica e a DCJ ao pouco conhecimento sobre os parâmetros de infecção das formas atípicas da EEB, como por exemplo, hospedeiro, infectividade em tecidos, rota de transmissão e dose mínima infectante para seres humanos.

Considerando que há uma pressão para a retirada da proibição de alimentar ruminantes com FCO, esses aspectos devem ser fortemente considerados para evitar o risco de uma reemergência da EEB nos rebanhos (SEUBERLICH et al., 2010SEUBERLICH, T.; HEIM, D.; ZURBRIGGEN, A. Atypical transmissible spongiform encephalopathies in ruminants: a challenge for disease surveillance and control. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.22, p.823-842, 2010.).

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    2017

Histórico

  • Recebido
    26 Maio 2015
  • Aceito
    05 Out 2016
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