Embriogênese somática indireta em explantes foliares de Coffea arabica L. CV. Obatã

Indirect somatic embryogenesis in Coffea arabica L. CV. Obatã

AGRONOMIA

Embriogênese somática indireta em explantes foliares de Coffea arabica L. CV. Obatã^*

Indirect somatic embryogenesis in Coffea arabica L. CV. Obatã

Anna Lygia de Rezende Maciel^I; Moacir Pasqual^II; Alba Regina Pereira^IV; Juliana Costa de Rezende^II; Adriano Bortolotti da Silva^I; Leonardo Ferreira Dutra^III

^IEngenheiro Agrônomo, Mestrado em Fitotecnia

^IIEngenheiro Agrônomo, Dr., Professor Titular/UFLA

^IIIEngenheiro Agrônomo, Dr., Bolsista recém-doutor/CNPq

^IVEstudante de Agronomia da UFLA

RESUMO

Objetivou-se, com este trabalho, estudar a embriogênese somática indireta em Coffea arabica L. cv. Obatã, incluindo as etapas de indução de calos, diferenciação, regeneração e formação de embriões. Segmentos foliares retirados de plantas em condições de campo foram desinfestados com álcool 70% por 1' e hipoclorito de sódio 1% durante 15' e inoculados em meio IC (indução de calos) suplementado de 2,4-D (0, 1, 2 e 4 mg.L^-1) e Cinetina (0, 2, 4 e 8 mg.L^-1). Posteriormente, os calos foram transferidos para o meio DC (diferenciação de calos), adicionado de diferentes concentrações de 2,4-D (0, 1, 2 e 4 mg.L^-1) e BAP (0, 2, 4 e 8 mg.L^-1); em seguida, durante a etapa de regeneração, os calos embriogênicos friáveis foram inoculados em meio R suplementado de BAP (0, 2, 4 e 6 mg.L^-1) e sacarose (0, 15, 30, 45 e 60 g.L^-1). Os meios de cultura utilizados tiveram pH ajustado para 5,6 ± 1 antes de serem autoclavados. Os experimentos foram mantidos em sala de crescimento a 26 ± 1ºC. Durante as etapas de indução e diferenciação de calos, os experimentos ficaram em condições de obscuridade, e na etapa de regeneração, os experimentos foram mantidos sob fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 35 µmol.m^-2.s^-1. Concluiu-se que a combinação entre 4 mg.L^-1 de 2,4-D e 2 mg.L^-1 de cinetina favoreceu a indução de calos primários mistos. Maior freqüência de calos embriogênicos friáveis ocorreu na presença de BAP (8 mg.L^-1), associado ou não ao 2,4-D, e maior número de embriões por explante foram obtidos quando utilizou-se sacarose (30 g.L^-1) e BAP (3 mg.L^-1).

TERMOS PARA INDEXAÇÃO: Café, calos, embriões somáticos, cultura de tecidos.

ABSTRACT

It was aimed with this work to study the indirect somatic embryogenesis in Coffea arabica L. cv. 'Obatã', including the steps of induction, differentiation and regeneration of plants. Leaf segments withdrawn from plants under field conditions were disinfected with 70% alcohol for 1', 1% sodium hypochlorite for 15'and inoculated in 'CI' medium (callus induction) supplemented with 2,4 D (0, 1, 2 and 4 mg.L^-1) and kinetin (0, 2, 4 and 8 mg.L^-1). Later, the callus were transferred to the 'CD' medium (callus differentiation) to which was added 2,4-D (0, 1, 2 and 4 mg.L^-1) and BAP (0, 2, 4 and 8 mg.L^-1). During the regeneration step, friable embryogenic callus were inoculated in 'R' medium supplemented with BAP (0, 2, 4 and 6 mg.L^-1) and sucrose (0, 15, 30, 45 and 60 g.L^-1). The culture media utilized had their pH adjusted to 5.6 ± 1 before being autoclaved. The experiments were kept in growth room at 26 ± 1ºC. Over the steps of callus induction and differentiation, the experiments were carried out in dark conditions and at the regeneration step the experiments were carried out under 16-hour photoperiod and light intensity of 35 µmol.m^-2.s^-1. It was observed that the combination of 2,4-D and kinetin favors the induction of primary callus. High frequency of friable embryogenic callus was observed with BAP (8 mg.L^-1), combined or not with 2,4-D, and greater number of embryos per explant, when sucrose (30g.L^-1) and BAP (3 mg.L^-1) was utilized.

INDEX TERMS: Coffee, callus, somatic embryos, tissue culture.

