Estudo de mutações no gene GJB2 e deleção delGJB6-D13S1830 em indivíduos com surdez não sindrômica da região Amazônica

Luciana Santos Serrão de Castro Anderson Nonato do Rosario Marinho Elzemar Martins Ribeiro Rodrigues Giorgio Christie Tavares Marques Tarcísio André Amorim de Carvalho Luiz Carlos Santana da Silva Sidney Emanuel Batista dos Santos Sobre os autores

Resumos

A deficiência auditiva afeta cerca de 1 em cada 1000 recém-nascidos. Mutações no gene da conexina 26 (GJB2) são as causas mais frequentes de surdez não sindrômica em diferentes populações e é sabido que a mutação delGJB6-D13S1830 em DFNB30 é causadora de surdez neurossensorial. Muitos estudos descrevem o envolvimento de mutações no gene GJB2 com a deficiência auditiva em diferentes populações. Entretanto, existe pouca informação sobre a surdez genética no Brasil, especialmente na região Amazônica. OBJETIVO: Determinar a prevalência de mutações no gene GJB2 e da mutação delGJB6-D13S1830 em 77 casos esporádicos de surdez não sindrômicas. MÉTODO: A região codificante do gene GJB2 foi sequenciada e a PCR foi realizada para detectar a mutação delGJB6-D13S1830. RESULTADOS: O alelo 35delG foi encontrado em 9% dos pacientes (7/77). As mutações M34T e V95M foram detectadas em dois distintos pacientes heterozigotos. A mutação não patogênica V27I foi detectada em 28,6% (22/77). Não foi detectada a mutação delGJB6-D13S1830 em nenhum paciente estudado. CONCLUSÃO: Alelos mutantes no gene GJB2 foram observados em 40% (31/77) da amostra. Variantes patogênicas foram detectadas em apenas 12% (9/77). Mais estudos são necessários para elucidar causas genéticas de deficiência auditiva em populações miscigenadas.

aconselhamento genético; conexinas; surdez


Hearing impairment affects about 1 in 1000 newborns. Mutations in the connexin 26 (GJB2) gene rank among the most frequent causes of non-syndromic deafness in different populations, while delGJB6-D13S1830 mutation located in the DFNB30 locus is known to cause sensorineural hearing loss. Despite the many studies on the involvement of GJB2 mutations in hearing impairment in different populations, there is little information on genetic deafness in Brazil, especially in the Amazon region. OBJECTIVE: To determine the prevalence of GJB2 mutations and delGJB6-D13S1830 in 77 sporadic non-syndromic deaf patients. METHOD: The coding region of the GJB2 gene was sequenced and polymerase chain reaction was performed to detect the delGJB6-D13S1830 mutation. RESULTS: Mutant allele 35delG was found in 9% of the patients (7/77). Mutations M34T and V95M were detected in two distinct heterozygous patients. Non-pathogenic mutation V27I was detected in 28.6% of the patients (22/77). None of the deaf patients carried the delGJB6-D13S1830 mutation. CONCLUSION: Mutant alleles on gene GJB2 were observed in 40% (31/77) of the subjects in the sample. Pathogenic variants were detected in only 12% (9/77) of the individuals. More studies are required to elucidate the genetic causes of hearing loss in miscegenated populations.

connexins; deafness; genetic counseling


ORIGINAL ARTICLE

Estudo de mutações no gene GJB2 e deleção delGJB6-D13S1830 em indivíduos com surdez não sindrômica da região Amazônica

Luciana Santos Serrão de CastroI; Anderson Nonato do Rosario MarinhoII; Elzemar Martins Ribeiro RodriguesI; Giorgio Christie Tavares MarquesIII; Tarcísio André Amorim de CarvalhoIV; Luiz Carlos Santana da SilvaV; Sidney Emanuel Batista dos SantosVI

IDoutorado em Genética e Biologia Molecular (Pesquisadora)

IIDoutorado em Genética e Biologia Molecular (Pesquisador)

IIIGraduação em Biomedicina

IVMestrado em Genética e Biologia Molecular (Pesquisador)

VDoutorado (Professor Associado I - Instituto Ciencias Biológicas - Universidade Federal do Pará)

VIDoutorado (Professor Associado III - Instituto Ciencias Biológicas - Universidade Federal do Pará). Instituto de Ciências Biológicas - Universidade Federal do Pará

Endereço para correspondência

RESUMO

A deficiência auditiva afeta cerca de 1 em cada 1000 recém-nascidos. Mutações no gene da conexina 26 (GJB2) são as causas mais frequentes de surdez não sindrômica em diferentes populações e é sabido que a mutação delGJB6-D13S1830 em DFNB30 é causadora de surdez neurossensorial. Muitos estudos descrevem o envolvimento de mutações no gene GJB2 com a deficiência auditiva em diferentes populações. Entretanto, existe pouca informação sobre a surdez genética no Brasil, especialmente na região Amazônica.

