Influência de diferentes diluentes e temperaturas de refrigeração sobre a qualidade de sêmen suíno

Influence of different diluents and cooling temperatures on the quality of boar semen

Resumos

Foram colhidos seis ejaculados de seis diferentes cachaços e diluídos com Androhep e Merck III, utilizando-se diferentes temperaturas de refrigeração. Após avaliação (aparência, volume, concentração, motilidade e morfologia), o ejaculado foi fracionado em porções de 100 ml (2 bilhões/ml) e diluído na proporção 1 + 1. As porções de sêmen foram resfriadas lenta (32ºC <FONT FACE="Symbol">Þ</FONT> 20ºC <FONT FACE="Symbol">Þ</FONT> 17ºC <FONT FACE="Symbol">Þ</FONT> 5ºC) ou rapidamente (32ºC <FONT FACE="Symbol">Þ</FONT> 5ºC) durante 2, 24 ou 48 horas. Após cada intervalo de refrigeração, 5 ml de sêmen foram incubados a +38ºC e avaliados quanto à aparência, volume, concentração, motilidade e morfologia4. A refrigeração das diferentes porções foi medida por um termômetro eletrônico (Therm Typ 2280-8, Fa. Minitüb - from -200,0 until + 600,0ºC) introduzindo-se o eletrodo no sêmen. A refrigeração lenta mostrou maior motilidade e NAR (p<0,05) do que a rápida. Não houve diferença significativa (p<0,05) entre os diluentes Androhep e BTS, mas o diluente Merck III teve influência inferior sobre a qualidade do sêmen de suíno.

Diluentes; Suínos; Refrigeração

Six ejaculates were collected from six different boars for dilution with Androhep, BTS and Merck III and cooling in different temperatures. After examination (appearance, volume, motility, concentration and morphology of acrosomal ridges [NAR]) the semen was in 100 ml fragmented (2 bi./ml) and dilutes (1+1). The fractions were slowly (32ºC <FONT FACE="Symbol">Þ</FONT> 20ºC <FONT FACE="Symbol">Þ</FONT> 17ºC <FONT FACE="Symbol">Þ</FONT> 5ºC) or rapidly (32ºC <FONT FACE="Symbol">Þ</FONT> 5ºC) cooling for 2, 24 or 48 hours. After this period 5 ml semen were for 30 min by 38ºC incubated and examined. The cooling of the different fractions was measured in the semen with an electronic thermometer (Therm Typ 2280-8, Fa. Minitüb - from -200,0 until +600.0ºC). The slow cooling showed a visible motility increase (p<0.05) and acrome integrity (NAR) than the rapid cooling. There was no significant difference (p<0.05) between Androhep and BTS dilute, but the Merck III dilute has a bad influence on the quality of boar semen.

Diluents; Pigs; Refrigeration

Influência de diferentes diluentes e temperaturas de refrigeração sobre a qualidade de sêmen suíno

Influence of different diluents and cooling temperatures on the quality of boar semen

Edna KOTZIAS-BANDEIRA¹

CORRESPONDÊNCIA PARA:

Edna Kotzias-Bandeira

Departamento de Medicina Veterinária

Universidade Federal Rural de Pernambuco

R. Dom Manoel de Medeiros, s/nº, Dois Irmãos

52171-900 – Recife – PE

e-mail: [e-mail]

RESUMO

Foram colhidos seis ejaculados de seis diferentes cachaços e diluídos com Androhep e Merck III, utilizando-se diferentes temperaturas de refrigeração. Após avaliação (aparência, volume, concentração, motilidade e morfologia), o ejaculado foi fracionado em porções de 100 ml (2 bilhões/ml) e diluído na proporção 1 + 1. As porções de sêmen foram resfriadas lenta (32ºC Þ 20ºC Þ 17ºC Þ 5ºC) ou rapidamente (32ºC Þ 5ºC) durante 2, 24 ou 48 horas. Após cada intervalo de refrigeração, 5 ml de sêmen foram incubados a +38ºC e avaliados quanto à aparência, volume, concentração, motilidade e morfologia⁴. A refrigeração das diferentes porções foi medida por um termômetro eletrônico (Therm Typ 2280-8, Fa. Minitüb - from -200,0 until + 600,0ºC) introduzindo-se o eletrodo no sêmen. A refrigeração lenta mostrou maior motilidade e NAR (p<0,05) do que a rápida. Não houve diferença significativa (p<0,05) entre os diluentes Androhep e BTS, mas o diluente Merck III teve influência inferior sobre a qualidade do sêmen de suíno.

UNITERMOS: Diluentes; Suínos; Refrigeração.

