Extrato etanólico de açafrão (Curcuma longa L.) reduz apoptose e promove proliferação de células de osteossarcoma canino

Resumo

A Curcuma longa L., planta conhecida popularmente como açafrão, tem sido amplamente estudada por suas diversas propriedades terapêuticas, incluindo a ação antineoplásica. O extrato etanólico da planta contém diversos compostos fenólicos, com destaque para a curcumina. O osteossarcoma é um tumor ósseo predominante em cães e humanos, caracterizado por apresentar alto potencial metastático e prognóstico desfavorável. Procurou-se investigar os efeitos de diferentes concentrações de curcumina do extrato etanólico de açafrão sobre células de osteossarcoma canino de cultura estabelecida. As células foram cultivadas e submetidas ao tratamento com extrato com diferentes concentrações de curcumina (0, 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM e 1000 μM) e tempos de exposição (24h, 48h e 72h) pelo EEA. Inicialmente, foram realizados: técnica de redução do tetrazólio (MTT) e cálculo da IC₅₀. Posteriormente, após o tratamento com o extrato, realizou-se o ensaio de imunocitoquímica para verificar a expressão de p53 mutada e estudar o potencial proliferativo das células malignas; Bcl-2, com intuito de averiguar o estímulo de via antiapoptótica; e o marcador Ki-67, que sinaliza aumento no grau de malignidade. O extrato promoveu proliferação de células de osteossarcoma canino, com incremento de até 3819,74% na concentração de 50μM de curcumina. O composto também alterou a expressão das proteínas p53 mutante e Ki-67 significativamente, mas não alterou a expressão de Bcl-2, mostrando que não induziu a via antiapoptótica mediada por esta. Estes resultados demonstram que o extrato etanólico do açafrão apresenta potencial proliferativo sobre células de osteossarcoma canino, sugerindo a necessidade de conscientização e conhecimento dos reais efeitos de determinados compostos naturais, considerados seguros ao serem utilizados como tratamento de diversas enfermidades.

Palavras-chave
compostos naturais; D-17; neoplasias ósseas; segurança terapêutica

Abstract

Curcuma longa L., also known as turmeric, has been widely studied for its various therapeutic properties, including antineoplastic action. The ethanolic extract of the plant contains several phenolic compounds, especially curcumin. Osteosarcoma is a predominant bone tumor in dogs and humans, characterized by high metastatic potential and an unfavorable prognosis. The aim of this study was to investigate the effects of turmeric ethanol extract on canine osteosarcoma cells from established culture. The cells were cultured and treated with different curcumin concentrations (0, 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, and 1000 μM) and exposure times (24h, 48h, and 72h). We first performed tetrazolium reduction technique (MTT) assay and calculated IC₅₀. An immunocytochemistry assay was performed after extract treatment to verify the expression of mutated p53 and therefore study the proliferative potential of malignant cells; Bcl-2 and Ki-67 were used to assess apoptosis and the degree of malignancy, respectively. The extract enhanced the proliferation of canine osteosarcoma cells, reaching 3,819.74% at 50 μM of curcumin. The extract also significantly altered the expression of mutated p53 and Ki-67 proteins but not that of Bcl-2, suggesting that it did not induce this antiapoptotic pathway. Overall, these results are prerequisite to better understanding how natural compounds such as turmeric ethanolic extract affect cell proliferation and could be used to treat various diseases.

Keywords:
bone neoplasms; D-17; natural compounds; therapeutic safety

Introdução

Os produtos naturais derivados de plantas destacam-se entre as fontes mais promissoras para a produção de medicamentos (¹,²). O Cerrado, segundo maior bioma do Brasil e rico em plantas utilizadas na medicina popular, é considerado um hotspot global para a conservação da biodiversidade devido à sua riqueza de espécies e rápida perda de habitats(³). A disponibilidade das plantas favorece o uso de produtos naturais como fonte terapêutica(⁴).

