Micropropagação de Dioscorea multiflora Grised

Micropropagation of Dioscorea multiflora Grised

Micropropagação de Dioscorea multiflora Grised

Micropropagation of Dioscorea multiflora Grised

Ana Valéria de Souza^I; Bianca Waléria Bertoni^II; Suzelei de Castro França^II; Ana Maria Soares Pereira^II

^IEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária/Embrapa Centro de Pesquisa Agropecuária Trópico Semiárido/CPATSA Km 458 Zona Rural Cx. P. 601 56304-010 Petrolina, PE [e-mail] ^IIUniversidade de Ribeirão Preto/UNAERP Departamento de Biotecnologia de Plantas Medicinais Ribeirão Preto, SP

RESUMO

Dioscorea multiflora uma planta nativa do Sul do Brasil produz a diosgenina como metabólito secundário majoritário, uma substância potencialmente usada pela indústria farmacêutica para a produção de cortisona e substâncias com ação contraceptiva. Objetivou-se, neste trabalho otimizar o protocolo de micropropagação de D. multiflora, visando a produção de mudas em escala comercial. Segmentos nodais subcultivados em meio MS sólido foram transferidos para multiplicação em meio MS suplementado com BAP (0,01; 0,1; 0,5; 1,0 e 3,0 mg L^-1)e meio MS suplementado com 0,1 mg L^-1 ou 0,5 mg L^-1 de BAP acrescido de diferentes concentrações de sacarose (2, 4, 6, 8 e 10%). Para o enraizamento, as brotações foram cultivadas em meio MS suplementado com AIB (0,1; 0,5; 1,0 e 3,0 mg L^-1) e meio MS suplementado com ANA (0,1; 0,5; 1,0 e 3,0 mg L^-1). Os experimentos in vitro foram instalados em delineamento experimental inteiramente casualizado e cada tratamento constituiu-se de 3 repetições e 10 cubetas/parcela. Plântulas com e sem raízes foram aclimatizadas em casa de vegetação. Melhores resultados de multiplicação e enraizamento foram obtidos em meio MS + 0,1 mg L^-1 de BAP (80%) e em meio MS + 1,0 mg L^-1 de AIB (42,6%), respectivamente. Não houve diferença quanto à porcentagem de sobrevivência das plântulas in vitro e ex vitro durante a aclimatização (75%). O protocolo de micropropagação para D. Multiflora é efetivo e pode ser usado para a produção em escala comercial.

Termos para indexação: Diosgenina, cultivo in vitro, aclimatização.

ABSTRACT

Dioscorea multiflora is a plant native to southern Brazil that produces diosgenin as a major secondary metabolite, a substance which is used by the pharmaceutical industry for the production of cortisone and substances with contraceptive action. The objective of this work was to optimize the micropropagation protocol of D. multiflora, for the production of seedlings on a commercial scale. Nodal segments subcultured in solid MS medium were transferred for multiplication to MS medium supplemented with BAP (0.01, 0.1, 0.5, 1.0 and 3.0 mg L^-1) and MS medium supplemented with 0.1 mg L^-1 or 0.5 mg L^-1 BAP plus different concentrations of sucrose (2, 4, 6, 8 and 10%). For rooting, the shoots were cultured on MS medium supplemented with IBA (0.1, 0.5, 1.0 and 3.0 mg L^-1) and MS medium supplemented with NAA (0.1, 0.5, 1.0 and 3.0 mg L^-1). A completely randomized design was used with treatment consisting of 3 replicates with 10 buckets per plot. Seedlings with and without roots were acclimatized in a greenhouse. The best results of multiplication and rooting were obtained in MS medium + 0.1 mg L^-1 BAP (80%) and in MS medium + 1.0 mg L^-1 IBA (42.6%), respectively. There was no difference in the survival percentage of seedlings in vitro and during ex vitro acclimatization (75%). The micropropagation protocol for production of D. multiflora is effective and can be used for commercial production.

Index terms: Diosgenin, in vitro cultivation, acclimatization.

Introdução

A família Dioscoreaceae é composta por 850 espécies distribuídas em nove gêneros, sendo o mais representativo o gênero Dioscorea, com 600 espécies encontradas nas regiões temperadas e tropicais do planeta (Melo Filho et al., 2000; Shu yu Shu, 2000; Pedralli et al., 2002). O interesse econômico por espécies de Dioscorea foi despertado na década de 30, quando Taukamoto & Ueno (1936), conseguiram isolar a diosgenina, a partir de tubérculos de Dioscorea tokoro. Essa substância é destacada entre as mais importantes dentro do grupo das saponinas esteroidais, devido à possibilidade de sua utilização na produção de cortisona e substâncias com ação contraceptiva.

