Estudo experimental comparativo da ação das neurocinas cardiotrofina-1 e oncostatina-m na regeneração nervosa periférica

Sérgio Augusto M. da Gama Rames Mattar Jr. Ciro Ferreira da Silva Raquel Dias Lainetti Sobre os autores

Resumos

Os avanços das técnicas microcirúrgicas e o conhecimento detalhado do microambiente da regeneração podem contribuir significativamente na melhoria dos resultados das reparações nervosas periféricas. Nos últimos anos vários autores têm utilizado uma série de tecidos e substâncias interpostos entre os cotos de um nervo periférico seccionado, buscando estimular o crescimento axonal no local da lesão. Através da técnica de tubulização, os autores estudam o efeito de duas neurocinas, a cardiotrofina-1 (CT-1) e a oncostatina-M (OsM), no crescimento axonal e na sobrevida dos neurônios sensitivos nos gânglios da raiz dorsal de L5, após a lesão de nervos ciáticos em camundongos C57BL/6J. Utilizam 3 grupos de 7 animais que tiveram seus nervos seccionados e tubulizados com próteses de polietileno preenchidas com cardiotrofina-1, oncostatina-M e citocromo-C, associadas a um extrato de colágeno. Um quarto grupo de 3 animais, não operados, foi considerado por nós como grupo controle de normalidade. Após 4 semanas da cirurgia, os camundongos foram sacrificados, e realizada a contagem das fibras mielínicas nos cabos de regeneração retirados. Os gânglios das raizes dorsais de L5 também foram dissecados possibilitando a contagem dos neurônios sensitivos. Os dados foram analisados estatisticamente, permitindo concluir que as duas substâncias, utilizadas por nós, foram efetivas no estímulo ao brotamento axonal, porém, as mesmas não conseguiram impedir a morte dos neurônios sensitivos no gânglio da raiz dorsal de L5.


The advances in microsurgery procedures and the detailed knowledge of regeneration may contribute significantly to the improvement of the results of peripheral nerve repair. In the last years, several authors have used series of tissues and substances interposed between the stumps of the sectioned peripheral nerve, trying to stimulate the axon growth in the lesion site. Using the nerve entubulation technique, the author studied the effect of two neurokines, cardiotrophin-1 (CT-1) and oncostatin M (OsM), in the axonal growth and in the survival rate of sensory neurons of L-5 root ganglion after sciatic nerve lesion in C57BL/6J mice. The author used three groups of five animals that had their sciatic nerve sectioned and repaired with polyethylene tubular prostheses filled with cardiotrophin-1, oncostatin -M or cytochrome-C, dissolved in the collagen extract. The fourth group of three non-operated animals, were used the normal control group. Four weeks after surgery, the mice were sacrificed. The myelinated axons of the removed regenerating nerve cable were counted. The L-5 dorsal root ganglions were also dissected to count sensory neurons. Data were statistically analyzed, which allowed us conclude that both neurokines were effective in causing axonal sprouting, but they could not prevent sensory neuron death in L-5 dorsal root ganglion.


ARTIGO ORIGINAL

Estudo experimental comparativo da ação das neurocinas cardiotrofina-1 e oncostatina-m na regeneração nervosa periférica

Sérgio Augusto M. da GamaI; Rames Mattar Jr.II; Ciro Ferreira da SilvaIII; Raquel Dias LainettiIV

IPós-graduando do IOT HC-FMUSP

IIChefe do grupo de Cirurgia da Mão do IOT HC-FMUSP

IIIProfessor Titular do Departamento de Histologia ICB-USP

IVPós-graduanda do ICB-USP

RESUMO

Os avanços das técnicas microcirúrgicas e o conhecimento detalhado do microambiente da regeneração podem contribuir significativamente na melhoria dos resultados das reparações nervosas periféricas. Nos últimos anos vários autores têm utilizado uma série de tecidos e substâncias interpostos entre os cotos de um nervo periférico seccionado, buscando estimular o crescimento axonal no local da lesão.