Estudos recentes apontam que 25% da prescrição mundial de medicamentos é derivada de plantas, e dentre os 252 medicamentos que compõem a lista de fármacos essenciais da Organização Mundial de Saúde (OMS), 11% são de origem totalmente vegetal(⁵,⁶). Embora existam várias vantagens no uso de compostos secundários de plantas, substâncias presentes em suas composições podem ser prejudiciais à saúde. Ainda, a utilização de tais compostos requer estudos mais detalhados que possam avaliar mecanismos farmacológicos e seus possíveis efeitos deletérios(⁷), além de definir qual composto de fato é responsável por cada ação terapêutica, em razão do elevado número de moléculas usualmente presentes em um só extrato(⁸,⁹). Conforme as condições de obtenção, preparo ou conservação, o produto final pode não representar, de maneira fidedigna, a real composição fotoquímica da planta(¹⁰).

A cúrcuma (Curcuma longa L.) pertence à família de Zingiberaceae, gênero Curcuma. É uma planta popularmente conhecida como açafrão, que se caracteriza como uma cultura de colheita abundante e floração perene. Trata-se de um condimento alimentar apreciado e amplamente utilizado no mundo por conferir cor e sabor aos alimentos, tendo sua origem no sudeste da Ásia, nas florestas tropicais da Índia, maior fornecedor mundial(¹¹,¹²). No Brasil, o Centro-Oeste, particularmente a região de Mara Rosa - GO, é a que mais se destaca na produção e consumo do açafrão, cujo teor de curcumina, a molécula com efeitos terapêuticos mais característica desta planta, apresenta o significativo teor médio de 6,8%(¹³).

Os efeitos terapêuticos do açafrão e seus componentes curcuminóides já foram demonstrados em diversos estudos, dentre eles: a redução da lipogênese, ação antipruriginosa, anti-inflamatória, anticancerígena, analgésica, antimicrobiana, antifúngica, antiviral, antioxidante e antineoplásica(¹⁴-¹⁸). De fato, a curcumina tem sido amplamente utilizada e comercializada como alternativa fitoterápica para doenças inflamatórias ósseas em pacientes caninos(¹⁹) e humanos(²⁰). Porém, ainda há muito a ser esclarecido acerca dos mecanismos e vias de sinalização envolvidas nas ações celulares do açafrão.

Em experimento anterior, este mesmo grupo de pesquisa já determinou que a curcumina, em sua forma pura, promoveu atividade antitumoral em células de osteossarcoma canino (OC) por meio de apoptose extrínseca, ativando as vias da quinase JNK e da caspase-3 e mediada pela via de transdução de sinal da cAMP/AMPK. Além disso, a curcumina determinou a redução da expressão da forma mutante da proteína p53 sem interferir na via de autofagia do AKT/mTOR(¹⁸). Todavia, outros compostos presentes no extrato total do açafrão, como os fenóis, possuem efeitos antioxidantes benéficos de neutralizar radicais livres de oxigênio(²¹) e poderiam interferir com a capacidade antiapoptótica da curcumina.

O OC é uma neoplasia agressiva que representa até 85% de todos os tumores ósseos em cães. A maioria dos crescimentos tumorais se origina na região metafisária dos ossos do esqueleto apendicular. Os fatores de risco relatados para o desenvolvimento de OC incluem sexo, raça, história de trauma e situação de castração. As cadelas apresentam menor risco, enquanto cães de raças grandes e gigantes (> 25 kg) estão em maior risco. Os animais afetados geralmente apresentam claudicação e inchaço, além de risco de fratura patológica, preferencialmente no fêmur. Devido à alta taxa global de metástases, o prognóstico no OC canina é ruim. Com o tratamento consistindo em amputação e quimioterapia de acompanhamento (adjuvante), o intervalo livre de doença e os tempos de sobrevida global são tipicamente 291 e 284 dias, respectivamente. Como as alternativas terapêuticas pouco evoluíram nas últimas décadas, é urgente que surjam novos avanços no tratamento do OC(²²).