INTRODUÇÃO

A cafeicultura é uma atividade de elevada importância no cenário do agronegócio brasileiro.

A embriogênese somática em Coffea é um importante método de multiplicação de plantas-elite in vitro, em larga escala, apresentando um grande potencial a ser explorado, e capaz de maximizar a propagação do cafeeiro, tanto de cultivares já recomendadas para plantio como de híbridos vindos de programas de melhoramento genético. Apresenta-se também como uma técnica conjunta aos trabalhos de transformação genética de plantas.

Os primeiros trabalhos conhecidos de embriogênese somática no gênero Coffea foram realizados por Starisky (1970), que obteve rápida proliferação de calos nas espécies C. arabica e embriões e plântulas em explantes de C. canephora. Desde então, têm-se desenvolvido pesquisas sobre a embriogênese somática no gênero Coffea em diversos países (Hermann & Hass, 1975; Sondahl, 1978; Lanaud, 1981; Pierson et al., 1983; Boxtel & Berthouly, 1996; Berthouly & Michaux-Ferriere, 1996; Cordeiro, 1999; Sreenath, 2000).

Segundo Cordeiro (1999), a embriogênese somática em Coffea apresenta tipos distintos de calos durante a fase de indução. Os CPN's (calos primários nodulares) referem-se às formações globulares compactas surgidas em parte ou, menos freqüentes, na totalidade dos bordos dos explantes. Os CPM's (calos primários mistos), além da reação globular, apresentam formações amorfas de células alongadas e caracterizam-se pelo crescimento visivelmente mais rápido. Os CE's (calos embriogênicos) são calos primários contendo até 20 embriões/explante, e quando esses apresentam agregados celulares granulosos, facilmente destacáveis e de coloração amarelo-creme, são, então, caracterizados como CEF's (calos embriogênicos friáveis).

A implementação da embriogênese somática ocorre a partir de explantes de origem diversa, como: fragmentos de ramos ortotrópicos, ramos plagiotrópicos, folhas e tegumentos de óvulos, destacando-se as folhas, por serem mais abundantes e de fácil desinfestação (Dublin, 1991).

A sacarose tem sido a fonte de carboidrato mais usada na embriogênese somática, embora outros mono e dissacarídeos possam ser utilizados. A concentração de sacarose influencia nos processos de iniciação e diferenciação dos embriões somáticos (Guerra et al., 1999).

As auxinas e citocininas têm papel fundamental na embriogênese somática de várias espécies de plantas. Algumas espécies necessitam de meio suplementado com ácido giberélico ou ácido abscísico para o desenvolvimento de embriões somáticos, enquanto outras não precisam dessa suplementação, uma vez que o processo de indução foi estabelecido.

A embriogênese somática indireta requer a determinação de células diferenciadas, a proliferação de calos e a indução de células embriogênicas determinadas, dependendo da ação de reguladores de crescimento, não apenas para a retomada da atividade mitótica, mas também para a determinação do estado embriogênico (Sondahl et al., 1985; Williams & Maheswaran, 1986). Contudo, duas estratégias têm sido utilizadas com o objetivo de obtenção de tecido embriogênico em Coffea: a primeira envolve o cultivo de explante sobre um único meio de cultura, suplementado apenas com citocinina (Yasuda et al., 1995), ou a combinação de auxina e citocinina (Pierson et al., 1983); a segunda estratégia utiliza o cultivo de explantes em um meio primário ou de indução, seguido da transferência dos explantes para o meio secundário, tido como de diferenciação (Dublin, 1984) ou de acondicionamento, que difere do primeiro por possuir menor razão auxina/citocinina (Noriega & Sondahl, 1993; Sondahl et al., 1985; Zamarripa et al., 1991).

O cafeeiro, como outras espécies lenhosas, libera substâncias fenólicas e, por essa razão, deve-se adicionar ao meio de cultura substâncias antioxidantes, tais como: carvão ativado, polivinilpirrolidene (PVP), ácido ascórbico e ácido cítrico (Andrade, 1998).

Objetivou-se com este trabalho estudar a embriogênese somática indireta em C. arabica L. cv. Obatã, incluindo as etapas de indução de calos, diferenciação ou condicionamento, regeneração e formação de embriões.

MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais do Departamento de Agricultura da Universidade Federal de Lavras (UFLA), em Lavras – MG.

Os dados obtidos durante as todas etapas deste trabalho foram submetidos à análise estatística, com aplicação do teste de F a 5% de probabilidade, e as médias analisadas por regressão polinomial.

Etapa 1: Concentrações de 2,4-D e Cinetina na indução de calos da cultivar Obatã.