Através da técnica de tubulização, os autores estudam o efeito de duas neurocinas, a cardiotrofina-1 (CT-1) e a oncostatina-M (OsM), no crescimento axonal e na sobrevida dos neurônios sensitivos nos gânglios da raiz dorsal de L5, após a lesão de nervos ciáticos em camundongos C57BL/6J.

Utilizam 3 grupos de 7 animais que tiveram seus nervos seccionados e tubulizados com próteses de polietileno preenchidas com cardiotrofina-1, oncostatina-M e citocromo-C, associadas a um extrato de colágeno. Um quarto grupo de 3 animais, não operados, foi considerado por nós como grupo controle de normalidade.

Após 4 semanas da cirurgia, os camundongos foram sacrificados, e realizada a contagem das fibras mielínicas nos cabos de regeneração retirados. Os gânglios das raizes dorsais de L5 também foram dissecados possibilitando a contagem dos neurônios sensitivos.

Os dados foram analisados estatisticamente, permitindo concluir que as duas substâncias, utilizadas por nós, foram efetivas no estímulo ao brotamento axonal, porém, as mesmas não conseguiram impedir a morte dos neurônios sensitivos no gânglio da raiz dorsal de L5.

INTRODUÇÃO

Permanece um grande desafio para médicos e pesquisadores, melhorar os resultados funcionais obtidos com as reparações nervosas.

Os recentes avanços, nas técnicas e no instrumental cirúrgico, trouxeram progressos que mudaram consideravelmente o prognóstico das lesões de nervos periféricos nas últimas décadas. Porém, não é possível ainda obter-se resultados uniformemente bons, a ponto de restaurar, por completo, a função de um nervo lesionado.

Desde a utilização da técnica microcirúrgica para a reparação de nervos periféricos por SMITH (1964) tem-se procurado novos métodos, menos agressivos, que evitem a sutura, mesmo com fios e agulhas apropriadas para a microcirurgia.

A técnica de tubulização para a reparação nervosa periférica, que consiste em posicionar os cotos de um nervo seccionado dentro de um tubo, permite analisar a ação de substâncias exógenas estimuladoras da regeneração entre as extremidades de um nervo seccionado, com pouca manipulação dos cotos.

Talvez a melhor compreensão do processo fisiológico da regeneração nervosa, através do estudo detalhado do seu "microambiente" e, principalmente sua regulação bioquímica, poderá trazer novas perspectivas.

A utilização de algumas substâncias que interferem na regeneração nervosa foi descrita por uma série de autores (MADISON et al., 1988; FIELDS et al., 1989; BAILEY et al., 1993; MUNSON et al., 1997; HO et al., 1998; SANTOS et al., 1999) e alguns benefícios estão bem estabelecidos, apesar de ainda não haver referências sobre o seu uso na prática clínica.

Dentre as neurocinas, que são substâncias com cadeia proteica característica, a cardiotrofina-1 (CT-1) e a oncostatina-M (OsM), ainda não foram suficientemente testadas, quanto à sua ação no processo de regeneração nervosa.

Atuando como cirurgião de mão e realizando cirurgias reconstrutivas de nervos periféricos, sentimo-nos estimulados a estudar a degeneração e regeneração nervosa e, particularmente, analisar o efeito das neurocinas na facilitação da regeneração nervosa.

Pretendemos, com este trabalho, estudar as ações das neurocinas cardiotrofina-1 (CT-1) e oncostatina-M (OsM) na regeneração de nervos ciáticos de camundongos C57BL/6J, seccionados e imediatamente reparados pela técnica da tubulização.

MATERIAL E MÉTODO

1-Material

O trabalho foi realizado com camundongos da linhagem C57BL/6J, machos e com a idade de 8 semanas na época da cirurgia. Utilizamos 15 animais, divididos em 3 grupos experimentais, de acordo com a substância utilizada no interior da prótese tubular e 1 grupo com 3 animais não operados, considerado por nós como padrão de normalidade.

A CT-1 e a OsM humanas e liofilizadas, foram adquiridas da empresa Peprothec (EUA). Já o citocromo-c, substância utilizada como controle em estudos de fatores de crescimento, foi obtido da Sigma (EUA).