As mutações de genes supressores de tumores estão potencialmente relacionadas com a proliferação e migração de células neoplásicas, ocasionando as metástases(²³). Os agentes terapêuticos ideais são aqueles capazes de reduzir a proliferação e induzir apoptose nas células tumorais, reduzindo seu potencial maligno e favorecendo a sobrevida dos animais(¹⁸).

O presente estudo teve por objetivo investigar a ação do extrato etanólico da Curcuma longa L. (EEA) proveniente da região de Mara Rosa, em células de osteossarcoma canino e analisar a expressão de biomarcadores na progressão desta neoplasia.

Material e métodos

O experimento foi desenvolvido no Laboratório Multiusuário de Avaliação de Moléculas, Células e Tecidos, na Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás.

Obtenção do extrato etanólico do açafrão - EEA (Curcuma longa L.)

Foi utilizado um extrato etanólico de açafrão preparado anteriormente em outros experimentos deste grupo de pesquisa(²⁴). Os rizomas da Curcuma longa L. foram provenientes da Cooperativa de Produtos do Açafrão de Mara Rosa (Cooperaçafrão), localizada no Município de Mara Rosa, estado de Goiás, Brasil.

O processamento de obtenção do extrato bruto iniciou-se com a retirada dos rizomas da terra, com posterior lavagem e secagem em estufa para serem processados. Posteriormente, 100 g do material seco e triturado foi adicionado a 1000 ml de etanol absoluto, que em seguida passou por percolação a frio. O sobrenadante foi filtrado e o solvente evaporado em rotoevaporador (IKA® RV 05 Basic)(²⁵).

Análises prévias revelaram a composição do extrato utilizado nesta pesquisa(²⁴). O EEA apresentou teor médio de 16,7% de curcumina em sua composição, conforme mensurado por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) fluorescente. O teor total de compostos fenólicos, obtido por meio de curva padrão de ácido gálico (equivalente em ácido gálico - EAG), foi determinado em 691,49 mg de EAG/100 g. Por meio da medida da capacidade de descoloração do reagente DPPH (2,2 difenil-1-picrilhidrazil), obteve-se a capacidade de o extrato de sequestrar radicais livres, calculada com a utilização de um reagente padrão (Trolox) equivalente à vitamina E. Assim, O EEA possui atividade antioxidante de 18,45 μM Trolox/g amostra), a percentagem de descoloração do DPPH é de 55% e a IC₅₀ (18,1 μg/mL).

O extrato bruto obtido foi armazenado em refrigerador, com todas as etapas protegidas da fotodegradação.

Cultivo celular

As células de osteossarcoma osteogênico metastático canino (D-17, BCRJ 0276, lote 000573, passagem 239, espécie Canis familiaris), originárias da ATCC (American Type Culture Collection -Manassas, VA, USA), foram adquiridas do Banco de Células do Rio de Janeiro (UFRJ -Rio de Janeiro, Brasil). As células foram cultivadas em meio de cultura Dulbecco modificado de Eagle (DMEM Thermo Fischer, Waltham, MA, EUA) enriquecido com 10% de soro fetal bovino (SFB), penicilina e estreptomicina (10.000 U.I./ml -10 mg/ml), anfotericina B e L glutamina (todos os reagentes da Cultilab, Campinas, Brasil) e mantidas em incubadora umidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO₂.

Ensaio da viabilidade e citotoxicidade celular

Ao término da etapa de cultivo, as células foram quantificadas em câmara de Neubauer e semeadas em placas de 96 poços com 200 μL de meio DMEM, na concentração de 1x10⁴ por poço. As placas foram mantidas em incubadora umidificada a 37ºC e atmosfera de 5% de CO₂, por 24 horas. Depois, o meio foi desprezado e os poços tratados ou não com o EEA diluído em 1% de DMSO (dimetil sulfóxido). Foram preparadas diferentes diluições do extrato nas concentrações de curcumina de 0, 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM e 1000 μM (Tabela 1), considerando a massa molecular da curcumina (368,38g/mol) e sua a concentração no EEA de 16,7%. As células foram expostas ao EEA nos tempos de 24, 48 ou 72 horas. O grupo controle (GC) ou negativo foi tratado unicamente com DMSO. Os poços foram tratados de forma aleatória e a técnica foi realizada em quintuplicata, com três experimentos independentes.