A elucidação de métodos para a transformação da diosgenina em hormônios foi um marco relevante para a indústria farmacêutica (Chaturvedi, 1979; Zullo et al., 1987; Niño et al., 2007) e, atualmente, a maior parte do material coletado em regiões de ocorrência das espécies do gênero, tem como finalidade o fornecimento de matéria-prima para a extração dessa substância (Zullo et al., 1987; Itharat et al., 2004; Sautour et al., 2004; Niño et al., 2007; Olayemi & Ajaiyeoba, 2007). Dentre as espécies mais exploradas e com maior rendimento de diosgenina (1%), encontra-se a Dioscorea multiflora, nativa da região sul do Brasil (Costa & Mukherjee, 1984).

No levantamento bibliográfico realizado para D. multiflora, pode-se perceber que a taxonomia para as espécies do gênero é problemática, devido ao número elevado e ainda pouco descritas. Mas todas são conhecidas popularmente como inhame ou cará, são trepadeiras herbáceas, formam rizomas ou tubérculos e apresentam plantas dióicas. As flores masculinas são inconspícuas e pequenas e nascem em panículas produzidas nas axilas das folhas. As flores femininas são maiores que as masculinas e nascem em espigas que saem das axilas das folhas. O ovário possui três lóculos, sendo cada um deles com dois óvulos, com três estigmas (Coursey, 1980; Pedralli et al., 2002).

Monteiro & Peressin (2002), destaca que o florescimento de todas as espécies do gênero Dioscorea em condições brasileiras é raro. Sendo assim, toda a propagação das plantas é realizada assexuadamente. Contudo, ainda não há um programa consistente de produção comercial de mudas ou assistência técnica adequada para o cultivo ou manejo sustentável de populações naturais de D. multiflora, o que pode comprometer a conservação e a propagação dos genótipos de interesse, principalmente quando se considera que o sistema subterrâneo é, ao mesmo tempo, a fonte de matéria-prima empregada na extração da diosgenina e o material utilizado para a propagação. Alizadeh et al. (1998), ressaltam que, uma das maiores dificuldades encontradas para o cultivo em escala comercial de todas as espécies do gênero, é a variação nos níveis de diosgenina acumulados nos tubérculos.

Considerando que a técnica da propagação in vitro de plantas possibilita a preservação e a reprodução das características desejáveis da planta matriz, a obtenção de elevado número de plantas num curto período de tempo e espaço reduzido, em excelentes condições fitossanitárias (Bajaj et al., 1988; Grattapaglia & Machado, 1998; Pasqual, 2001), essa foi apontada como o método mais adequado para produção em escala comercial de clones de D. multiflora.

Objetivou-se, neste trabalho, estabelecer um protocolo eficiente de micropropagação de Dioscorea multiflora, para que possa ser utilizado como alternativa na produção de mudas em escala comercial e conservação de genótipos da espécie.

Material e Métodos

Realizaram-se os trabalhos no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais do Departamento de Biotecnologia de Plantas Medicinais da Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP), em Ribeirão Preto, SP. Plantas de D. multiflora, foram coletadas no município de Araucária, PR e um exemplar foi destinado diretamente à realização dos experimentos.

Como fonte de explantes iniciais, utilizaram-se segmentos nodais (1 cm) lavados durante duas horas em água corrente, posteriormente imersos em solução de fungicida sistêmico (0,2% p/v) por 24 horas e transferidos para solução de hipoclorito de sódio (0,5% p/v), por 30 minutos. Os explantes foram inoculados diretamente em meio MS sólido (Murashige & Skoog, 1962), onde permaneceram durante duas semanas, para o estabelecimento in vitro.

Para a indução de múltiplas brotações nos explantes, instalaram-se dois experimentos de multiplicação: 1) MS suplementado com 0,01; 0,1; 0,5; 1,0 e 3,0 mg L^-1 de BAP (6-benzilaminopurina), totalizando cinco tratamentos; 2) MS suplementado com 0,1 mg L^-1 ou 0,5 mg L^-1 de BAP acrescido de 2, 4, 6, 8 e 10% de sacarose em esquema fatorial (2x5), totalizando 10 tratamentos.