Todas as substâncias acima foram administradas em associação com um extrato de colágeno (Vitrogen, Collagen Corporation, Palo Alto, CA, EUA), que ao transformar-se na sua forma gel, em contato com a temperatura do corpo do animal, impede o escoamento das substâncias colocadas no interior das próteses tubulares.

Dividimos os 3 grupos de 5 animais operados da seguinte forma: o primeiro teve suas próteses preenchidas com solução de colágeno e CT-1, o segundo com solução de colágeno e citocromo-c, e o terceiro de colágeno e OsM.

2-Método

2a-Técnica Cirúrgica:

Os procedimentos cirúrgicos foram realizados com os animais sob anestesia geral com Avertin (500mg de tribromoetanol e 250mg de 2-metil-2-butanol, dissolvidos em 19,5 ml de água destilada) na dose de 0,02 ml/g de peso corporal intraperitoneal. Em seguida, eram tricotomizados na região de coxa esquerda e posicionados para a dissecção do nervo ciático. Sob visão microscópica (Zeiss OPM 240F), foi exposta a musculatura póstero lateral e o nervo ciático, através de incisão paralela ao fêmur (Fig. 1).


O nervo foi seccionado na região média da coxa, e os segmentos proximais e distais, após retrairem, foram fixados com um ponto único de sutura (monofilamento nylon 10-0 com agulha de 75mm, Ethicon) no interior de um tubo de polietileno de 6mm de comprimento, 0,76mm de diâmetro interno e 1,22mm de diâmetro externo. A distância deixada entre os cotos nervosos foi de 4mm (Fig. 2).


O preenchimento das próteses com as substâncias utilizadas, foi feito com o auxílio de uma micro seringa de Hamilton (10ml) e sob visão microscópica, para evitar a formação de bolhas de ar no interior das mesmas (Fig. 3).


As substâncias foram utilizadas à temperatura de aproximadamente 4ºC, ainda na forma líquida. Para evitarmos o extravasamento deste preparado, utilizamos vaselina na extremidade distal do tubo. Passados 20 minutos do implante, a solução introduzida sofria um processo de gelificação. A camada muscular foi suturada, e a pele fechada com grampos cirúrgicos de 7,5mm (Fig. 4).


2b - Pós-operatório:

Na sequência, os animais foram colocados em gaiolas individuais e mantidos em ciclo de 12 horas de claro-escuro durante todo período pós-operatório, e alimentação adequada.

2c - Eutanásia e perfusão:

Passadas 4 semanas, os animais foram anestesiados, procedeu-se a laparotomia através de incisão longitudinal com tesoura de iris e injetou-se 0,2 ml de uma solução de heparina (5000 UI/ml) no baço (Fig. 5).


2d- Análise histológica:

As próteses tubulares de polietileno com os segmentos nervosos regenerados, foram dissecadas e removidas, e colocadas na mesma solução fixadora a 4ºC durante 1 dia. O material foi então pós-fixado em solução de tetróxido de ósmio (2% em tampão de fosfato de sódio a 0,1 M e pH 7,3) durante 2 horas a 4º C, e desidratado através de uma série crescente de álcool etílico, clareado em óxido de propileno e incluído em resina Epoxy. Foram feitos cortes transversais com 1mm de espessura da parte média dos cabos regenerados, e corados com azul de toluidina 0,5%.

Após o período de perfusão, a coluna vertebral dos animais era aberta para a retirada do gânglio espinhal de L5 que, em seguida, foi processado para inclusão em historesina, cortados seriadamente a 5mm de espessura, corados com solução de azul de toluidina/fucsina. Através de um microscópio de luz (Zeiss) conectado a uma câmara clara, com aumento de objetiva de 25X, foram contados os corpos celulares dos neurônios sensitivos, presentes no gânglio de L5, e que apresentavam um nucléolo evidente. A contagem foi feita em 1 de cada 10 cortes da seriação.

As fibras mielínicas dos cabos regenerados, foram submetidas a uma análise quantitativa através de cortes semifinos de 1mm. Foi utilizado um microscópio de luz (Zeiss) conectado a uma câmara clara (Zeiss) e interligado a um microcomputador PC por um controlador de estágio. A interação com a imagem observada pelo operador foi feita através de uma mesa digitalizadora (Summagraphics) conectada ao microcomputador. Foi utilizado o programa CARP (Biographics Inc. EUA) baseado no sistema operacional UNIX.