OBJETIVO: Determinar a prevalência de mutações no gene GJB2 e da mutação delGJB6-D13S1830 em 77 casos esporádicos de surdez não sindrômicas.

MÉTODO: A região codificante do gene GJB2 foi sequenciada e a PCR foi realizada para detectar a mutação delGJB6-D13S1830.

RESULTADOS: O alelo 35delG foi encontrado em 9% dos pacientes (7/77). As mutações M34T e V95M foram detectadas em dois distintos pacientes heterozigotos. A mutação não patogênica V27I foi detectada em 28,6% (22/77). Não foi detectada a mutação delGJB6-D13S1830 em nenhum paciente estudado.

CONCLUSÃO: Alelos mutantes no gene GJB2 foram observados em 40% (31/77) da amostra. Variantes patogênicas foram detectadas em apenas 12% (9/77). Mais estudos são necessários para elucidar causas genéticas de deficiência auditiva em populações miscigenadas.

Palavras-chave: aconselhamento genético; conexinas; surdez.

INTRODUÇÃO

A surdez afeta aproximadamente um em cada mil nascidos1. A perda auditiva pode estar relacionada a causas genéticas, ambientais ou a uma combinação de ambas. Em países desenvolvidos, cerca de 60% de todos os casos têm origem genética2. Estima-se que 30% dos casos de surdez genética sejam sindrômicos e 70% não sindrômicos3. No Brasil, a frequência de surdez congênita não sindrômica é de cerca de quatro em cada mil nascimentos, 16% dos quais com etiologia genética4. Dentre as manifestações de surdez hereditária não sindrômica, as formas autossômicas recessivas (DFNB) compõem cerca de 75-80% dos casos, as autossômicas dominantes (DFNA) cerca de 20%, as formas ligadas ao X (DFN) de 2-5% e as formas mitocondriais cerca de 1%5. Atualmente, estima-se que mais de 120 diferentes loci estejam envolvidos na surdez e 70 genes já foram identificados e caracterizados6.

O locus GJB2 foi descrito como a principal causa de perda auditiva neurossensorial não sindrômica autossômica recessiva3,7,8. Mutações do gene GJB2 foram associadas a 50% dos casos de perda auditiva não sindrômica autossômica recessiva em muitas populações9,10. Mais de 101 diferentes mutações no gene da conexina 26 foram associadas à deficiência auditiva11. A prevalência de algumas mutações do GJB2 difere consideravelmente entre grupos étnicos. A mutação 35delG é a variante mais comum em populações européias12,13. A frequência do alelo 35delG varia entre 0,97% e 2,24% na região Sudeste do Brasil14,15. No estado de São Paulo, a mutação 35delG foi a mais frequente (12,4%)16; ela foi encontrada em 23% de casos em uma mesma família e 6,2% em casos isolados. A mutação 235delC é geralmente predominante em populações asiáticas17-21, enquanto a mutação 167delT é encontrada com mais frequência em populações de judeus Ashkenazi22-24.

Sabe-se que as mutações do gene GJB6 são uma causa comum de surdez25. A deleção de 243Kb chamada mutação delGJB6-D13S1830 no gene GJB6 é a segunda mais frequente causa genética de surdez pré-lingual não sindrômica na população espanhola26. Ela também já foi descrita em judeus Ashkenazi27 e pacientes franceses com perda auditiva não sindrômica28.

Alguns estudos descreveram a frequência genética das mutações do GJB2 e da mutação delGJB6-D13S1830 associada à surdez não sindrômica em populações brasileiras12,16,29-31. As populações do Norte brasileiro são compostas por uma grande mistura de etnias com a adição de contribuição genética europeia32. Não há dados anteriores disponíveis sobre as variantes alélicas do GJB2 ou a frequência da mutação delGJB6-D13S1830 na região Amazônica. De modo a estabelecer a prevalência das mutações do GJB2 em pacientes com surdez da região, investigamos 77 casos isolados de surdez pré-lingual não sindrômica. Além disso, investigamos a prevalência da deleção delGJB6-D13S1830.

MÉTODO

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário João de Barros Barreto (protocolo nº 2241/05).

Participantes e avaliação clínica

O estudo foi conduzido com 77 crianças com perda auditiva pré-lingual não sindrômica. Os pacientes incluídos no estudo não tinham qualquer grau de parentesco e representavam casos isolados de surdez. Amostras foram obtidas na Escola para Surdos de Belém, no estado do Pará. Pacientes sindrômicos não foram incluídos no estudo. Todas as 77 crianças tinham deficiência auditiva de grave a profunda. Foi obtido o prontuário médico de cada criança e questionários foram ministrados para garantir que a perda auditiva não tivesse causas ambientais: infecção materno-fetal, complicações pré e perinatais, meningite, caxumba, uso prolongado de antibióticos/medicamentos ototóxicos ou trauma acústico. Todas as crianças foram submetidas à otoscopia, exames audiovestibulares, audiometria e exame geral, incluindo avaliação sistemática de formas sindrômicas de surdez. Os pais de todas as crianças assinaram termo de consentimento informado.