Tabela 1
Estratégia de diluição do extrato etanólico de açafrão (Curcuma longa, L.) em diferentes concentrações molares de curcumina, conforme opeso molecular (368,38 g/mol) e o teor de curcumina do extrato (16,7%)(²⁴). DMSO - dimetil sulfóxido, diluente do extrato bruto. DMEM - meio de cultura Dulbecco modificado de Eagle.

Concentração de Curcumina (µM)	Extrato Bruto semi-sólido (mg)	Solução de Diluição
		DMSO (µL)	DMEM (µL)
0	0	4000	6000
10	6,0	4000	6000
20	12,0	4000	6000
50	31,0	4000	6000
100	59,0	4000	6000
1000	590,0	4000	6000

Após o período de tratamento, realizou-se a técnica de redução do sal de tetrazólio (MTT) visando o complexo enzimático piruvato desidrogenase, presente na matriz de mitocôndrias. O meio foi descartado e adicionados 10μl de tetrazólio (MTT (3-(4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-diphnyl-2H-tetrazólio) em cada poço. As placas foram incubadas por três horas. A fim de encerrar a reação, acrescentou-se 50μl de dodecil sulfato de sódio (SDS - Vivantis Biochemical) a 10% diluído em HCl (0,01 N) por poço e as placas permaneceram incubadas por 24 horas em temperatura ambiente. A densidade óptica foi quantificada em espectrofotômetro (Awareness Technology Ine/ Stat Fax 2100, 425 nm - 540 nm, Palm City, FL, EUA). Utilizaram-se três comprimentos de onda para melhor discriminar os valores de absorbância obtidos no espectrofotômetro, pois o tamanho das moléculas, densidade, diluição e outros fatores podem influenciar as propriedades físicas das amostras e, assim, interferir diretamente no comprimento de onda ideal(²⁶).

A viabilidade celular foi determinada pela equação:

$$VC=\frac{{\mathrm{abs}}_{\text{tratamento}}}{{\mathrm{abs}}_{\text{controle}}}\times 100$$

onde VC é a viabilidade celular e abs é a absorbância. Os dados utilizados foram provenientes de três estudos independentes. As comparações foram conduzidas utilizando análise de variância e o teste de Tukey, com nível de 5% de significância, software R e pacote R easyanova, como descrito anteriormente(¹⁸).

Imunocitoquímica

As células D-17 foram semeadas em lâminas de cultura com câmara Falcon™ (Corning, Glendale, EUA), na concentração de 1x10⁴, cultivadas e expostas ao EEA por 48 horas, nas concentrações estudadas (0, 10, 20, 50, 100 e 1000 μM). Após este período, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 30 minutos.

Todas as etapas da técnica foram executadas utilizando-se o processador automático Bond-Max (Leica Biosystems, Nussloch, Alemanha), com os reagentes: Bond Polymer Refine Detection, Bond Wash Solution, Bond Epitope Retrieval 1, Bond Dewax Solution e Bond Epitope Retrieval 2, Bond DAB (cromogênio 3,3’-diaminobenzidina) e hematoxilina. Os anticorpos utilizados foram o anti-Bcl-2, anti-p53 (SC71785 monoclonal de camundongo) e anti-Ki-67, em diluições de 1:500 em 1,5% de albumina sérica bovina (BSA). Um grupo isento do anticorpo primário foi utilizado como controle da reação.