Esta análise quantitativa seguiu as seguintes etapas: a) o sistema para análise das imagens foi calibrado de acordo com os diferentes aumentos das objetivas do microscópio; b) através de uma objetiva de baixo aumento, foram traçados os contornos dos cortes a serem estudados; c) o sistema dividia automaticamente os contornos em campos e armazenava na memória do computador; d) as fibras mielínicas foram marcadas pelo observador com o cursor da mesa digitalizadora através da câmara clara e da objetiva de 100X; e) era sinalizado pelo operador, o término da marcação de todas as fibras de um determinado campo; f) ao completar o último campo, o computador fornecia a somatória das fibras marcadas, seguida da plotagem das mesmas na tela do monitor. Esse sistema evitou a contagem dupla de fibras presentes no campo observado.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

A avaliação estatística dos dados quantitativos obtidos em cada uma das situações experimentais, foi realizada através do método de Newman-Keuls, com o auxílio do programa de computação "Primer of Biostatistics"(versão 1.0/ 1988).

O padrão de significância adotado foi de p<0,05.

RESULTADOS

DADOS QUALITATIVOS

Após 4 semanas do implante das próteses tubulares, evidenciou-se em todos os animais uma estrutura com coloração leitosa, denominada cabo de regeneração (CR), com diâmetro decrescente de proximal para distal entre os cotos nervosos.

Em toda extensão do CR observou-se uma rede de vasos sanguíneos. Um líquido amarelado preenchia o espaço entre a superfície externa do CR e a parede interna da prótese tubular.

Cortes transversais da porção média dos CR, observados à microscopia de luz, mostraram que os animais que tiveram as próteses preenchidas com colágeno e CT-1 ou OsM apresentavam um diâmetro maior dos CR que os animais implantados com colágeno e citocromo-C. Através dos mesmos cortes, os CR apresentavam grupos de axônios organizados em minifascículos, característica do processo de compartimentalização, típico da regeneração nervosa periférica. Estes minifascículos eram envoltos por seu próprio perineuro, e vários destes conjuntos unidos por um epineuro.

Nos cortes transversais dos nervos ciáticos de animais não operados, foi possível distinguir os seus quatro fascículos que vão formar os nervos tibial, fibular, sural e ramo cutâneo.

DADOS QUANTITATIVOS

Após 4 semanas da tubulização, contamos o número total de fibras mielinizadas dos CR dos 3 grupos de animais operados e dos nervos ciáticos dos 3 camundongos não operados, e os dados obtidos encontram-se na Tabela 1 e Gráfico 1.


Comparando os grupos estudados através da análise estatística pelo método de Newman-Keuls, obtivemos o seguinte resultados: o número de axônios mielínicos nos CR dos animais implantados com colágeno e OsM (2086±102) e colágeno e CT-1 (2040±56), foi significativamente maior (p<0,05) que nos grupos implantados com colágeno e citocromo-C (1449±102), e significativamente menor (p<0,05) que no grupo de animais não operados (3257±59) Gráfico 1.

Após 4 semanas, o número de corpos celulares de neurônios sensitivos no gânglio da raíz dorsal de L5 contados nos animais operados e não operados, pode ser visto na Tabela 2 e Gráfico 2.


A comparação entre os números de corpos celulares dos 4 grupos de animais, após a análise estatística, demonstrou não haver diferença significativa (p>0,05) entre o grupo de animais implantados com colágeno e CT-1 (634±29) e colágeno e OsM (694±4), e os que utilizamos colágeno e citocromo-C (657±18). Os três grupos apresentaram um número de corpos celulares significativamente menor (p<0,05) do que no grupo controle não operado (1141±64).

DISCUSSÃO

As alterações nas porções proximal e distal de um nervo seccionado foram muito estudadas nas últimas décadas.

