Detecção de Escherichia coli O157:H7 e APEC em amostras de água da produção avícolaResumo
Escherichia coli são bactérias comensais e estão presentes no ambiente. Entretanto, alguns patotipos podem causar doenças em animais e humanos. E. coli APEC causa a colibacilose em aves, provocando sinais respiratórios e sistêmicos. O sorotipo enterohemorrágico O157:H7 causa infecções transmitidas por alimentos em humanos, provocando quadros de diarreia hemorrágica e síndrome hemolítico-urêmica. O objetivo do estudo foi detectar os sorotipos E. coli APEC e O157:H7 em amostras de água em diferentes pontos da produção avícola e avaliar os perfis de resistência antimicrobiana. A análise de PCR foi realizada para detectar os padrões dos genes hlyF, iutA, iroN, iss e ompTde E. coli APEC e o antígeno flagelar H7 e as toxinas Stx1 e Stx2 de E. coli O157:H7. Trinta e três amostras de água de diferentes pontos foram positivas para E. coli, entre elas, oito para APEC e nenhuma para O157:H7. Os isolados de APEC apresentaram diferentes graus de suscetibilidade aos antimicrobianos.
Palavras-chave: E. coli ; colibacilose; patotipos; aves; produção
Abstract
Escherichia coli are commensal bacteria and are present in the env/roΛ/ment. However, some pathotypes can cause disease in animals and humans. E. coli APEC causes colibacillosis in chickens, inducing respiratory and systemic symptoms. Enterohemorrhagic serotype O157:H7 causes foodborne infections in humans, with hemorrhagic diarrhea and hemolytic-uremic syndrome. The objective was to detect the E. coli APEC and O157:H7 serotypes in water samples from different points from the poultry production, and to evaluate the antimicrobial resistance profiles. PCR analysis was performed to detect the patterns of genes hlyF, iutA, iroN, iss and ompT from E. coli APEC and the H7 flagellar antigen and the Stx1 and Stx2 toxins from E. coli O157:H7. Thirty-three water samples from different points were positive for E. coli, among them, eight for APEC and none for O157:H7. APEC isolates showed different degrees of susceptibility to antimicrobials.
Keywords: E. coli ; colibacillosis; pathotypes; chickens; production
1. Introdução
Apesar da maioria das cepas de E. coli (Escherichia coli) serem consideradas comensais e estarem presentes no ambiente, algumas cepas apresentam fatores de virulência e podem causar doenças nos hospedeiros, sendo classificadas em patótipos como E. coli patogênica extra-intestinal (Extraintestinal Pathogenic E. coli - ExPEC) e intestinal (Intestinal Pathogenic E. coli - IPEC)(1, 2, 3, 4). Além da patogenicidade de alguns sorotipos de E coli, outro fato importante é em questão a saúde pública, na qual essa bactéria é uma das principais envolvidas a resistência de antimicrobianos, especialmente aqueles utilizados na produção animal(1, 5).
ExPEC tem seis subpatotipos: UPEC (E. coli uropatogênicas), NMEC (E. coli associada a meningite neonatal), APEC (E. coli patogênica para as aves), SePEC (E. coli causadora de septicemia), MPEC (E. coli patogênica mamária) e EnPEC (E. coli endometrial patogênica)(4). APEC é um subpatotipo que causa doença em aves, envolvido com infecções respiratórias e sistêmicas, conhecida como colibacilose. A patogenicidade deste patótipo pode estar ligada a fatores de virulência, previamente estudados, que geralmente apresentam padrões de quatro ou cinco genes: hlyF (produção de toxinas), iutA and iroN (aquisição de ferro), iss e ompT (protectinas) (6, 7). Os genes citados são os mais prevalentes em isolados de diferentes partes do mundo, como Estados Unidos, Tailândia, Coreia e Austrália. Apesar disso, outros estudos utilizando sequenciamento genético, tornaram-se uma ferramenta para complementar com informações mais relevantes, incluindo outros genes como fatores de virulência(8). APEC é uma das doenças bacterianas mais comuns nas produções avícolas, causando grandes prejuízos econômicos. A doença se manifesta de diversas formas, como peritonite, salpingite, artrite, aerossaculite, e pode estar relacionada à alta morbidade e mortalidade do lote(8).
