Enraizamento in vitro de microestacas e micropropagação de gemas axilares de Sarandi (Sebastiania schottiana Muell. arg.)

In vitro rooting of microcuttings and micropropagation of axilary buds of Sarandi (Sebastiania schottiana Muell. arg.)

ENRAIZAMENTO in vitro DE MICROESTACAS E MICROPROPAGAÇÃO DE GEMAS AXILARES DE SARANDI (Sebastiania schottiana MUELL. ARG.)

in vitro ROOTING OF MICROCUTTINGS AND MICROPROPAGATION OF AXILARY BUDS OF SARANDI (Sebastiania schottiana MUELL. ARG.)

Cícero Deschamps¹ José Eduardo Brasil Pereira Pinto²

RESUMO

A indução da rizogênese in vitro foi testada em meios de cultura Murashige & Skoog (MS) e Wood Plant Medium (WPM), líquido e sólido, suplementados ou não com ácido indolbutírico (AIB). Na multiplicação de gemas axilares, avaliou-se o efeito da benzilaminopurina (BAP) em meios de cultura MS e WPM, utilizando um explante com uma gema por tubo de ensaio. O mesmo tipo de explante foi inoculado em número de 10 por frasco de 200ml com meio MS, suplementado com BAP e ácido naftalenoacético (ANA). O último experimento envolveu os reguladores de crescimento BAP e ácido giberelico (GA₃), juntamente com carvão ativado. As maiores porcentagens de explantes enraizados e número de raízes foram obtidos em meio WPM, suplementado com 4,9 µ M de AIB, independentemente da presença de ágar. Os melhores resultados na multiplicação de gemas axilares ocorreram na presença de GA₃ onde observou-se efeito linear até l,4µM no número de explantes alongados, comprimento da parte aérea e número de gemas. O BAP influenciou essas características apenas quando o carvão ativado estava ausente no meio, nesse caso 1,1µM foi a melhor concentração.

Palavras-chave: micropropagação, regulador de crescimento, cultura de tecidos, Sebastiania schottiana.

SUMMARY

In vitro rooting was carried out on Murashige & Skoog (MS) and Wood Plant Medium (WPM) liquid and solid, suppiemented with indolbutiric acid (IBA). Multipleshoot induction was tested with benzylaminopurine (BAP) on MS and WPM Medium, with one explant in each tube. The explant was inoculated in container (200ml) on MS Medium suppiemented with BAP and NAA. The last experiment was made with BAP, GA₃ and activaded charcoal. In the present work, the results show better rooting percentage and number of roots on WPM Medium with 4.9 µM IBA. The multiplication of shoots was obtained with GA₃, at 1.4µM that resulted in better lenght of shoots and number of buds. BAP was effective for all characteristics at 1.1µM only without actived charcoal.

Key words: micropropagation, growth regulator, tissue culture, Sebastiania schottiana.

INTRODUÇÃO

O Sarandi (Sebastiania schottiana MUELL. ARG.) é uma espécie florestal de mata de galeria que, segundo SMITH et al. (1988), apresenta adaptações para resistir às correntezas durante o período de enchentes.

A propagação do Sarandi apresenta problemas quanto à viabilidade de sementes produzidas em função dos diferentes estádios de maturação verificados em cada planta, em condições de campo.

A micropropagação in vitro representa uma alternativa à produção de mudas possibilitando a multiplicação em grande escala dessa espécie, independente da época do ano.

O meio de cultura, bem como o ajuste de seus componentes, varia conforme a espécie e estádio da micropropagação in vitro. THORPE et al. (1991) afirmam que meios de cultura como Wood Plant Medium (WPM) e Creishoff & Doy (CD), que apresentam baixa concentração de sais, aumentam a porcentagem de enraizamento in vitro. Em espécies lenhoras, o meio líquido tem sido empregado em detrimento do meio sólido conforme RATHORE et al. (1991) e LININGTON (1991).

A atuação das auxinas corresponde também a um fator de grande importância. BANKO & STEFANI (1989) obtiveram o enraizamento de Oxydendron arborium em meio WPM contendo ácido indol butírico (AIB). HAMMATT & RIDOUT (1992) multiplicaram Fraxinus excelsior a partir de gemas axilares em meio suplementado com benzilaminopurina (BAP). No entanto, JOHNSON et al. (1991) verificaram que esse regulador de crescimento em altas concentrações, embora tenham proporcionado maior número de brotações em Quereus lobata, proporcionou formação de entrenós mais curtos e com maior número de folhas. Combinações de BAP e ácido naftaleno acético (ANA) são citados, por exemplo, na multiplicação de espécies florestais como Populus tremula (WANN et al., 1988), Pinus ponderosa (LIN et al., 1991) e Pinus virginiana (CHANG et al., 1991). Embora com menos frequência, as giberelinas (GA) são utilizadas devido ao efeito no alongamento de partes aéreas. OFFORD et al. (1992) suplementaram o meio com BAP e GA₃ na multiplicação de Telopea speciosissima.

