Foi investigada a optimização de componentes criticos do meio de cultivo para a produção de exoinulinase por Kluyveromyces marxianus YS-1 em frascos agitados utilizando a metodologia de superficie de resposta (RSM), com base em um delineamento composto central rotativo. As variáveis independentes, com cinco niveis, foram as concentrações de inulina, de extrato de carne, de cloreto de cálcio e de dodecil sulfato de sódio, bem como o pH do meio de cultivo. Os valores ótimos, obtidos pela RSM, foram com 2% de inulina, 2.17% de extrato de carne, 0.65 mM de cloreto de cálcio, 0.10 mM de dodecil sulfato de sódio e pH 5.5. As estimativas de produção de exoinulinase e de rendimento em biomassa no meio otimizado foram de 63.61 UI/ml e de 9.65 (em termos de OD600/10), respectivamente. Os coeficientes de correlação múltipla R foram de 0.9976 e 0.9605 para produção de exoinulinase e biomassa, respectivamente, e, sendo próximos de um, indicam uma excelente correlação entre os valores estimados e experimentais. A máxima productividade de exoinulinase (64.05 UI/ml) obtida experimentalmente por RSM foi mais que o dobro em comparação com nossos resultados anteriores utilizando uma técnica de otimização clássica de uma variável por vez.