Para avaliar a imunomarcação, foi feita a contagem total de células em cinco campos distintos e a porcentagem de células positivas marcadas pelo anticorpo, procedimento adaptado de Fedchenko & Reifenrath(²⁷). Para estabelecer o escore da intensidade da expressão (EIE), foi feita análise semiquantitativa às cegas, com a utilização dos escores de 0 a 3, conforme astonalidades de uma escala colorimétrica(¹⁸) (Figura 1). A relação de células marcadas positivamente (RCMP) foi calculada pela razão entre o número de células marcadas e o número total de células, multiplicado por 100. Com esse valor, atribuíram-se as categorias 0 para 0%; 1 para <1%; 2 para 1-10%, 3 para 11-33%, 4 para 34-66% e 5 para >67%. Em seguida, adotou-se o sistema de pontuação combinada semiquantitativa (SPCS), definido pelo somatório da RCMP com o EIE, após o cálculo da média, desvio padrão e exclusão de outliers. A análise estatística foi realizada por meio da análise de variância e o teste Kruskal-Wallis, p <0,05, software R^© (R Core Team) e pacote R easyanova(¹⁸).

Figura 1
Tons de referência para a atribuição dos escores às diferentes intensidades de marcação por anticorpos na análise imunocitoquímica. Adaptado de Soares et al.(¹⁸), sob permissão.

Resultados

Ensaio da viabilidade e citotoxicidade celular

O experimento foi realizado com diferentes concentrações e tempos de exposição para determinar se o EEA poderia modificar a viabilidade das células D-17. As médias dos tratamentos e os tempos de exposição foram comparadas, sendo possível observar que o composto exibiu efeito proliferativo significativo exponencial até alcançar a concentração de 50 µM. Ao ultrapassar essa concentração, ocorreu declínio no efeito proliferativo, não havendo diferença estatística entre os tempos de exposição ao extrato, como evidenciado na Tabela 2.

Tabela 2
Média dos valores de viabilidade celular obtidas pelas médias da espectrofotometria em ondas 496, 540 e 570 nm para as células de osteossarcoma canino da linhagem D-17, tratadas com diferentes concentrações do extrato etanólico de açafrão (Curcuma longa, L.) em diferentes tempos de exposição.

Exposição (h)	Concentração (µM)	Viabilidade Celular (%)	Tukey
24 AB	0	100,00	d
	10	321,48	d
	20	625,28	cd
	50	3654,62	a
	100	2097,53	b
	1000	1262,41	c
48 A	0	100,00	d
	10	313,56	d
	20	297,94	d
	50	3945,09	a
	100	3000,44	b
	1000	1831,80	c
72 B	0	100,00	c
	10	197,88	c
	20	267,97	c
	50	3859,52	a
	100	2672,73	b
	1000	542,51	c

Este efeito pôde ser mais bem compreendido quando se obteve uma média dos valores da proliferação celular nos três tempos experimentais em relação às concentrações utilizadas, conforme mostrado na Tabela 3.

Tabela 3
Média dos valores de viabilidade celular obtidos por meio da absorbância gerada pela média da espectrofotometria em ondas 496, 540 e 570 nm para as células de osteossarcoma canino da linhagem D-17, do grupo controle e tratadas com 0, 10 µM, 20 µM, 50 µM, 100 µM ou 1000 µM do extrato etanólico de açafrão (Curcuma longa, L.).

Concentração (µM)	Viabilidade Celular (%)	Tukey
0	100,00	d
10	277,65	d
20	397,07	d
50	3819,74	a
100	2590,23	b
1000	1212,24	c

Para possibilitar melhor compreensão de processos celulares envolvidos na progressão da viabilidade celular observada, utilizou-se a imunocitoquímica automatizada. No caso do Bcl-2, marcador anti-apoptótico, notou-se que a intensidade de expressão, medida por meio do SPCS de Fedchenko & Reifenrath¹², não se alterou significativamente com o aumento da concentração do extrato, atingindo seu máximo em 50 µM de curcumina (Tabela 3 e Figura 2). Já no caso da proteína p53 mutante, incapaz de controlar a proliferação celular independente, também houve elevação progressiva, até o máximo atingido na concentração no EEA de 1000 µM de curcumina (Tabela 4 e Figura 2). Este comportamento foi idêntico ao observado em relação à Ki-67, um marcador de malignidade tumoral (Tabela 3 e Figura 2).