Além de reguladores de crescimento, o meio de multiplicação poderá conter carvão ativado, com a função de adsorver fenóis liberado pelo explante ao meio de cultura, conforme mencionado em Pinus canriensis (PULIDO et al., 1991), Pinus strobus (KAUL, 1990), Depterocarpus alatus e D. intricatus (LININGTON, 1991) e Quereus robur (VOLKAERT et al., 1990).

Portanto, nesse trabalho procurou-se definir as condições ideais quanto aos meios de cultura e reguladores de crescimento para a micropropagação de Sarandi nas etapas de enraizamento dos explantes e multiplicação de gemas axilares.

MATERIAL E MÉTODOS

Os explantes utilizados para o enraizamento de microestacas e para multiplicação in vitro, foram obtidos de brotações provenientes de mudas mantidas em casa de vegetação. As brotações depois de coletadas permaneceram em água corrente durante período de 12 horas.

Em todos os experimentos, a inoculação dos explantes ocorreu em fluxo laminar, após assepsia com imersão em álcool 70% por 20 segundos, água sanitária 20%, durante 10 minutos e, finalmente, em água autoclavada por quatro vezes.

O pH do meio de cultura foi ajustado para 5,8 e a esterilização foi realizado em autoclave de vapor úmido por 121°C e uma atmosfera de pressão por 20 minutos.

No enraizamento in vitro, o delineamento experimental foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 2x2x5 com quatro repetições por tratamento (quatro tubos/repetição), com os seguintes fatores: meios de cultura (MS - Murashige & Skoog e WPM - Wood Plant Medium), meios líquido e sólido (0,6% ágar) com 0; 0,5; 2,5; 4,9 e 9,8µM de ácido indolbutírico, respectivamente.

Na multiplicação in vitro utilizou-se explantes com apenas uma gema lateral. As concentrações de BAP nos meios MS e WPM foram 0; 2,22; 4,44 e 8,88µM, correspondendo 8 tratamentos com 5 repetições (seis tubos/repetição), fatorial 2x4.

Em um outro experimento estudou-se a interação entre ácido naftalenoacético (0; 0,1; 0,5; e 5,4µM) e benzilaminopurina (0; 0,04; 0,4 e 4,4µM na multiplicação dos explantes em frascos (200ml) contendo meio MS. Foram inoculados 10 explantes, também com uma gema lateral, por frasco, sendo cada tratamento composto por quatro repetições (dez explantes/repetição). Por último, avaliou-se a influência do carvão ativado (0,1%) no meio MS e a interação da benzilaminopurina e ácido giberélico, ambos nas concentrações 0; 1,1 e 2,2µM e 0; 1,3 e 2,7µM, respectivamente. Os explantes nesse experimento apresentavam de três a quatro gemas laterais, sendo utilizados tubos de ensaio (150 x 20mm) contendo 10ml de meio de cultura, constituindo-se portanto esquema fatorial 2x3x3.

As avaliações foram efetuadas após 30 dias de cultivo em sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas, temperatura de 26 ± 1°C e irradiância aproximada de 40mmol.cm^-2.s^-1.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Enraizamento de Microestacas in vitro

A interação entre concentrações de ácido indolbutírico e meio de cultura afetou significativamente a porcentagem de explantes enraizados in vitro, bem como o número de raízes formadas. No meio MS não houve formação de raízes. Porém, quando o meio WPM, acrescido de 4,9µM de AIB foi utilizado, 37,8% do total de explantes enraizaram e 54,2% sobreviveram (Figura 1). Em contraste, a presença de AIB (4,9µM) no meio de cultura reduziu a sobrevivência dos explantes de 93,33% (testemunha) para 69,75%. THORPE et al. (1991) trabalhando com espécies lenhosas mostrou que o meio de cultura com baixa concentração de sais proporcionou melhor enraizamento.

Verificou-se que a porcentagem de explantes sobreviventes em meio MS líquido com ou sem AIB, proporcionou as melhores médias de sobrevivência, do que no meio sólido, diferindo entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Enquanto, que no meio WPM não houve diferença significativa entre o meio sólido e líquido (dados não mostrados).

Multiplicação in vitro

Efeito do BAP nos meios MS e WPM

O desenvolvimento da parte aérea ocorreu principalmente mediante a formação de folhas, de acordo com a interação entre meio de cultura e concentrações de BAP. DUSTAN et al. (1992) afirma que a adição de BAP ao meio nem sempre proporciona adequado alongamento.