Vários autores estudaram o brotamento axonal em fibras mielinizadas e a participação dos cones de crescimento neste processo (RAMON Y CAJAL, 1928; HOLMES; YOUNG, 1942; IDE, 1996; MANTHORPE et al., 1983; BIXBY et al. 1988).

As alterações proximais de um nervo periférico seccionado foram chamadas por muitos pesquisadores de "efeito retrógrado" ou "reação axonal", incluindo a cromatólise (NISSL, 1892 apud RAMON Y CAJAL, 1928; GRANT; ALDSKOGIUS, 1967; LIEBERMAN, 1971; SUNDERLAND, 1978; FIORI et al., 1988; KREUTZBERG, 1995). Ao mesmo tempo, observamos que ocorrem mudanças metabólicas que passam a favorecer a produção proteica voltada para a reestruturação celular, em detrimento à transmissão sináptica (LIEBERMAN, 1971; KREUTZBERG, 1995).

A reação de um neurônio à lesão do seu axônio pode variar de uma degeneração retrógrada até a morte celular (RAMON Y CAJAL, 1928; HYDÉN, 1960; LIEBERMAN 1971, 1974; KERR et al., 1972; FAWCETT; KEYNES, 1990; KREUTZBERG, 1995; GROVES, 1997)

Assim como na porção proximal do nervo seccionado, a parte distal também sofre alterações bem definidas. Foi WALLER (1850) apud GREEN (1988) o primeiro a relatar as alterações na porção distal de um nervo seccionado, descrevendo a degeneração granular da bainha de mielina e o desaparecimento dos axônios distais à lesão, ao que denominou-se "degeneração walleriana".(RAMON Y CAJAL, 1928; SUNDERLAND; BRADLEY, 1950).

Vários trabalhos contribuiram para o conhecimento detalhado das alterações na parte distal do nervo lesado. Destacam-se os relatos sobre a ação dos macrófagos, fagocitando a mielina fragmentada e axônios degenerados, promovendo a proliferação das células de Schwann, e produzindo citocinas importantes na regeneração nervosa (HOLMES; YOUNG, 1942; LUBINSKA, 1982; BEUCHE; FRIEDE, 1984; PERRY et al., 1987).

Achamos importante lembrar as descrições de SUNDERLAND (1978) e LUNDBORG (1987) sobre a formação do tubo endoneural, através do qual haverá o crescimento axonal.

Outro elemento indispensável na regeneração nervosa são as células de Schwann, produzidas no coto distal do nervo lesado estimuladas pela membrana axonal, fragmentos de mielina e macrófagos, sendo responsáveis por degradar e fagocitar a mielina e produzir fatores neurotróficos (SATINSKY et al., 1964; SALZER; BUNGE, 1980; HALL, 1986; HEUMANN et al., 1987; FAWCETT; KEYNES, 1990; SENDTNER et al., 1992; DE VRIES, 1993; REYNOLDS; WOOLF, 1993). As células de Schwann alongam-se e conectam-se longitudinalmente formando a imagem semelhante a um colar de pérolas, denominadas como "bandas de Büngner" (SUNDERLAND; BRADLEY, 1950; BUNGE, 1980), servindo como guia para fibras mielínicas e amielínicas alcançarem seus orgãos alvo (SON; THOMPSON, 1995).

Apesar das várias pesquisas sobre as alterações sofridas pelas extremidades de um nervo periférico seccionado, a regulação bioquímica deste processo ainda não foi totalmente esclarecida.

Diversos estudos constataram a dificuldade de regeneração nervosa após uma axotomia periférica, com diminuição do diâmetro da fibra regenerada, formação de uma bainha de mielina mais fina, e consequente diminuição da velocidade de condução (SCHRODER, 1972; FIELDS; ELLISMAN, 1986 a,b).

Embora descrita há muito tempo por RANSON (1909), concordamos com outros autores (ALDSKOGIUS et al., 1992; SUZUKI et al., 1993) que muitas dúvidas sobre a morte celular e suas causas permanecem sem resposta. Nossos achados coincidem com a literatura que, através da contagem de nucléolos de neurônios sensitivos, mostra uma perda celular que pode chegar a 25% nos gânglios das raizes dorsais lombares (YGGE; ALDSKOGIUS, 1984; RICH et al., 1989; HIMES; TESSLER, 1989; LISS et al. 1994).