Análise molecular

O DNA foi extraído de sangue completo anticoagulado com EDTA usando o método fenol-clorofórmio-etanol. Para identificar as mutações do GJB2, um fragmento de DNA contendo toda a região codificadora foi amplificado usando o par de primers por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e dois primers internos foram utilizados no sequenciamento do DNA da Cx26: GJB2-1F (5´-GTGTTGTGTGCATTCGTCTTTTC-3') primer na direção forward para PCR e sequenciamento; GJB2-2R (5´-CCT-CATCCCTCTCATGCTGTCTA-3') primer na direção reverse para PCR e sequenciamento; GJB2-4F (5´-GGAAGTTCA-TCAAGGGGGAGATA-3') primer para sequenciamento interno na direção forward e GJB2-3R (5´-ACCTTCTGGGT-TTTGATCTCC TC-3') primer para sequenciamento interno na direção reversa.

As condições do PCR foram 35 ciclos com desnaturação a 94ºC por 1 min, anelamento a 60ºC por 1 min e extensão a 72ºC por 1 min. Em todos os casos da análise do gene GJB2, foi executado sequenciamento bidirecional do DNA e em alguns casos primers internos foram usados para confirmar o resultado. O sequenciamento foi feito com um ABI Prism Big-Dye Terminator Cycle Sequencing KitTM(Applied Biosystems) e a eletroforese com um ABI Prism 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). A amplificação do PCR da mutação delGJB6-D13S1830 foi feita com os primers e segundo as condições anteriormente descritas26.

RESULTADOS

Os resultados encontram-se resumidos na Tabela 1. A análise da região codificadora completa do gene GJB2 das 77 crianças com perda auditiva revelou quatro diferentes mutações já descritas: 35delG, M34T, V95M e V27I. Variantes alélicas no gene GJB2 foram encontradas em 40% dos casos (31 de 77 pacientes). A mutação mais comum foi V27I, detectada em 22 pacientes: vinte indivíduos eram heterozigotos e dois eram homozigotos. Contudo, a mutação V27I já foi descrita como um polimorfismo sem efeitos patológicos não relacionado à perda auditiva17. Mutações patogênicas foram observadas em 12% dos pacientes. A mutação 35delG foi detectada em sete (9%) pacientes: um era homozigoto e seis eram heterozigotos, nos quais a segunda mutação do GJB2 não foi encontrada. A mutação 35delG foi vista em oito dos dez alelos do GJB2 com mutação patogênica. Duas outras mutações missense foram observadas, V95M e M34T, em dois pacientes heterozigotos distintos com o segundo alelo normal. Além disso, a triagem para a mutação del(GJB6-D13S1830) foi negativa para os 77 pacientes.

DISCUSSÃO

O presente estudo é o primeiro a descrever a prevalência das variantes dos genes GJB2 e GJB6 na população amazônica. Vários estudos demonstraram que a mutação 35delG está presente em vários grupos étnicos e geográficos, e que representa até 80% das mutações do gene GJB233. Um estudo anterior descreveu incidência de 2,1% de mutação 35delG na região Norte do Brasil34. Apesar de nosso trabalho ter se baseado num pequeno número de pacientes, seus resultados podem confirmar a importância das mutações do GJB2 na etiologia da perda auditiva em Belém - PA. O presente estudo mostrou que a mutação 35delG é o mais comum alelo patogênico do GJB2. O alelo mutante 35delG foi encontrado em 9% dos pacientes, um achado concordante com estudos feitos anteriormente sobre a população brasileira29,30,35. A relevância patológica da mutação M34T tem sido debatida. Ela foi inicialmente associada à perda auditiva em DFNA38. Entretanto, tal mutação foi descrita por vários autores como sendo polimorfismo, mutação recessiva causal, ou mutação dominante8,36-40. Em um estudo populacional feito no Reino Unido, a M34T se manteve em conformidade com sua classificação como mutação que causa perda auditiva leve/moderada em homozigose ou heterozigose composta. Este achado acrescenta mais evidências de que a M34T é uma variante suave porém funcional com efeito maior no grupo 35delG41. Outro estudo feito na população finlandesa corroborou a hipótese de que a M34T é uma mutação patogênica que exibe um padrão autossômico recessivo de herança associado à perda auditiva neurossensorial não sindrômica suave a moderada em situação de homozigose42.