Para o enraizamento das brotações, também foram instalados dois experimentos: 1) MS suplementado com 0,1; 0,5; 1,0 e 3,0 mg L^-1 de AIB (ácido indol-butírico); 2) MS suplementado com 0,1; 0,5; 1,0 e 3,0 mg L^-1 de ANA (ácido naftaleno-acético).

Plântulas com e sem raízes foram transferidas para vasos de polietileno de 2 litros, contendo areia para aclimatização em casa de vegetação. As plântulas foram irrigadas diariamente e a umidade foi mantida com a sobreposição de frascos de vidro transparente (5 cm de diâmetro x 8,5 cm de altura), sobre cada plântula durante 40 dias.

Para a instalação dos experimentos in vitro utilizou-se 10 mL de meio solidificado com 3 g L^-1 de fitagel^® e o pH foi aferido para 6 ± 01, antes da autoclavagem. Foram utilizadas cubetas de vidro (85 mm x 15 mm) vedadas com tampa plástica e com plástico do tipo parafilme. As cubetas foram mantidas em sala de crescimento sob condições controladas de temperatura 26±1º C, fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 25 mol m^-2 s^-1 fornecida por lâmpadas do tipo fluorescente branca fria.

Os experimentos de multiplicação e enraizamento in vitro foram instalados em delineamento experimental inteiramente casualizado (DIC) e cada tratamento constituiu-se de três repetições e 10 cubetas/parcela. As avaliações foram realizadas aos 60 dias quanto ao número, comprimento das brotações e porcentagem de explantes com brotos e quanto à porcentagem de plântulas enraizadas e número de raízes por plântula.

Para o experimento de aclimatização, utilizaram-se 50 plântulas enraizadas e 50 plântulas não enraizadas e a avaliação foi realizada após 90 dias quanto ao índice de sobrevivência das plântulas e enraizamento ex vitro.

Resultados e Discussão

O método empregado na assepsia de D. multiflora foi eficiente na desisnfestação dos segmentos nodais, com 90% de descontaminação. O trabalho realizado por Kulkarni et al. (2007), com sementes de Dioscorea drageana indicou a efetividade do cloreto de mercúrio na descontaminação de explantes. Entretanto, o procedimento de assepsia utilizando fungicida e hipoclorito de sódio utilizado no presente trabalho é certamente mais vantajoso devido à baixa toxicidade e reduzido impacto ambiental desses compostos, quando comparado ao cloreto de mercúrio. Os resultados com D. multiflora corroboram com os trabalhos realizados por Pereira et al. (2000) e Biondo et al. (2007), quando obtiveram êxito na assepsia de segmentos nodais para multiplicação in vitro de Pothomorphe umbellata e Mandevilla velutina, respectivamente.

A otimização de protocolos de micropropagação com êxito depende da elucidação de vários fatores diretamente envolvidos no processo. Para o início dos trabalhos, dois fatores são importantes e devem ser considerados: o tipo de explante a ser utilizado para o estabelecimento da cultura in vitro e a assepsia. Dentre os tipos de explantes mais utilizados, as gemas apicais e axilares e os segmentos nodais, promovem clones "true-to-type", ou seja, idênticos à planta matriz e por isso são os mais indicados para a multiplicação e conservação in vitro de genótipos elites e, a assepsia determinará a possibilidade ou não de continuação dos trabalhos, no que se refere à obtenção de culturas totalmente axênicas. Vários autores ressaltam que os cuidados iniciais na seleção e na desinfestação dos explantes são fundamentais para o sucesso do cultivo in vitro (Bajaj et al., 1988; Grattapaglia & Machado, 1998; Pasqual, 2001; Moraes et al., 2007).

Para a indução de brotações múltiplas nos segmentos nodais, observou-se que a espécie respondeu significativamente à ação de reguladores vegetais testados. A adição de baixas concentrações de BAP (0,01 mg L^-1) ao meio MS foi suficiente para induzir a multiplicação in vitro. No entanto, maior porcentagem de explantes brotados (80%) foi obtida em 0,1 mg L^-1 de BAP. Quando adicionou-se 3,0 mg L^-1 de BAP ao meio de multiplicação, não ocorreu desenvolvimento de gemas. Concentrações de BAP superiores a 1,0 mg L^-1 podem ter causado um efeito fitotóxico nos explantes, e por isso, a porcentagem de brotações foi significativamente menor quando comparada ao resultado obtido em 0,1 mg L^-1 (Tabela 1). Alguns autores relatam que o BAP, por ter um efeito mais expressivo quanto à multiplicação in vitro, quando comparado às outras citocininas, pode realmente, apresentar fitotoxicidade em algumas espécies quando utilizado em concentrações relativamente altas, acarretando um efeito negativo quando o objetivo é a indução de múltiplos brotos (Grattapaglia & Machado, 1998; Pasqual, 2001; Souza et al., 2007).