Dentre os patótipos de IPEC, há um grupo de E. coli diarreiogênica (DEC) que possui o sorotipo enterohemorrágico O157:H7, capaz de causar infecções alimentares em humanos, com diarreia hemorrágica e síndrome hemolítico-urêmica (SHU), considerada de grande importância em saúde pública(4, 5). O sorotipo O157:H7 produz uma verotoxina (VTEC), conhecida como toxina Shiga (Stx), uma citotoxina potente e codificada por bacteriófagos, que é o principal marcador de virulência deste sorotipo. O sorotipo O157 é frequentemente associado ao antígeno H7 (codificado por fliC H7)(9). Este microrganismo pode colonizar o trato gastrointestinal das aves sem causar doença, porém pode servir como fonte de contaminação das carcaças de frango no abatedouro, e consequentemente um risco à saúde humana(5).
A qualidade da água nas granjas é essencial no controle de patógenos de interesse em saúde humana e animal, podendo ser fonte de infecção de E. coli pela via oro-fecal das aves(1). A pesquisa fornecerá informações importantes sobre a transmissão de APEC e O157:H7, e suas potenciais ameaças à saúde pública por meio da resistência antimicrobiana. O objetivo deste trabalho foi avaliar a presença de E. coli APEC e O157:H7 em água bruta e tratada de diferentes ciclos de produção avícola e testar a sensibilidade a antibióticos.
2. Material e métodos
2.1 Isolamento de E. coli
Amostras de água de poço e tratadas foram coletadas em diferentes granjas avícolas localizadas nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Paraná e Mato Grosso. Amostras de água (100 mL) foram testadas com substrato cromôgenico (Colilert, Laboratório IDEXX). Após a confirmação da positividade para E. coli, 100 µL da amostra foi cultivada em placa contendo ágar MacConkey, e incubada entre 18 e 24 horas a 37°C. Colônias com características morfológicas de E. coli foram cultivadas em meios bioquímicos para confirmação, e então semeadas em ágar nutriente.
2.2 Extração de DNA
Três colônias de cada amostra foram inoculadas em 200 µL de tampão PBS (Tampão fosfato-salino 1x). Em seguida, o DNA da amostra foi extraído usando o kit Indimag Pathogen no equipamento Indimag 48, de acordo com as especificações do fabricante.
2.3 Detecção de E. coli O157:H7
Os primers utilizados para detecção do antígeno flagelar H7(10) e das toxinas Stx1 e Stx2 de E. coli O157:H7 foram sintetizados conforma as sequências da Tabela 1. O mix de PCR foi preparado usando o kit de PCR QuantiFast SyBR Green (Qiagen®), os primers e a amostra de DNA extraída, seguindo o perfil de ciclos conforme especificação do fabricante. Os ciclos foram: ativação inicial da PCR (5 minutos a 95°C), e duas ciclagens subsequentes: 35 ciclos de desnaturação (10 segundos a 95°C) e a combinação de anelamento e extensão (30 segundos a 60°C). Após a amplificação, amostras com Ct ≤32 foram analisadas para avaliar a curva de melting e com a temperatura, tendo como comparação o controle positivo (ATCC 43888).
2.4 Detecção de E. coli APEC
As sequências de primers e TaqMan para detecção dos genes de virulência hlyF, iutA, iroN, iss, and ompT (7) foram sintetizados conforme Tabela 1. O master mix foi preparado utilizando o kit QuantFast Probe PCR (Qiagen®), os primers, a TaqMan e o DNA extraído da amostra, seguindo a ciclagem conforme orientações do fabricante. A ciclagem seguida foi: ativação inicial da PCR (3 minutos a 95°C) e duas ciclagens subsequentes: 35 ciclos de desnaturação (3 segundos a 95°C) e a combinação de anelamento e extensão (30 segundos a 60°C). Depois da ciclagem, detecções dos genes com Ct ≤32 foram consideradas positivas, e a amostra foi considerada E. coli APEC quando apresentasse positividade para 4 ou mais genes amplificados.
2.5 Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos
Amostras positivas para APEC ou O157:H7 foram recuperadas do ágar estoque e cultivadas em ágar Mueller Hinton (MH). A multiplicação de colônias em ágar MH foi usada para o teste de susceptibilidade a antimicrobianos pelo método de Difusão de discos de acordo com o Guia do Instituto de padrões de laboratório e clínico (CLSI)(12). Os antibióticos testados foram Amoxicilina (10 µg), Canamicina (30 µg), Ceftiofur (30 µg), Doxiciclina (30 µg), Enrofloxacina (5 µg), Fosfomicina (50 µg), Gentamicina (10 µg), Lincomicina + Espectinomicina (109 µg), Neomicina (30 µg), Norfloxacina (10 µg), Oxitetraciclina (30 µg), Sulfonamida (300 µg), Tetraciclina (30 µg).