Em média, 49,61 % dos explantes desenvolveram parte aérea em meio MS contendo 4,4µM de BAP, enquanto que em meio WPM, maior percentual (45,71 %) foi alcançado na ausência desse regulador de crescimento (Figura 2). Esses resultados estão de acordo com os obtidos por HAMMATT & RIDOUT (1992) que verificaram maior desenvolvimento de brotações em meio WPM com baixas concentrações de BAP, constatando portanto, um efeito tóxico dessa citocinina no desenvolvimento das brotações em meio WPM. A redução do alongamento dos explantes sob a concentração de 8,9µM de BAP foi também registrada por SINHA & MALLICK (1993), que verificaram além da inibição no alongamento, maior formação de calos sob essa concentração. O comprimento das brotações obtidas neste trabalho foram reduzidas, devido o encurtamento dos intemódios, talvez em função da toxidez do BAP sob concentrações elevadas.

Efeito da interação ANA e BAP

Na multiplicação de gemas axilares em frascos apenas o ANA influenciou o desenvolvimento da parte aérea, tendo efeito significativo. De acordo com a Figura 3, observa-se que a ausência de ANA proporcionou em média 62,30% de explantes com mais de cinco folhas, sendo que na concentração de 0,1µM, 20,48% dos explantes apresentaram menos de cinco folhas.

No alongamento das gemas axilares foi maior também em meio isento dessa auxina, demonstrando o efeito tóxico do ANA. FIGUEIREDO & ESQUIBEL (1991) relatam o desenvolvimento e o crescimento de gemas axilares a partir de segmentos nodais de Datura insiginis em baixa concentração de ANA. LIN (1991) e ISLAM et al. (1993) verificaram em seus trabalhos que o ANA proporcionou um aumento na formação de calos e menor formação de brotos. Outros trabalhos citam o aumento do número (RHAMAN, et al. 1993) e comprimento das brotações (WYSSOKINSKA, 1993) a partir da interação entre citocininas e auxinas.

Efeito da interação BAP e GA, e do carvão ativado

Na Figura 4 é apresentado o efeito do GA₃, sobre o número médio de gemas alongadas, comprimento médio das brotações, bem como número médio de gemas por brotação. Na concentração de 2,7µM de GA₃, 43,49% dos explantes apresentaram alongamento das brotações cujos comprimentos (em mm) e número de gemas foram 5,3 e 1,9, respectivamente.

A interação entre BAP e GA₃ verificada por OFFORD et al. (1992) na multiplicação de Telopea speciosissima não foi verificada no presente experimento, onde apenas o GA₃ induziu uma resposta positiva.

Por outro lado, observou-se uma interação significativa negativa entre o BAP e o carvão ativado. O melhor resultado foi obtido na ausência de carvão ativado no meio contendo 1,1µM de BAP. Nessa condição, 53,29% dos explantes apresentaram em média brotações com 7,4mm de comprimento e 3,1 gemas (Figuras 5 e 6). Portanto, apesar do efeito benéfico do carvão ativado na remoção de substâncias inibidoras produzidas pela autoclavagem do meio ou pelo próprio tecido vegetal, ele também atua na adsorção de citocininas e auxinas, reduzindo ou eliminando seus efeitos. EBERT et al. (1993), verificaram que aos 10 dias após o preparo do meio, os níveis de BAP disponíveis (não adsorvido) foram aproximadamente 0,3 a 0,4% em meio líquido e 0,8 a 1,0% em meio sólido (6 g.L^-1).

Um aspecto importante observado diz respeito a influência do tamanho do explante, aonde melhores resultados foram obtidos quando utilizaram-se explantes contendo de 3 a 4 gemas. LAUZER et al. (1992) verificaram a necessidade de uma tamanho mínimo na micropropagação de Dioscorea abyssinica Hoch. O melhor crescimento e desenvolvimento das brotações em explantes contendo de três a quatro gemas axilares pode ser devido a um maior nível de reservas.

Outros estudos envolvendo ajuste dos nutrientes no meio de cultura, buscando níveis adequados de sacarose (ZHANG & STOLTZ, 1989 e DUSTAN et al., 1992) e da relação nitrato/amônio (SELBY et al., 1990), podem ser realizados buscando melhores resultados na multiplicação in vitro de Sarandi.

²Engenheiro Agrônomo, PhD, Professor Titular, Departamento de Agricultura, ESAL, Caixa Postal 37, 37200-000 - LAVRAS, MG. Autor para correspondência.

Recebido para publicação em 16.08.94 Aprovado em 31.05.95

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¹

Engenheiro Agrônomo, Mestre, Curso de Pós-graduação em Agronomia, DBI, ESAL.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Out 2009
• Data do Fascículo
  1995

Histórico

• Aceito
  31 Maio 1995
• Recebido
  16 Ago 1994