Esta afirmativa tem sido cada vez mais consolidada, segundo os resultados apresentados nos inúmeros trabalhos desenvolvidos visando à propagação in vitro de espécies de interesse. Em estudos realizados por Chen et al. (2003), Kadota & Niimi (2004) e Poornima & Ravishankar Raí (2007), sobre o efeito do BAP na multiplicação in vitro de Dioscorea zingiberebsis, Dioscorea japonica e Dioscorea oppositifolia e Dioscorea pentaphylla, respectivamente, os autores observaram que melhores respostas, quanto à multiplicação de in vitro, também ocorreram quando menores concentrações dessa citocinina foram adicionadas ao meio de cultura, corroborando com os resultados obtidos neste trabalho.

O efeito negativo atribuído a altas concentrações de BAP quanto à indução de múltiplos brotos in vitro, pode estar também, relacionado ao reduzido crescimento das brotações, visto que, em alguns casos ela acontece, mas pode ser mascarada pelo pouco crescimento dos brotos formados, não sendo possível a individualização para a contagem segura e posterior repicagem.

Quando avaliou-se o número de brotações na presença de 1,0 mg L^-1 de BAP, embora os resultados tenham apresentado um valor superior (2,6 brotos) em comparação com os outros tratamentos, somente 33% dos explantes brotaram com comprimento médio de 0,5 cm. De acordo com Grattapaglia & Machado (1998), brotações adequadas para o enraizamento in vitro devem apresentar um comprimento igual ou superior a 1,0 cm, o que corrobora com o valor de 1,6 cm obtido, neste trabalho, na presença de 0,1 mg L^-1 de BAP, em que o número de brotações foi de 1,5 (Tabela 1).

Não houve diferença estatística significativa para o número de brotações entre as concentrações de 0,01 e 0,5 mg L^-1 de BAP. Entretanto, pode-se inferir que o tratamento mais adequado para a multiplicação in vitro de D. multiflora foi a suplementação do meio MS com 0,1 mg L^-1 de BAP, haja vista a obtenção de maior porcentagem de explantes com brotação, com comprimento adequado à etapa de enraizamento in vitro (Tabela 1).

Os resultados de multiplicação obtidos neste trabalho corroboram com aqueles apresentados por Biondo et al. (2007), quando estudaram a indução de múltiplos brotos em segmentos nodais de Mandevilla velutina, cujo sistema subterrâneo também é composto por tubérculos. Assim como para a espécie em estudo, o melhor meio de multiplicação foi o MS, suplementado com 0,1 mg L^-1 de BAP.

Quando avaliou-se o efeito de diferentes concentrações de BAP e sacarose, constatou-se interação entre as variáveis analisadas. Os valores obtidos para número e comprimento de brotações diminuíram à medida que se aumentou a concentração de sacarose no meio de cultura (Tabela 2).

Os resultados obtidos neste experimento diferem daqueles encontrados por Alizadeh et al. (1998), quando encontraram melhores respostas para a indução de microtubérculos e desenvolvimento da parte aérea in vitro de D. composita, na concentração de 8% de sacarose.

Em um trabalho de revisão realizado por Stadem & Fowlds (1992), mostra-se que várias espécies de Diocorea sp. cultivadas in vitro sob níveis reduzidos de sacarose, apresentam formação de microtubérculos aéreos. A redução da concentração de sacarose no meio de cultura favoreceu a proliferação de brotos em D. multiflora, mas não promoveu a formação de minitubérculos.

Os resultados obtidos neste experimento demonstraram que um número satisfatório de brotações (4,1), pode ser obtido em concentrações relativamente baixas de BAP (0,1) e sacarose (2%). Esse fato implica, diretamente, na redução de custos, o que é extremamente relevante quando o objetivo é a produção de mudas em escala comercial.

Quando as brotações foram transferidas para o meio de enraizamento, os resultados mostraram que a indução de raízes adventícias in vitro foi ineficiente na presença das duas auxinas testadas, pois somente 42,6% das brotações apresentaram em média 1,5 raízes (Tabela 3). Em plântulas enraizadas in vitro, pôde-se observar que as raízes adventícias desenvolveram-se somente na região basal das brotações, o que pode ser uma característica desse gênero, uma vez que isso também foi relatado por Alizadeh et al. (1998), em trabalho realizado com D. composita.

