Seleção de matéria prima para a elaboração de meio de cultura para produção de Bacillus thuringiensis var. kurstaki Berliner

Selection of agroindustrial by-products as components of media used for production of Bacillus thuringiensis var. kurstaki Berliner

Insecta; entomopathogen; bacteria; culture techniques

COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA

Seleção de matéria prima para a elaboração de meio de cultura para produção de Bacillus thuringiensis var. kurstaki Berliner

Selection of agroindustrial by-products as components of media used for production of Bacillus thuringiensis var. kurstaki Berliner

Luis F. A. Alves^I; Sérgio B. Alves^I; Deise M. F. Capalbo^II

^IDepartamento de Entomologia, ESALQ/USP, Caixa postal 9, 13418-900, Piracicaba, SP

^IIEMBRAPA/CNPMA, Caixa postal 69, 13820-000, Jaguariúna, SP

ABSTRACT

The spore production "in vitro" of 43 combinations of agroindustrial by-products (cheese whey, silkworm flour, soybean protein and foder yeast) was evaluated. All media tested showed to be suitable for Bacillus thuringiensis var. kurstaki Berliner production and the concentration of spores obtained in these media varied from 10⁶ to 10⁹ spores/ml.

Key words: Insecta, entomopathogen, bacteria, culture techniques.

Embora os primeiros isolados de Bacillus thuringiensis Berliner tenham sido obtidos no início deste século, somente no final da década de 30 e ao longo dos anos 40, é que este patógeno despertou o interesse como agente de controle microbiano (Lambert & Peferoen 1992, Cannon 1993). O uso de um agente entomopatogênico como bioinseticida exige sua produção em grande escala. Assim, Salama et al. (1983) e Capalbo et al. (1991) consideram o meio de cultura importante no custo de produção e sugerem a introdução de resíduos e subprodutos agroindustriais regionais na sua elaboração. Tem sido comum o uso de meios alternativos e a regionalização da produção, de acordo com os insetos-pragas ou vetores de doenças endêmicas, usando fermentadores pequenos (no máximo 200 litros). Tal estratégia permite controlar melhor a qualidade do produto, evitando-se degradação devido ao transporte (Foda et al. 1993, Pantuwatana et al. 1993). Neste contexto, o trabalho foi desenvolvido, visando determinar o potencial de utilização de subprodutos e resíduos agroindustriais disponíveis na região Sudeste do Brasil, na composição de meios de cultura para a produção de B. thuringiensis var. kurstaki, por meio de fermentação líquida descontínua.

Os estudos foram conduzidos na Seção de Controle Biológico das Pragas (Instituto Biológico de São Paulo) e no Setor de Patologia de Insetos do Departamento de Entomologia (ESALQ/USP), sendo que a bactéria utilizada foi isolada do produto comercial Dipel PM e mantida em tubos com meio de cultura a 8 ± 2°C. Foram elaborados 43 meios, sendo 42 considerados alternativos e 1 padrão (Caldo Nutriente + extrato de levedura), divididos em quatro grupos de acordo com a base de composição: levedura de cana, soro de leite bovino, proteína de soja e farinha de pupas de bicho-da-seda (Bombyx mori L.). Em todos os meios acrescentaram-se CaCO₃ e MnSO₄.H₂O, além de se corrigir o pH para 7,4. Em seguida, 50 ml de cada um dos meios foram transferidos para frascos (250 ml) autoclavados a 120°C e 1 atm, e inoculados com 1 ml de cultura de B. thuringiensis var. kurstaki pré-fermentada por 24 horas. Para cada meio foram preparados 5 frascos, sendo individualmente considerados como repetições. Após a inoculação, os frascos foram incubados em uma câmara agitadora-incubadora a 30 ± 1°C e 120 rpm, durante 48 horas. A análise da produção foi realizada tomando-se 2 ml de cada frasco, submetidos ao choque térmico (10 minutos em água a 80°C) e, em seguida, em gelo (5 minutos), para eliminar as células vegetativas e facilitar a observação. Procederam-se diluições em água destilada + espalhante adesivo (Tween 80) a 1% e contagem de esporos em câmara de Petroff-Hausser, sob microscópio óptico de contraste de fase. Os meios mostraram-se adequados ao crescimento e esporulação de B. thuringiensis var. kurstaki, sendo observadas, porém concentrações variando na ordem de 10⁶ a 10⁹ esporos/ml (Tabela 1). A produção das 42 combinações elaboradas mostrou-se numericamente superior à concentração de esporos obtida no meio CNY (padrão). Como em todos os experimentos foram utilizados o mesmo isolado e as mesmas condições de incubação, a variação observada na concentração de esporos pode ser efeito da composição nutricional sobre o metabolismo das células bacterianas. Tal como o observado, Dulmage (1970) e Hertlein (1981) obtiveram resultados semelhantes, obtendo tanto formulações de meios que foram apropriadas para o crescimento e também para a esporulação de B. thuringiensis, como outras que foram apenas suficientes para um pequeno aumento na concentração do patógeno no meio.

Verificou-se, também, que na maioria dos meios formulados, a produção foi de 10⁶ a 10⁷ esporos/ml, exceto para a proteína de soja, cujas combinações proporcionaram, em sua totalidade, concentrações da ordem de 10⁸ esporos/ml. Ressalta-se que as formulações baseadas em farinha de pupa proporcionaram produção com valores entre 10⁷ e 10⁸, acima da maioria dos meios testados.

As maiores produções (10⁹ esporos/ml), foram alcançadas nos meios compostos por farinha de pupas e soro de leite. Salama et al. (1983) testaram o potencial de diversas matérias primas como meio de cultura e também concluíram pela superioridade do soro de leite, principalmente quando complementado com levedura de cana-de-açúcar.

De forma geral, as formulações foram adequadas para a produção massal de B. thuringiensis var. kurstaki, pois além de terem permitido seu crescimento e esporulação, são subprodutos agroindustriais, de baixo custo e de fácil aquisição no mercado. Entretanto, a contagem de esporos não deve ser usada como parâmetro único da adequabilidade do meio, pois outros estudos (p.ex., Hertlein et al. 1981, Smith 1982, Perez & Gonzalez 1984) indicaram que meios com alta produção de esporos apresentaram baixa toxicidade para insetos. Por outro lado, Scherrer et al. (1973) e Avignone-Rossa & Mignone (1993) observaram relação direta entre produção de esporos elevada e toxidez do complexo esporo-cristal obtido. Sendo assim, esta avaliação inicial deve ser complementada com outros experimentos que venham a fornecer informações complementares às aqui obtidas.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Dr. Antonio Batista Filho e ao Instituto Biológico que, através da Seção de Controle Biológico das Pragas, e especialmente a dedicação de seus funcionários, prestou indispensável apoio para a condução deste trabalho.

Literatura Citada

Recebido em 13/02/96. Aceito em 21/05/97.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Out 2006
• Data do Fascículo
  Ago 1997

Histórico

• Aceito
  21 Maio 1997
• Recebido
  13 Fev 1996