O meio de cultura semi-sólido utilizado foi o "IC", de indução de calos (Tabela 1), com pH ajustado para 5,6 ± 1 antes de ser autoclavado a 120ºC, 1,2 atm, durante 20 minutos.

Foram utilizados como explantes, folhas jovens de ramos plagiotrópicos de plantas de C. arabica L. cv. Obatã, mantidas no campo experimental do Setor de Cafeicultura da UFLA. Após a coleta, as folhas foram desinfestadas com álcool 70% por 1 minuto e hipoclorito de sódio 1% por 15 minutos. Posteriormente, em câmara de fluxo laminar horizontal, essas foram lavadas três vezes consecutivas com água destilada autoclavada e mantidas em solução de 600 mg.L^-1 de ácido ascórbico até serem inoculadas em meio de cultura e transferidos para sala de crescimento sob condições de obscuridade, com temperatura de 26 ± 1ºC.

Após a eliminação da nervura central, os explantes foram excisados em tamanhos de 1 cm² aproximadamente, das extremidades laterais, basais e apicais das folhas. Posteriormente foram inoculados com o lado abaxial voltado para a superfície do meio nutritivo, acrescido de 600 mg.L^-1 de ácido ascórbico, contido em tubos de ensaio (150x25mm) com 15 ml de meio cada.

Os tratamentos constituíram-se de diferentes concentrações de 2,4-D (0, 1, 2 e 4 mg.L^-1) e Cinetina (0, 2, 4 e 8 mg.L^-1).

O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4x4, com 4 repetições e 10 explantes por parcela.

As avaliações foram realizadas 90 dias após a instalação do experimento, analisando as seguintes variáveis: % de calos cicatriciais (CC), % de calos primários nodulares (CPN) e % de calos primários mistos (CPM).

Etapa 2: Concentrações de BAP e 2,4-D na diferenciação de calos da cultivar Obatã.

Durante a etapa de diferenciação dos calos, utilizou-se para a instalação do experimento o meio nutritivo semi-sólido "DC" de diferenciação ou condicionamento de calos (Tabela 1), com pH aferido para 5,6 ± 1 e distribuído em frascos de 100 ml, vedados com tampas de polipropileno. Em seguida, o meio foi autoclavado a 120ºC, 1,2 atm, durante 20 minutos.

Calos Primários Mistos (CPM), com aproximadamente 1 cm de diâmetro, provenientes de segmentos de folhas da cultivar Obatã foram transferidos (inteiros) para meio de cultura "DC", acrescido de diferentes concentrações de BAP (0, 2, 4 e 8 mg.L^-1) e 2,4-D (0, 1, 2 e 4 mg.L^-1) e transferidos para sala de crescimento sob condições de obscuridade, com temperatura de 26 ± 1ºC.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4x4, com 4 repetições e 2 explantes por parcela.

As avaliações foram realizadas 90 dias após a instalação dos experimentos, sendo analisadas as características: % de calos embriogênicos (CE) e % de calos embriogênicos friáveis (CEF).

Etapa 3: Concentrações de BAP e sacarose na formação de embriões a partir de calos da cultivar Obatã.

O meio de cultura semi-sólido utilizado para regeneração de calos foi o "R" (Tabela 1), com pH aferido para 5,6 ± 1 e distribuído em frascos de 100 ml, vedados com tampas de polipropileno. Em seguida, o meio foi autoclavado a 120ºC, 1,2 atm, durante 20 minutos.

Calos embriogênicos friáveis (CEF's) foram inoculados assepticamente em meio nutritivo e transferidos para sala de crescimento com temperatura de 26ºC ± 1, fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 35 m mol.m^-2.s^-1.

Os tratamentos constituíram-se de diferentes concentrações de BAP (0; 2; 4 e 6 mg.L^-1) e sacarose (0, 15, 30, 45 e 60 g.L^-1).

O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4X5, com 3 repetições e 250 mg de calos embriogênicos friáveis por parcela.

As avaliações foram realizadas 90 dias após a instalação do experimento, em todos os calos existentes, determinando-se o número de embriões nos estádios globular, torpedo e cotiledonar.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A contaminação causada por fungos, bactérias e a oxidação por substâncias fenólicas são fatores limitantes no estabelecimento in vitro de explantes foliares de C. arabica provenientes de material coletado em campo. Por meio do controle fitossanitário realizado nas plantas selecionadas no campo e do processo de assepsia em laboratório, pode-se afirmar que houve 75% de eficiência no controle da contaminação e, com a adição de ácido ascórbico (600 mg.L^-1) em meio de cultura, não houve ocorrência de explantes oxidados (dados não mostrados).