O nosso grande desafio, e das outras pesquisas desenvolvidas nesta área, é estimular o brotamento axonal após uma secção nervosa e, ao mesmo tempo, prevenir a morte celular, obtendo assim uma melhor recuperação funcional, especialmente sensitiva.

Acreditamos haver fortes indícios de que a regeneração sensitiva é pior que a motora (GORDON; STEIN, 1982; SCHMALBRUCH, 1987; LAINETTI et al. 1995; SENDTNER et al., 1997; LJUNGBERG et al., 1999), apesar do trabalho discordante de MADORSKY et al. (1998). A explicação para este fato, é que após uma lesão nervosa periférica, ambos neurônios, motores e sensitivos, ficam privados dos fatores neurotróficos derivados dos orgãos alvo, dos quais depende a sobrevivência da célula nervosa. Porém, os motores produzem de imediato o seu fator específico, o CNTF, a partir das células de Schwann, e assim sobrevivem à lesão axonal (DOBREA et al., 1992). Já os sensitivos são mais suscetíveis à degeneração após a lesão, uma vez que a síntese dos seus fatores neurotróficos, por parte das células de Schwann (NGF e BDNF), é atrasada, não sendo capaz de impedir a morte dos neurônios sensitivos dependentes destes fatores (LAINETTI et al., 1995).

Assim sendo, direcionamos o nosso trabalho para a análise das alterações sofridas pelos neurônios sensitivos após uma secção, tentando através da adição de substâncias exógenas, a CT-1 e a OsM, estimular a regeneração axonal e prevenir a morte neuronal nos gânglios das raízes dorsais.

Concordamos com FUNAKOSHI et al.(1998), quando afirmam que uma das maiores dificuldades no estudo da regeneração nervosa é a necessidade trófica complexa por parte dos neurônios tanto sensitivos quanto motores, dificilmente suprida por um único fator neurotrófico.

Desde o primeiro relato de uma microcirurgia de nervos periféricos (SMITH, 1964), os avanços técnicos e de materiais das últimas décadas vêm possibilitando reparações cada vez menos agressivas aos cotos nervosos. Com esta evolução, aperfeiçoou-se a técnica de tubulização nervosa, escolhida por nós, pois além de pouco traumática, permite o crescimento das fibras nervosas, impede a invasão de tecido cicatricial vizinho, e facilita o estudo da morfologia, bioquímica e fisiologia do microambiente entre os cotos nervosos após a administração de substâncias exógenas ou interposição de diferentes materiais (DA SILVA, 1987; FIELDS et al., 1989; LANGONE, 1991; PIRES, 1994; LAINETTI, 1995), o que ao nosso ver pode ser essencial na melhoria dos resultados após reparações de nervos periféricos.

As primeiras referências às lesões nervosas tubulizadas, vêm do século passado e inúmeros modelos experimentais se sucederam, buscando materiais inertes, flexíveis, bioabsorvíveis, que não provocassem fibrose, isquemia, inflamação ou colabassem, permitindo o acúmulo de fatores de crescimento no local (FIELDS et al. 1989).

Assim como outros autores (GARRITY, 1955; DA SILVA; LANGONE, 1989; LANGONE, 1991; MARQUES, 1992; PEREIRA, 1993, 1998), escolhemos os tubos de polietileno, em função da disponibilidade destas próteses em nosso laboratório.

O efeito de substâncias exógenas administradas sobre o local de uma lesão nervosa, ou de materiais colocados entre os cotos nervosos, vêm chamando a atenção de pesquisadores há algum tempo, como elementos facilitadores da regeneração (CHIU et al., 1982; RICH et al., 1987; MADISON et al., 1988; FIELDS et al., 1989; BAILEY et al., 1993; ANSSELIN et al., 1997; FRANCEL et al., 1997; KAKINOKI et al., 1997; MUNSON et al., 1997; DI BENEDETTO, 1998).