Tabela 4
Escores atribuídos e sistema de pontuação combinada semiquantitativa de Fedchenko & Reifenrath¹² em lâminas com células de osteossarcoma canino da linhagem D-17 tratadas com o extrato etanólico de açafrão (Curcuma longa, L.). As células foram marcadas pelos anticorpos: anti Bcl-2, KI-67 ou p53 mutada e contra coradas com hematoxilina, tendo sido realizadas análises estatísticas independentes (análise de variância e o teste Kruskal-Wallis, p <0,05) para cada anticorpo. Imunocitoquímica automatizada em equipamento Bond Max.

Anticorpo	Concentração de Curcumina no Extrato Etanólico de Açafrão (µM)	Relação de Células Marcadas Positivamente	Escore da Intensidade de Expressão	Sistema de Pontuação Combinada Semiquantitativa
Bcl-2	0	5	2.1029a	7.1029a
	10	5	1.8750a	6.8750a
	20	5	1.4444a	6.4444a
	50	5	2.7500a	7.7500a
	100	5	2.5000a	7.5000a
	1000	5	2.2250a	7.1000a
p53	0	5	1.0441b	6.0441b
	10	5	1.4500ab	6.4500ab
	20	5	1.1111b	6.1111b
	50	5	1.6750ab	6.6750ab
	100	5	1.9000ab	6.9000ab
	1000	5	2.9000a	7.9000a
Ki-67	0	5	1.5588ab	6.5588ab
	10	5	0.8250b	5.8250b
	20	5	1.5000ab	6.5000ab
	50	5	2.2500a	7.2500a
	100	5	2.1500ab	7.1500ab
	1000	5	2.6000a	7.6000a

Figura 2
Imagens de células de osteossarcoma canino da linhagem D-17 tratadas com diferentes concentrações de extrato etanólico de açafrão (Curcuma longa, L.) e marcadas com anticorpos anti Bcl-2, Ki-67 ou p53 mutada e contra coradas com hematoxilina. Não há diferença na intensidade de marcação do anticorpo Bcl-2. No entanto, houve aumento da intensidade de marcação de Ki-67 e de p53 mutada com o aumento da concentração do extrato, mostrando efeito positivo na progressão da neoplasia. Imunocitoquímica automatizada com equipamento Bond Max. As barras correspondem a 100 µm. Os escores atribuídos foram submetidos a análise estatística e descritos previamente na Tabela 3.

Discussão

Neste trabalho, utilizou-se o extrato etanólico da Curcuma longa L (açafrão) e obtiveram-se resultados relevantes. Além de não haver estudos pregressos deste extrato sobre células de osteossarcoma canino, também não há pesquisas que mostram possíveis efeitos proliferativos nesta ou em outra linhagem de células cancerígenas, pois os relatos em destaque sobre extrato etanólico da C. longa L. se referem quase exclusivamente a seus efeitos benéficos. Este fato provavelmente está relacionado à baixa toxicidade da planta e seus componentes isolados, o que é corroborado pelos relatos de um estudo retrospectivo da toxicidade do açafrão e de seu principal componente, a curcumina, nos quais a administração em humanos de 3,6 g de curcumina por via oral por dia durante seis meses ou de 4 g extrato de açafrão fermentado durante 12 semanas foi segura, sem a ocorrência de toxicidade(²⁸).

Em oposição ao que foi descrito nesta pesquisa, são abundantes os relatos que destacam a eficácia contra o câncer dos constituintes do açafrão, particularmente a curcumina. Os resultados, em geral, têm sido bastante favoráveis e promissores, uma vez que, além da atividade antiproliferativa e anticancerígena em estudos pré-clínicos, raros efeitos adversos tem sido descritos em células normais (²⁸-³⁰). Em contraste com os achados citados acima, os resultados do ensaio de viabilidade celular pela redução do sal de tetrazólio (Figura 2) evidenciam o efeito proliferativo provocado pelo EEA nas células D-17. O grupo que apresentou maior percentagem de viabilidade celular foi o que recebeu 50 µM, tendo havido declínio na proliferação celular em concentrações mais elevadas. O tempo de exposição do extrato não influenciou os resultados obtidos.