A mutação M34T foi descrita na população sul-americana43 e brasileira16. A mutação V95M foi observada em apenas um paciente heterozigoto. A mutação missense converte o aminoácido valina em metionina no códon 95. A valina é invariante nessa posição em todos os genes alfa e beta da conexina conhecidos28. A mutação V95M foi descrita como muito mais rara44. Ela já foi relatada em um paciente heterozigoto composto com perda auditiva não sindrômica em uma população do sudeste brasileiro29. De todas as mutações do GJB2 detectadas em nosso estudo, a V27I é a mais frequente. Esta mutação é considerada um polimorfismo e uma alteração não-patológica relacionada à perda auditiva17,22. Ela é raramente observada na população norte-americana22. Contudo, trata-se de uma mutação frequente em populações asiáticas, como a chinesa45; japonesa17; coreana46 e em populações de descendência asiática47. Em um estudo anterior feito com pacientes brasileiros, a mutação V27I foi identificada em dois indivíduos heterozigotos sem parentesco de um grupo de 26 casos esporádicos29.

Dada a elevada prevalência da mutação V27I, consideramos a hipótese da mutação ter resultado da contribuição aumentada dos genes ameríndios das populações do norte brasileiro32. Para abordar esta questão, investigamos a frequência da mutação V27I em uma amostra composta por 400 indivíduos da população de Belém. Os resultados (dados não publicados) demonstraram que a frequência da mutação V27I entre indivíduos com boa audição da população de Belém é alta (12,4%) e semelhante à frequência desta mutação nos pacientes surdos investigados (15,5%). Tais frequências são semelhantes àquelas descritas na China45 e mais elevadas que as da população europeia. Assim, as populações ameríndias provavelmente são a fonte original da mutação V27I na amostra da pesquisa.

A mutação delGJB6-D13S1830 é a segunda mais frequente causa genética de perda auditiva pré-lingual não sindrômica na população espanhola. Foi sugerido um padrão digenético de herança envolvendo mutações do GJB2 e a mutação delGJB6-D13S1830 do gene GJB626. O alelo del(GJB6-D13S1830) também foi identificado em 7,1% dos pacientes com surdez brasileiros26. Em outro estudo, a mutação del(GJB6-D13S1830) foi observada em apenas um paciente heterozigoto composto (35delG/del(GJB6-D13S1830) do Sudeste brasileiro30. No presente trabalho, a triagem dos 77 pacientes não revelou esta mutação e nossos resultados não permitem a atribuição de risco de perda auditiva à mutação del(GJB6-D13S1830) em nossa população.

CONCLUSÃO

Alelos mutantes do GJB2 foram observados em 40% (31/77) dos pacientes surdos amazônicos. Entretanto, variantes patogênicas (35delG, M34T e V95M) -- conhecidas por sua ação recessiva -- foram detectadas em 12% (9/77) da coorte. Dentre os nove pacientes com mutações patogênicas, oito portavam apenas uma mutação na sequência de codificação do GJB2, apesar de toda a região codificadora do gene GJB2 ter sido sequenciada em todas as amostras por sequenciamento bidirecional de DNA, incluindo o heterozigoto 35delG. A segunda mutação putativa presente nesses pacientes poderia estar localizada em áreas não analisadas do gene GJB2, tais como sítios de splice. A hipótese de que a segunda mutação poderia estar localizada em um segundo gene não pode ser descartada.

Os resultados deste estudo piloto deverão contribuir com o desenvolvimento de diagnósticos genéticos para a surdez, desempenhando um importante papel no progresso das questões de saúde pública, no aumento da precisão do aconselhamento genético e no tratamento precoce da região. Entrementes, mais estudos e pesquisas são necessários para descobrir e analisar genes e variantes de modo a elucidar as outras causas genéticas da perda auditiva em populações miscigenadas.

AGRADECIMENTOS

Nossos sinceros agradecimentos aos pacientes por sua participação. O presente trabalho teve o apoio do CNPq.

  • Endereço para correspondência:
    Luciana Santos Serrão de Castro
    Tv. 14 de Abril, nº 1235, apto 601
    Belém - PA. Brasil. CEP: 66060-460
  • Este artigo foi submetido no SGP (Sistema de Gestão de Publicações) do BJORL em 16 de outubro de 2012. cod. 10524.

    Artigo aceito em 2 de novembro de 2012.

    CNPq-Brazilian National Research Council.

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    Endereço para correspondência: Luciana Santos Serrão de Castro Tv. 14 de Abril, nº 1235, apto 601 Belém - PA. Brasil. CEP: 66060-460

    Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      11 Mar 2013
    • Data do Fascículo
      Fev 2013

    Histórico

    • Recebido
      16 Out 2012
    • Aceito
      02 Nov 2012
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