Utilizamos em nosso trabalho duas neurocinas, a cardiotrofina-1 (CT-1) e a OsM. Elas se caracterizam por possuirem uma estrutura molecular semelhante, uma unidade receptora comum (gp 130), e serem encontradas em maior quantidade no sistema nervoso periférico que central (MOSLEY et al., 1996). Também fazem parte deste grupo, CNTF, LIF, GPA e as interleucinas 6 e 11 (IL-6/IL11) (HOPKINS; ROTHWELL, 1995). Nos chamou a atenção que em estudos prévios (ADLER et al., 1979; GEARING et al., 1987; YAMAMORI et al., 1989; RICHARDSON, 1994; PEREIRA, 1998; THOMPSON; MAJITHIA, 1998) o CNTF e o LIF estimularam a regeneração nervosa após a sua administração sobre a lesão de nervos ciáticos de camundongos adultos.

Desde a sua identificação (PENNICA et al., 1995), têm-se descrito várias ações da CT-1 sobre o sistema hematopoiético, fígado, rins ou na indução da hipertrofia de miócitos cardíacos in vitro (JIN et al., 1996; PENNICA et al., 1996). Porém, não encontramos nenhuma referência na literatura a respeito de sua ação em lesões de nervos periféricos (SENDTNER et al., 1997). Trabalho recente provou que esta substância está envolvida na regulação da sobrevivência de neurônios sensitivos em ratos recém nascidos, apenas sugerindo que a mesma possa tornar-se importante aliada contra a degeneração pós-traumática (HORTON et al., 1998; THIER et al., 1999).

A primeira publicação sobre a OsM deve-se a ZARLING et al. (1986), que a isolaram a partir de uma cultura de células de linfoma histiocítico, caracterizando-se por inibir a divisão de células de melanoma e outras células tumorais humanas. MALIK e colaboradores em 1989, reconheceram a OsM como uma citocina reguladora do crescimento de várias culturas de células de mamíferos.

Não encontramos nenhuma referência na literatura compulsada sobre a ação da CT-1 e da OsM no processo de regeneração nervosa periférica.

Tais substâncias seriam produzidas em "orgãos alvo" e liberadas por via retrógrada, através das células neuronais, promovendo a regeneração após uma axotomia (PURVES, 1986; PATTERSON; NAWA, 1992; THOMPSON et al., 1997).

Escolhemos o camundongo da linhagem C57BL/6J como o animal de experimentação, pois é de fácil manipulação, disponível no laboratório do Instituto de Ciências Biomédicas, e que pelo seu pequeno porte (30g), permite um gasto menor de material. Pesquisas mostraram que nestes animais, após uma lesão periférica, a regeneração das fibras nervosas está diminuída, principalmente das sensitivas, , o que os torna ideais para o estudo do efeito de substâncias exógenas sobre a área de secção do nervo (LAINETTI et al.,1995).

Somente um dos membros foi operado pois observamos previamente, que animais submetidos a denervação bilateral, tem grande dificuldade de locomoção, impedindo-o de alimentar-se adequadamente, o que pode levar a auto-fagia das patas denervadas, com consequente infecção e morte do animal.

Colocamos, entre os cotos nervosos, uma solução de colágeno misturada à CT-1 ou à OsM, líquida às baixas temperaturas, e que se gelifica à temperatura corporal do animal, o que previne o escoamento destas substâncias para fora do tubo. Uma pequena quantidade de vaselina foi colocada na parte proximal do tubo para impedir o extravasamento desta solução enquanto a mesma não se gelifica. O grupo controle recebeu junto com a solução de colágeno, o citocromo-C, substância com mesmo peso molecular das neurotrofinas, porém, sem atividade neurotrófica.

Os camundongos dos nossos grupos, foram colocados por nós em gaiolas individuais e mantidos em ciclo de 12 horas de claro-escuro, durante todo período pós-operatório, evitando assim alterações hormonais que pudessem influenciar o resultado final.