Em virtude deste grupo haver relatado em trabalho anterior que a curcumina provocou apoptose extrínseca em células D-17(¹⁸), esperava-se neste experimento efeito similar com o EEA em células da mesma linhagem, o que não se concretizou. Já foi descrito que a curcumina pode induzir apoptose intrínseca e extrínseca em diferentes linhagens de células tumorais, além de induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), o que resulta em regulação positiva dos receptores de apoptose na membrana da célula tumoral; a curcumina também pode regular a expressão e a atividade de p53 nativa, que inibe a proliferação de células tumorais e aumenta a apoptose, além de apresentar potente efeito inibitório sobre a atividade de NF-κB e COX-2, que estão envolvidos na superexpressão de genes anti-apoptóticos, como Bcl-2(³¹). Mais especificamente, em células de osteosarcoma MG-63 a curcumina inibiu o crescimento e induziu a apoptose por meio de ativação da caspase-3 e redução os níveis de expressão de Bcl-2, além de haver induzido autofagia (³²). Todavia, diante dos resultados obtidos, resta evidente que a morte celular, em qualquer de suas formas, não ocorreu de forma significativa após a exposição das células de osteossarcoma canino ao EEA.

É importante ressaltar que, nesta pesquisa, utilizou-se o extrato etanólico do açafrão, que é constituído por vários compostos. Embora alguns componentes majoritários tenham seus mecanismos definidos, os demais produtos fitoquímicos presentes podem apresentar mecanismos desconhecidos, que podem exibir efeitos adversos ou toxicidade exponencial. Ademais, é prudente e razoável considerar que pode ocorrer entre os metabólitos do extrato a possibilidade de sinergismo, antagonismo ou ativação de rotas metabólicas que ativem genes com potencial de favorecer a progressão de neoplasias(³³,³⁴) ou apresentarem efeitos protetores às células tumorais.

Conquanto os efeitos farmacológicos e mecanismos de compostos isolados do açafrão sejam predominantemente relatados como benéficos, isso não deve determinar que o extrato seja seguro nas mesmas condições. Os presentes resultados comprovam esta afirmação, dado que o EEA causou proliferação em células cancerígenas, ainda que seja rico em curcumina, composto que, isoladamente, comprovou sua eficácia contra algumas linhagens de células de câncer pela via apoptótica STAT3. A curcumina também inibiu a proliferação de modo concentração-dependente em células de adenocarcinoma papilar de tireoide, após receberem tratamento de 0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM e 80 μM por 24 horas.(³⁵)

Com relação à possibilidade de o EEA haver apresentado efeito protetor para as células tumorais, é importante salientar que a quantidade de fenóis totais presentes no extrato foi calculada em 691,49 mg de EAG/100 g. Este grupo de pesquisa recentemente demonstrou, em células endoteliais de coronária humana, o efeito protetor do extrato etanólico da casca do pequi (Caryocar brasiliense, Camb.)(³⁶), cujo teor total de fenóis foi calculado em 696,91 mg de EAG/100 g, ou seja, muito similar ao do EEA utilizado no presente experimento. Ainda que a maior quantidade de fenóis no açafrão seja composto pelos curcuminóides, observam-se também compostos fenólicos de comprovado poder antioxidante, como o ácido caféico, o ácido cumárico e a quercitina(²¹), todos presentes no extrato de pequi mencionados anteriormente.

Os dados obtidos por imunocitoquímica mostraram que a proteína p53 mutante foi marcada fortemente, especialmente no grupo tratado com 1000 μM. O mesmo aconteceu com o resultado da Ki-67. A técnica de imunocitoquímica automatizada permitiu avaliar a expressão das proteínas p53, Ki-67 e Bcl-2 por meio de contagem semiquantitativa e qualitativa, tendo sido validada por Fedchenko & Reifenrath e replicada desde então por pesquisadores da área(²⁷,³⁷). Enfatiza-se que os resultados da imunocitoquímica não tem objetivo de nova contagem do total de células, mas de determinar o escore para o percentual de células marcadas pelos respectivos anticorpos e inferir diferenças de expressão das proteínas estudadas entre os grupos experimentais. Dessa forma, o número de células não é fator limitante para essa análise, mas sim o percentual marcado positivamente e a intensidade da marcação.