INTRODUÇÃO

Influência da refrigeração

A influência do meio diluidor, da incubação e da taxa de refrigeração sobre a sensibilidade ao choque frio do sêmen suíno foi investigada por Weber¹⁶. A motilidade e a integridade do acrossomo do espermatozóide resfriado a 5ºC foi significativamente mais baixa que o resfriado a temperaturas de 25ºC e 15ºC. À temperatura de 15ºC, em comparação com 35ºC e 25ºC, houve perda significante da motilidade de 10%, enquanto a integridade do acrossomo permaneceu inalterada. Após resfriamento até 5ºC houve queda significante tanto da motilidade quanto da integridade do acrossomo¹⁶.

Perezcanto-Fernandes⁸ demonstrou que após 2, 24 e 48 horas a motilidade e a NAR de sêmen diluído com Androhep e BTS são altamente significantes, assim como de 0 até 24 horas para BTS e de 24 até 48 horas para Androhep¹⁴.

Influência da incubação antes da refrigeração

Weber¹⁶ constatou que a incubação do sêmen a 15ºC acarreta perda estatisticamente significante da motilidade em cerca de 20%, em relação à incubação de três horas a 35ºC.

A incubação de quatro horas a 25ºC nos meios de diluição Androhep 0^*, BW 15^** e Androhep^*** melhora sensivelmente a motilidade e a integridade do acrossomo do espermatozóide de suíno.

Após seis e oito horas de incubação a 20ºC, a motilidade espermática é altamente significante em relação às amostras resfriadas a 5ºC e não incubadas e às resfriadas e incubadas durante duas horas. Entre as temperaturas de resfriamento de 20ºC e 5ºC, há diferenças significantes na motilidade espermática em todos os intervalos de incubação.

A motilidade de sêmen incubado (25ºC, 20ºC e 15ºC) e resfriado a 5ºC independe significativamente da temperatura de incubação em relação às não-incubadas¹⁶.

Influência da incubação antes do choque frio

O sêmen de suíno é extremamente sensível ao choque frio após a ejaculação, entretanto, adquire certa resistência pela incubação, conforme demonstrado por Lasley; Bobart⁵ e Benson et al.¹.

Estudos desenvolvidos por Pursel et al.^8,10,11 e por Buttler; Roberts² demonstraram que a incubação de quatro até sete horas a 30ºC aumentou a resistência ao choque frio, pois 70 a 80% dos espermatozóides não mostraram alterações na motilidade nem na integridade do acrossomo.

A velocidade e o intervalo de refrigeração têm grande significado nas alterações causadas pelo choque frio. Segundo Watson¹⁵, há efeito do choque frio sobre as células espermáticas, a partir da velocidade de refrigeração de 10 até 15ºC por minuto. Os espermatozóides de suínos oriundos do ejaculado completo são irreversivelmente comprometidos após a refrigeração de 37ºC a 5 até 0ºC, independentemente da velocidade de refrigeração, enquanto espermatozóides oriundos da fração rica do sêmen sobrevivem à refrigeração. Moore et al.⁶ e Nath et al.⁷ estudaram a qualidade do sêmen de suíno após três diferentes períodos de equilíbrio a 24ºC. Imediatamente após a colheita, o ejaculado foi mantido a 24ºC e após 1, 2 ou 3 horas foi centrifugado, ressuspendido e resfriado de 24ºC a 5ºC durante 1,5 hora. Após a refrigeração a 5ºC, o sêmen foi congelado. A motilidade e a integridade do acrossomo do sêmen mantido por 2 ou 3 horas antes da congelação foram significativamente melhores que daquele mantido por uma hora a 24ºC antes da congelação.

Investigações sobre a influência da incubação (resistência) do espermatozóide antes do choque frio foram também conduzidas por Watson¹⁵. Espermatozóides não diluídos foram incubados a 20ºC por 2, 4, 8, 16, 24 ou 32 horas e então induzidos ao choque frio a 0ºC. A maior parte dos espermatozóides sobreviveu ao choque frio nos intervalos entre 4 e 16 horas de incubação, havendo queda do número de acrossomos intactos após 32 horas de incubação. Este estudo demonstrou que a incubação de 16 horas à temperatura ambiente após a ejaculação aumenta significativamente a resistência ao choque frio. Os autores afirmaram que intervalo longo de incubação antes da refrigeração tem efeito positivo sobre o processo de crioconservação, pois a membrana adquire maior resistência contra o choque frio.