Apesar de estudos discordantes (KIYOTANI et al., 1996; SUZUKI et al, 1999), baseamo-nos em um grande número de trabalhos que estudaram o crescimento axonal através de tubos vazios e que concluiram que a distância de 10mm era o limite superior para se obter uma regeneração adequada (BRUNELLI et al., 1994; DEN DUNNEN et al. 1996; FRANCEL et al., 1997). A utilização de substâncias exógenas dentro dos tubos, permitiu a regeneração nervosa em distâncias que chegaram a 25mm (MADISON et al., 1988; BAILEY et al., 1993; ANSSELIN et al., 1997; KAKINOKI et al., 1997; DI BENEDETTO, 1998; HO et al., 1998), provando que a manipulação do microambiente pode estimular a regeneração. Portanto, nos pareceu adequada a distância de 4mm entre os cotos nervosos como nosso padrão, já que trata-se de um espaço que pode ser atravessado com facilidade por axônios em regeneração.

Realizamos a eutanásia após 4 semanas, ao nosso ver, tempo suficiente para que observassemos no pós-operatório, a presença de uma estrutura cilíndrica, vascularizada, unindo o coto proximal ao distal, à qual denominamos de cabo de regeneração (CR). Assim como descrito em outros trabalhos, também verificamos entre o cabo de regeneração e a parede do tubo, um espaço preenchido por fluído semelhante ao plasma sanguíneo ( LUNDBORG et al. 1982; WILLIAMS et al. 1983; DA-SILVA, 1987; LANGONE, 1991).

O gânglio dorsal escolhido por nós foi o da raiz de L5, pois é o que mais contribui na formação do nervo ciático (SWETT et al., 1991).

Na análise histológica dos CR e dos gânglios de L5, utilizamos metodologia descrita por TOME; MIRA (1981), que consiste na fixação do material em glutaraldeído e tetraóxido de ósmio a 2%, seguida de inclusão em resina epoxy. Em seguida as lâminas são preparadas com cortes de 2m de espessura, e coradas com azul de metileno, e observadas ao microscópio.

Após 4 semanas do implante do tubo, todos os animais por nós operados apresentavam CR.

Nos animais onde utilizamos a CT-1 e a OsM, observamos cabos de regeneração de maior diâmetro, e com uma quantidade significativamente maior de axônios mielínicos que nos grupos em que as próteses foram preenchidas com citocromo-c, evidenciando o estímulo destas duas substâncias sobre o brotamento axônico.

Analisando o número de neurônios sensitivos nas raízes dorsais de L5, verificamos que nos grupos que utilizaram as neurocinas foi estatisticamente menor que no grupo controle não operado, e sem diferença significativa em relação ao grupo em que os tubos foram preenchidos com citocromo-c. Acreditamos que estes resultados confirmam a baixa eficácia da CT-1 e da OsM na sobrevivência dos neurônios sensitivos.

A nossa expectativa a partir deste trabalho, é que possamos utilizar a tubulização com o objetivo de diminuir a agressão das suturas nos cotos nervosos, e ao mesmo tempo administrar substâncias exógenas no local da reparação do nervo seccionado em seres humanos. Este procedimento poderá melhorar o prognóstico destas lesões e permitir a reparação de perdas segmentares sem a necessidade de enxertos. É provável que o futuro das reparações de nervo perifério basei-se na compreensão dos fenômenos bioquímicos que regulam a sobrevida da célula e o processo de regeneração nervosa. Várias substâncias , como as neurocinas, participam desta regulação. O estudo dos mecanismos fisiológicos é fundamental para o avanço científico desta área. Ao identificar as respostas obtidas com o uso da CT-1 e OsM no tratamento dos nervos periféricos lesados, estamos contribuindo na recuperação de pacientes vítimas deste tipo de lesão.

CONCLUSÕES

1. A administração local das neurocinas cardiotrofina-1 e oncostatina-M favorece a regeneração nervosa periférica, expressa em número de fibras mielinizadas presentes no cabo de regeneração de nervos ciáticos de camundongos, submetidos a lesão e reconstrução pela técnica de tubulização.

2. A administração de cardiotrofina-1 e oncostatina-M sobre lesões de nervos periféricos, não impede a morte de neurônios sensitivos axotomizados.

Trabalho realizado no IOT do HC-FMUSP e no ICB da USP.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    22 Maio 2007
  • Data do Fascículo
    Jun 2000
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