Os resultados são sugestivos que houve participação da via de sinalização da proteína p53 mutada, marcada em todos os grupos experimentais, na proliferação celular mostrada nos resultados de MTT. \a forma As mutações no gene TP53 resultam em uma proteína p53 estruturalmente alterada, que perde sua capacidade de reparar o DNA ou de induzir a morte da célula tumoral(³⁸). Sendo assim, a expressão da forma mutante da proteína p53 é um valioso marcador de proliferação e progressão tumoral, pois está virtualmente presente em todos os tipos de câncer(³⁹).

Os resultados da expressão de Ki-67 também reiteram o grau de malignidade das células D-17 utilizadas neste estudo. Esta proteína é um biomarcador de referência do potencial de malignidade celular em diferentes tipos de neoplasias, incluindo células de osteossarcoma canino(³⁷)(⁴⁰). Neste diapasão, validado em trabalhos anteriores, que Ki-67 é manifesto em células malignas proliferativas, abordados nas pesquisas como marcador nuclear.(⁴¹,⁴²)

Já os achados em relação à proteína Bcl-2 não estão em consonância com os anteriores, pois apesar do grupo tratado com 50 μM demonstrar uma quantidade maior de expressão da proteína Bcl-2, sua significância não foi confirmada em análises estatísticas, (Figura 3). É provável que sua expressão não tenha sido maior devido a mecanismos que ainda não estão elucidados, mas que pode ter relação com os constituintes presentes no extrato, que exercem efeitos protetores e antiapoptóticos para as células malignas em estudo. Bcl-2 é crucial na regulação da apoptose celular, pois codifica uma proteína que integra a membrana mitocondrial e inibe a morte celular por apoptose, além de ativar a proliferação celular(⁴³,⁴⁴).

O desenlace deste estudo vai de encontro a resultados de pesquisas com delineamentos semelhantes, cujo objetivo foi avaliar a citotoxicidade de extratos de outras plantas sobre células de câncer, com avaliação da proliferação celular e expressão de oncogenes(³⁷,⁴⁰,⁴⁵,⁴⁶). Diante disso, reafirma-se a necessidade de precauções quanto à utilização de plantas e seus derivados, uma vez que tais produtos têmuso amplamente difundido como fitoterápicos, dos quais se inferem popularmente eficácia e segurança de forma instantânea, pelo fato de serem orgânicos e nativos. Contudo, metabólitos de plantas podem provocar efeitos ainda desconhecidos, como toxicidade subaguda e crônica, inclusive resultando em carcinogênese(³⁴,⁴⁷) ou proliferação de clones celulares atípicos já existentes, como aqui relatado.

O presente estudo é o primeiro a demonstrar as propriedades proliferativas do extrato do açafrão sobre células de osteossarcoma canino. Este resultado é impactante e estabelece perspectivas para que mais pesquisas com compostos naturais sejam realizadas, com o propósito de elucidar os mecanismos de ação e vias de transdução de sinal envolvidas, visando promover maior eficácia e segurança no uso de plantas e seus subprodutos com finalidade terapêutica, particularmente o açafrão de Mara Rosa - GO.

Conclusão

Os resultados mostraram que o tratamento de células de osteossarcoma canino com extrato etanólico de açafrão resulta na proliferação in vitro de células de osteossarcoma canino D-17, bem como no aumento da expressão de proteínas com importante participação na oncogênese e malignidade tumoral. Por consequência, deve-se exercer extrema cautela e serem realizados mais estudos para compreender melhor os mecanismos da utilização do açafrão como tratamento em osteossarcoma, tanto na espécie canina quanto em humanos.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Out 2022
• Data do Fascículo
  2022

Histórico

• Recebido
  03 Maio 2022
• Aceito
  05 Ago 2022
• Publicado
  15 Set 2022