Etapa 1: Concentrações de 2,4-D e Cinetina na indução de calos na cultivar Obatã.

• Porcentagem de Calos Cicatriciais

Analisando-se as curvas de regressão para essa variável, observa-se na Figura 1 que houve maior reação cicatricial em explantes foliares da cultivar Obatã, quando adicionou-se ao meio de cultura cinetina nas concentrações 2, 1 e 4 mg.L^-1, respectivamente. O 2,4-D promoveu inibição na formação desses calos, mesmo na menor concentração utilizada (2 mg.L^-1).

Comparando-se as três curvas, pode-se notar que a adição de 2 mg.L^-1 de cinetina ao meio de cultura, sem a utilização de 2,4-D, apresentou maior freqüência de CC's. Resultados similares foram obtidos por Cordeiro (1999), que observou uma reação cicatricial em freqüência de cerca de 20% em explantes foliares dos genótipos Catimor e Diplóide DH₃ em meio sem auxina. Santos et al. (2000) obtiveram explantes sem qualquer tipo de reação e/ou calo cicatricial em meios de cultura que continham apenas citocinina para as cultivares Catimor e Catuaí Vermelho.

• Porcentagem de Calos Primários Nodulares

Na ausência de cinetina, houve um decréscimo linear associado ao aumento das concentrações de 2,4-D (Figura 2). Para as concentrações de cinetina 2 e 4 mg.L^-1, ocorreu um decréscimo significativo na freqüência de CPN's quando adicionaram-se ao meio de cultura concentrações crescentes de 2,4-D. Esses resultados assemelham-se aos obtidos para a característica anterior.

Nesse caso, o fato de a auxina promover inibição na formação de CPN's assemelha-se aos resultados obtidos por Cordeiro (1999), quando os explantes foliares foram cultivados em meio suplementado apenas com citocinina. No entanto, Santos et al. (2000), estudando vários genótipos de Coffea, observaram resultados contraditórios, em que a adição simultânea de auxina e citocinina no meio de cultura MS induziu o aparecimento de CPN's.

• Porcentagem de Calos Primários Mistos

Maior porcentagem de CPM's (Figura 3) foi obtida com a utilização de 4,18 mg.L^-1 de 2,4-D combinado com 2 mg.L^-1 de cinetina, ou seja, a razão auxina/citocinina 2:1 proporcionou maior formação de CPM's em explantes foliares, correspondendo a uma freqüência de 80,5%.

Os resultados obtidos concordam com os de Cordeiro (1999), o qual verificou que explantes foliares de Catimor, ao serem submetidos a diferentes associações de meios de indução à calogênese, adicionados de 2,4-D, cinetina e BAP e em genótipos Apoatã e DH₃, utilizando-se a relação auxina/citocinina no meio primário, promoveram a formação de CPM's.

Os CPM's, além da reação globular, apresentam formações amorfas de células alongadas, que se caracterizam por crescimento visivelmente mais rápido. Os calos primários têm sido associados às células perivasculares (Berthouly & Michaux-Ferriere, 1996; Bieysse et al., 1993) e às do parênquima lacunoso do mesofilo (Pierson et al., 1983; Sondahl & Sharp, 1979). Segundo Berthouly & Michaux-Ferriere (1996), as células mesofílicas, ao retornarem a divisão celular, originam os calos primários, que podem conter duas distintas populações de células, uma constituída de células alongadas e vacuolizadas, e a outra, de pequenas células cilíndricas com citoplasma denso, ou seja, células embriogênicas.

Etapa 2: Influência das concentrações de BAP e 2,4-D na diferenciação de calos de C. arabica L. cv. Obotã

• Porcentual de Calos Embriogênicos

Conforme se observa na Figura 4, a maior freqüência de CE's, que corresponde aos calos embriogênicos de baixa freqüência (CEBF), foi obtida com a utilização de 1 mg.L^-1 de 2,4-D associado à concentração máxima de BAP (8 mg.L^-1), apresentando freqüência de 40%. Porém, resultados obtidos com 1 mg.L^-1 de 2,4-D na ausência da citocinina foram bastante satisfatórios, atingindo freqüência de 33% de CE's.

Berthouly & Michaux-Fierrere (1996), estudando genótipos de C. canephora, observaram que a adição de BAP em concentrações acima de 1,5m M favorece mais a diferenciação de células embriogênicas em relação a sua multiplicação, provavelmente por alterar a polaridade e o plano de divisão da célula (Williams & Maheswaran, 1986).