O objetivo deste trabalho foi estudar a influência de diferentes diluentes e temperaturas sobre a qualidade do sêmen suíno. Não houve diferença significativa (p<0,05) entre a motilidade do ejaculado nativo e aqueles diluídos nos três diferentes diluentes. Isto significa que logo em seguida à diluição tais diluentes têm a mesma influência sobre a motilidade e a integridade do acrossomo do sêmen suíno.

MATERIAL E MÉTODO

Colheita, exame e diluição do sêmen

Para a diluição e a refrigeração do sêmen foram utilizados 6 cachaços das raças Landrace alemão e Schwäbisch-hällischen, sendo o experimento realizado entre janeiro e fevereiro de 1995 no Instituto de Medicina da Reprodução da Escola Superior de Veterinária de Hannover. A colheita do sêmen foi realizada pelo método da mão enluvada com ajuda de Phantome. O sêmen das fases rica e da pobre foi colhido em vidros separados, pré-aquecidos a 35ºC e a secreção das glândulas bulbouretrais foi separada por gaze estéril. Após a colheita, o ejaculado permaneceu por 15 minutos a 32ºC em banho-maria para adaptação à temperatura do diluente. O sêmen foi avaliado quanto à aparência, volume, concentração, motilidade e morfologia⁴.Em seguida, o ejaculado foi fracionado em porções de 100 ml (2 bilhões/ml) e diluído com Androhep, BTS e Merck III, na proporção de 1 +

Componentes do diluente Androhep: D (+) Glucose

26,0g

Tri-Natriumcitrat-2hydrat

8,0g

Natriumhydrocarbonat

1,2g

BSA

2,4g

HEPES

2,5g

Gentamycin

0,25g

Aqua bidest

ad 1.000 ml

Componentes do diluente BTS: D (+) – Glucose

37,0g

Tri-Natriumcitrat-2hydrat

6,0g

Natriumhydrocarbonat

1,3g

EDTA

1,3g

KCL

0,80g

Gentamycin

0,25g

Aqua bidest.

ad 1.000 ml

Componentes do diluente Merck III: D (+) - Glucose (monohydrat)

52,7g

Tri-Natriumcitrat-2hydrat

3,3g

EDTA

1,8g

Natriumhydrocarbonat

1,2g

Neomycinsulfat

1,0g

Aqua bidest.

ad 1.000 ml

Cada porção foi conservada durante 2 horas em temperaturas de 20ºC ou 5ºC. De cada porção foram retirados e incubados 5 ml de sêmen durante 30 minutos a 38ºC e realizado o segundo exame morfológico (NAR) e de motilidade.

As porções conservadas em temperatura ambiente (TA = 20ºC) foram mantidas a 17ºC por mais 24 horas, enquanto as conservadas a 5ºC foram mantidas nesta temperatura por mais 24 horas. Estas amostras foram incubadas por 30 minutos a 38ºC e, em seguida, realizado o terceiro exame de motilidade.

As porções conservadas foram mantidas nas mesmas temperaturas (17ºC e 5ºC) por mais 48 horas e, em seguida, incubadas a 38ºC durante 30 minutos, sendo realizada a última avaliação da motilidade e integridade do acrossomo.

A refrigeração das diferentes amostras foi medida por termômetro eletrônico (Therm Typ 2280-8, Fa. Minitüb - from - 200,0 until + 600,0ºC) pela introdução do eletrodo no sêmen, conforme mostra graficamente a Fig. 1).

Avaliação estatística

As variáveis "SMOT, CMOT e NAR" foram calculadas segundo o procedimento General Linear Models "GLM" (SAS 1985). Para a variância significativa (p<0,05), as médias foram comparadas através do teste t de Student.

RESULTADOS

Na Tab. 1, são ilustradas a influência dos diferentes diluentes e das temperaturas sobre a motilidade do sêmen de suínos. A motilidade das amostras de sêmen nativo diluído em Androhep, BTS e Merck III não difere significativamente entre si (p<0,05). Tanto após 2 horas a 20ºC e a 5ºC quanto após 24 horas a 17ºC e 5ºC e após 48 horas a 17º e 5ºC, as amostras diluídas em Androhep e BTS não mostraram diferença significante entre si (p<0,05), entretanto, foram significativamente melhores em relação às diluídas em Merck III.

Tabela 1

Influência dos diferentes diluentes e temperaturas sobre a motilidade do sêmen de suínos.

Valores com letras diferentes na mesma coluna diferem entre si significativamente (p<0,05). Institüt für Reproduktionsmedizin - Tierärztliche Hochschule Hannover - janeiro/fevereiro 1995.