3. Resultados
Setenta e duas amostras de água foram analisadas e 33 foram positivas para E. coli (Tabela 2). Dentre as 33 amostras, oito foram positivas para APEC na PCR e nenhuma para O157:H7. Sete estirpes de APEC foram positivas para os cinco genes de virulência analisados (ompT, iroN, hlyF, iutA, iss), e uma foi positiva para 4 genes (ompT, iroN, hlyF, iss).
O resultado do teste de susceptibilidade a antimicrobianos com as cepas de APEC consta na Figura 1. Foi observado que as cepas de APEC apresentaram diferentes graus de susceptibilidade aos antimicrobianos testados Amoxicilina, Canamicina, Ceftiofur, Doxiciclina, Enrofloxacina, Lincomicina + Spectinomicina, Neomicina, Oxitetraciclina, Sulfonamida, Tetraciclina, Fosfomicina, Gentamicina e Norfloxacina. Dois isolados testados (25%) foram resistentes a Doxiciclina, Oxitetraciclina, Sulfonamida e Tetraciclina, e uma estirpe (12.5%) foi resistente a Amoxicilina e Lincomicina + Spectinomicina.
Perfil dos isolados de Escherichia coli APEC em relação a susceptibilidade aos antibióticos.
4. Discussão
Os genes de virulência selecionados para o estudo (hlyF, iutA, iroN, iss, and ompT) são os mais predominantes nas estirpes de APEC, entretanto outros sets de genes também têm sido detectados como tsh, iuc, fim, neuS, cvi, astA, vat, irp2, iucD, papC, cva-cvi(7, 13). A ausência do gene iutA, como visto em uma das cepas estudadas, tem sido comumente observada em outros trabalhos, e pode estar relacionado à origem geográfica ou mesmo ao perfil patogênico(14). E. coli O157:H7 é um dos principais patógenos causadores de doenças transmitidas por alimentos (DTA). Estudos têm demonstrado uma correlação positiva entre a contaminação de bebida com E. coli O157:H7(15) e a presença deste patógeno nas fezes de frango. A contaminação da carcaça no abatedouro pode provocar grandes perdas econômicas devido o bloqueio do produto(16). Em nosso estudo, E. coli O157:H7 não foi detectada em nenhuma amostra analisada. Por isso, a importância de conhecer o cenário atual e positivo da produção avícola em relação a esse patógeno.
As estirpes de APEC isoladas no estudo demonstraram diferentes graus de susceptibilidade para as 13 moléculas de antibióticos testadas. Apenas 25% foram resistentes a Doxiciclina, Oxitetraciclina e Sulfonamida + Tetraciclina, e 12.5% foi resistente a Amoxicilina e Lincomicina + Spectinomicina. Apesar dos baixos graus de resistência à antimicrobianos das cepas de E. coli APEC isoladas no estudo, sabe-se que esse é um tema que gera preocupação a nível mundial, e por isso, monitoramentos devem ser realizados para controlar as taxas de resistência que acontecem na produção. O uso descontrolado de antibióticos como promotores de crescimento, ou de forma inadequada e incorreta, podem resultar na seleção de bactérias multirresistentes, em que estas podem compartilhar genes de resistência com outras bactérias, disseminando o problema(14).
5. Conclusão
Estirpes de E. coli APEC com diferentes graus de suscetibilidade à antimicrobianos estão disseminadas na cadeia avícola, e a fonte de infecção para as aves pode vir de diferentes contaminações ambientais, incluindo água bruta e tratada. Embora a água bruta passe por tratamentos, vale ressaltar que desvios de biosseguridade podem resultar na contaminação da água potável e consequentemente a infecção das aves. O sorotipo de E. coli O157:H7 não foi isolado de amostras de água, sendo observado um cenário positivo no controle deste patógeno.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer à equipe do Laboratório de Saúde Animal de Nuporanga-SP da empresa Seara Alimentos LTDA, JBS S.A., e à empresa Seara Alimentos LTDA, JBS S.A. pelos recursos disponibilizados para a realização do projeto.
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Datas de Publicação
-
Publicação nesta coleção
04 Nov 2024 -
Data do Fascículo
2024
Histórico
-
Recebido
13 Maio 2023 -
Aceito
31 Jul 2024 -
Publicado
30 Set 2024