A relação auxina/citocinina e a utilização de BAP isoladamente promoveram a diferenciação em calos embriogênicos. Garcia & Menendez (1987) verificaram que a associação de 2,4-D e BAP induziu calos embriogênicos, durante a fase de diferenciação; em meio de cultura com a presença apenas de BAP, ocorreu embriogênese direta em baixa freqüência em Coffea. Contudo, Cordeiro (1999), estudando cultivares de C. arabica, verificou que calos embriogênicos foram produzidos, aos sete meses de indução, tanto na ausência quanto na presença de auxina; porém, as maiores freqüências desses calos foram observadas quando a auxina esteve presente na cultura primária associada à cinetina, seguida da repicagem para o meio com BAP combinado ou não com 2,4-D.

• Porcentagem de Calos Embriogênicos Friáveis

De acordo com a Figura 5, maiores freqüências de CEF's foram obtidas com a utilização de 1 mg.L^-1 de 2,4-D com concentrações crescentes de BAP, seguindo uma tendência linear, sugerindo, portanto, a possibilidade de incrementar concentrações de BAP acima de 8 mg.L^-1, com o objetivo de aumentar a freqüência de CEF's. Resultados semelhantes foram obtidos com a concentração de 8 mg.L^-1 de BAP sem a adição ao meio de cultura de 2,4-D

Segundo Sondahl & Sharp (1977), a ação combinada de auxina/citocinina é fundamental para obtenção de calos embriogênicos friáveis em Coffea, o que foi posteriormente comprovado por Garcia & Menendez (1987) em explantes foliares de Catimor. Os resultados obtidos no presente experimento foram semelhantes àqueles apresentados por Cordeiro (1999), que verificou um efeito negativo da auxina 2,4-D na freqüência de CEF's, sendo similares ao efeito inibidor de ANA em explantes foliares da variedade Typica, em meio contendo BAP (Yasuda, et al., 1995). A formação de CEF's foi obtida também por Tahara et al. (1994), adicionando ao meio de cultura apenas a citocinina BAP.

Contudo, Caligari & Shohet (1993) têm sugerido que a manutenção prolongada das culturas embriogênicas em meio de cultura com 2,4-D cauas variações genéticas e epigenéticas que afetam o potencial embriogênico em algumas espécies.

Etapa 3: Concentrações de BAP e sacarose na formação de embriões a partir de calos da cultivar Obatã.

• Número de Embriões Globulares

Analisando-se a Figura 6, pode-se observar que a utilização de 30 g.L^-1 de sacarose ao meio de cultura promoveu uma média de 202 de embriões globulares até o nível máximo de 3,3 mg.L^-1 de BAP, registrando-se redução na presença de concentrações mais elevadas.

Confirma-se, assim, a importância da utilização de uma fonte de carboidrato no meio de cultura, e a sacarose influencia diretamente os processos de iniciação e diferenciação dos embriões somáticos (Guerra et al., 1999). Esses resultados também são coerentes com aqueles apresentados por Berthouly & Etienne (2000), que obtiveram formação de embriões somáticos a partir de calos embriogênicos friáveis cultivados em meio secundário contendo apenas BAP.

• Número de Embriões Torpedo

A concentração de 30 g.L^-1 de sacarose, assim como na variável anterior, proporcionou o maior número de embriões torpedo, quando associada a 3 mg.L^-1 de BAP (Figura 7). Com a adição ao meio de 15 g.L^-1 de sacarose, houve uma pequena redução no número de embriões quando comparado com o dobro dessa concentração. A sacarose tem sido a fonte de carboidrato mais recomendada na embriogênese somática. Normalmente a concentração de 3% de sacarose é satisfatória para a iniciação e diferenciação dos embriões somáticos (Guerra et al., 1999), evidenciando, assim, os resultados obtidos para essa variável.

CONCLUSÕES

A ação combinada entre 2,4-D e Cinetina é necessária para indução de calos primários mistos.

Os explantes foliares provenientes de plantas da cultivar Obatã induzem a:

Maior diferenciação de calos embriogênicos friáveis quando utiliza-se BAP (8mg.L^-1) associado ou não com 2,4-D;

Maior formação de embriões a partir de calos embriogênicos friáveis, em meio de cultura acrescido BAP (3 mg.L^-1) e sacarose (30 g.L^-1).

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Parte da Dissertação apresentada pelo primeiro autor à UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS/UFLA, Caixa Postal 37 – 37200-000 – LAVRAS, MG, como parte das exigências do curso de Mestrado em Agronomia, área de concentração Fitotecnia

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Fev 2011
• Data do Fascículo
  Fev 2003