Na Tab. 2, são ilustradas a influência dos diferentes diluentes e das temperaturas sobre a integridade do acrossomo - normal apical rand (NAR). A NAR do sêmen nativo e o sêmen após 2 horas a 20ºC diluídos em Androhep, BTS e Merck III não diferem significativamente entre si (p<0,05). Após 48 horas, as amostras de sêmen conservadas a 17ºC também não diferem significativamente entre si (p<0,05) e aquelas diluídas em Androhep e BTS e conservadas a 5ºC, não diferem significativamente daquelas diluídas em Merck III (p<0,05).

Tabela 2

Influência dos diferentes diluentes e temperaturas sobre a integridade do acrossomo (NAR) do sêmen de suínos.

Valores com letras diferentes na mesma coluna diferem entre si significativamente (p<0,05). Institüt für Reproduktionsmedizin - Tierärztliche Hochschule Hannover - janeiro / fevereiro 1995.

Comportamento da temperatura durante a refrigeração

Na Fig. 2 está representada a curva de refrigeração das amostras de sêmen diluídas em Androhep na proporção 1+1. A diluíção mostrou diferenças na duração da refrigeração, desde o ponto inicial do refrigeração (32ºC) até o ponto final (15ºC). As porções diluídas em Merck III sofreram refrigeração mais rápida que aquelas diluídas em Androhep e BTS. Entre os 70 e 120 minutos houve refrigeração linear nos diluentes Androhep e BTS até atingir o limite de 5ºC.

TºC

Intervalo de medida em minutos

Figura 2

DISCUSSÃO

Pode-se observar nas Tab. 1 e 2 que na refrigeração lenta (32ºC ð 20ºC ð 17ºC ð 5ºC) houve maior aumento da motilidade (p<0,05) e do NAR que na refrigeração rápida (32ºC ð 5ºC). Estes resultados mostram que o sêmen de suínos é muito sensível ao choque frio, conforme observações de Weber¹⁶; Nath⁷ e Tamuli; Watson¹³. A motilidade e NAR dos espermatozóides resfriados a 5ºC são significativamente mais baixas em relação às amostras resfriadas a temperaturas de 25ºC e 15ºC¹⁶.

O aumento significante da motilidade e NAR do sêmen diluído em Androhep e BTS após 2, 24 e 48 horas são resultados idênticos aos encontrados por Perezcanto-Fernandes⁸ e após 0 até 24 horas diluídos em BTS e 24 até 48 horas diluídos em Androhep¹⁴.

A refrigeração do sêmen diluído em Androhep (Fig. 2) mostra que o rápido resfriamento das porções diluídas em Merck III, provavelmente, influiu negativamente sobre a qualidade do sêmen. Uma comparação destes resultados de refrigeração com outros autores se torna difícil, pelo fato de terem medido apenas a velocidade de congelação do sêmen^3,12.

CONCLUSÕES

1. Não houve diferença significativa (p<0,05) entre os diluentes Androhep e BTS, entretanto, o diluente Merck III influiu negativamente sobre a qualidade do sêmen suíno;

2. A refrigeração lenta mostrou aumento mais significante da motilidade e do NAR que a refrigeração rápida.

SUMMARY

Six ejaculates were collected from six different boars for dilution with Androhep, BTS and Merck III and cooling in different temperatures. After examination (appearance, volume, motility, concentration and morphology of acrosomal ridges [NAR]) the semen was in 100 ml fragmented (2 bi./ml) and dilutes (1+1). The fractions were slowly (32ºC Þ 20ºC Þ 17ºC Þ 5ºC) or rapidly (32ºC Þ 5ºC) cooling for 2, 24 or 48 hours. After this period 5 ml semen were for 30 min by 38ºC incubated and examined. The cooling of the different fractions was measured in the semen with an electronic thermometer (Therm Typ 2280-8, Fa. Minitüb - from -200,0 until +600.0ºC). The slow cooling showed a visible motility increase (p<0.05) and acrome integrity (NAR) than the rapid cooling. There was no significant difference (p<0.05) between Androhep and BTS dilute, but the Merck III dilute has a bad influence on the quality of boar semen.

UNITERMS: Diluents; Pigs; Refrigeration.

Recebido para publicação: 31/03/1998

Aprovado para publicação: 26/02/1999

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¹

Tierärztliche Hochschule Hannover (Escola Superior de Medicina Veterinária de Hannover), Alemanha

^*

Androhe 0 = Glucose-Citrato-EDTA-HEPES.

^**

BW 15 = Glucose-Citrato-EDTA-MOPS-BSA.

^***

Androhep = Glucose-Citrato-EDTA-HEPES-BSA.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Set 2000
• Data do Fascículo
  1999

Histórico

• Aceito
  26 Fev 1999
• Recebido
  31 Mar 1998