Assis & Teixeira (1998) e Grattapaglia & Machado (1998) ressaltam que a dificuldade encontrada para induzir o enraizamento em espécies vegetais é mais expressiva em lenhosas quando comparadas às herbáceas. Entretanto, D. multiflora, é uma espécie herbácea e o protocolo para o enraizamento adventício in vitro não foi obtido com êxito.

Nesse caso, pôde-se inferir, do mesmo modo, que também existe dificuldade na indução de raízes adventícias in vitro em espécies herbáceas, cujo sistema subterrâneo é diferenciado em tubérculos, xilopódios e outras estruturas. Os resultados obtidos nos experimentos com D. multiflora, corroboram com os trabalhos realizados por Corrêa et al. (2003), Biondo et al. (2007) e Poornima & Ravishankar (2007), quando estudaram o enraizamento e/ou a tuberização in vitro de Ipomoea batatas, Mandevilla velutina e Dioscorea oppositifolia e Dioscorea pentaphylla.

Assim como a etapa de assepsia, o enraizamento das espécies vegetais in vitro tem merecido maior atenção na otimização de protocolos de micropropagação. Segundo Souza & Pereira (2007), o desenvolvimento do sistema radicular a partir da formação de raízes adventícias em plantas propagadas vegetativamente sob condições in vitro ou in vivo é um processo de grande complexidade e envolve diversos fatores que ainda não estão completamente elucidados.

No entanto, mesmo que o enraizamento in vitro de D. multiflora não tenha sido satisfatório, este fato não foi limitante para a obtenção de mudas. As plântulas que não desenvolveram raízes in vitro e que foram transferidas para casa de vegetação para aclimatização, formaram raízes ex vitro três meses após o plantio em substrato, com índice de sobrevivência (75%) idêntico ao das plântulas enraizadas in vitro. Esse resultado é relevante no contexto da otimização do protocolo de micropropagação, uma vez que a etapa de enraizamento ex vitro tem sido apontada como vantajosa do ponto de vista de redução de custos e do tempo para a obtenção de mudas e portanto, almejada quando o objetivo é a produção em escala (Assis & Teixeira, 1998; Grattapaglia & Machado, 1998; Pasqual, 2001; Almeida et al., 2008). Rocha et al. (2009), também conseguiram aclimatizar mudas de helicônia micropropagadas. Contudo, as brotações foram enraizadas in vitro.

O processo de enraizamento adventício envolve a conjugação entre auxinas internas e externas e quando a espécie possui uma concentração adequada do hormônio endógeno AIA (ácido indol-acético), a conjugação com reguladores vegetais sintéticos, como AIB ou ANA por determinados períodos entre dez e vinte dias, aproximadamente, já é suficiente para induzir a formação de raiz sob condições in vitro. A permanência da brotação na presença da auxina sintética por períodos prolongados, pode acarretar na inibição do crescimento das raízes induzidas (Gaspar & Hofinger, 1988; Grattapaglia & Machado, 1998; Souza & Pereira, 2007).

Logo, pode-se afirmar que a retirada das brotações de D. multiflora do meio de cultura contendo AIB ou ANA e aclimatização das plântulas em substrato sem reguladores vegetais, culminou no desenvolvimento e crescimento das raízes adventícias sob condições ex vitro. Os resultados apresentados para a espécie em estudo, corroboram com aqueles relatados por Poornima & Ravishankar Raí (2007), quando estudaram a propagação in vitro de Dioscorea oppositifolia e Dioscorea pentaphylla. O enraizamento ex vitro para as duas espécies foi superior em relação ao enraizamento in vitro e 90% das plântulas sobreviveram na etapa de aclimatização. Os autores também ressaltam que as auxinas podem ter um efeito negativo no crescimento de raízes adventícias in vitro, quando as plântulas permanecem durante todo o tempo na presença dessas.

Conclusões

Foi possível estabelecer um protocolo eficiente para a micropropagação de Dioscorea multiflora, sendo uma alternativa útil para a produção em escala comercial dessa espécie.

Recebido em 18 de junho de 2009

Aprovado em 17 de março de 2010

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Fev 2011
• Data do Fascículo
  Fev 2011

Histórico

• Aceito
  17 Mar 2010
• Recebido
  18 Jun 2009