Viabilidade de Escherichia coli O153:H25, O113:H21 e O111:H8 (STEC não-O157) produtoras de toxina Shiga em queijo minas frescal

Viability of Escherichia coli O153:H25, O113:H21 e O111:H8 (STEC non-O157) Shiga toxin-producing in minas frescal cheese

Paulo Gomes de Lima Thalita Martins da Silva Luciana Maria Ramires Esper Alice Gonçalves Martins Gonzalez Robson Maia Franco Sobre os autores

Resumos

A existência de um reservatório animal é de grande importância na transmissão de Escherichia coli, produtora de toxina shiga (STEC) aos humanos. Epidemiologicamente, o sorotipo O157:H7 tem sido o mais envolvido em surtos de doença humana causada por STEC, porém surtos envolvendo STEC não pertencentes ao sorogrupo O157 (STEC não-O157) têm sido descritos. Inúmeros trabalhos constatam uma elevada ocorrência destes microrganismos em fezes de bovinos no Brasil, entretanto, pouco se sabe sobre a transmissão destes aos produtos de origem animal em nosso país. Neste trabalho, foi avaliada a viabilidade de E.coli O153:H25; O113:H21 e O111:H8 em Queijo Minas Frescal (QMF), produzido com inóculos de STEC não O157: H7 e armazenados a 8ºC. Realizaram-se contagens de E. coli e psicrotróficos totais após o processamento do queijo e com intervalos de sete e quinze dias. Foi observado aumento nas contagens de E. coli STEC não O157: H7 e psicrotróficos totais logo após o processamento do QMF, bem como durante o armazenamento a 8ºC, temperatura máxima recomendada pela legislação brasileira. Demonstra-se que, caso haja contaminação da matéria-prima com STEC não O157: H7 (deste estudo), o processamento do QMF não elimina os microrganismos e a temperatura máxima recomendada pela legislação não inibe a multiplicação bacteriana, mantendo-se o risco à população. Reforça-se, portanto, a atenção à qualidade da matéria-prima, das ferramentas de qualidade no campo e na indústria de alimentos para garantir a inocuidade do produto final

STEC não-O157; queijo minas frescal; toxina shiga


The existence of an animal reservoir is of great importance in the transmission of shiga toxin-producing E. coli (STEC) to humans. Epidemiologically serotype O157:H7 has been the most involved in human disease outbreaks caused by STEC, however STEC not belonging to serogroup O157 (STEC non-O157) have been described in outbreaks. Studies have revealed a risk in occurrence of these organisms in feces of cattle in Brazil, but little is known about the transmission to animal's products origin in our country. This study evaluated the viability of E. coli O153:H25, O113:H21 and O111:H8 in Minas Frescal Cheese (MFC), produced with non- STEC O157:H7 and stored at 8ºC. Counts of E. coli and total psychrotrophic were performed after processing and at intervals seven and fifteen days. There were an increase in the counts of E. coli and total psychrotrophic just after MFC processing as well as during storage at 8°C. The results demonstrated that, if the raw material (milk) is contaminated with STEC non O157:H7 (this study), the MFC processing does not eliminate the microorganisms and the maximum temperature recommended does not eliminate bacterial growth, keeping the risk to the population. The results reinforces, the attention to the quality of the raw material, the quality tools in the field and in the food industry to ensure the safety of final products

(STEC non-O157); minas frescal cheese; shiga toxin-producing


INTRODUÇÃO:

A existência de um reservatório animal é de capital importância na transmissão de Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) aos humanos (PEARCE et al., 2004PEARCE, M.C.et al. Temporal shedding patterns and virulence factors of Escherichia coli serogroups O26, O103, O111, O145, and O157 in a cohort of beef calves and their dams. Applied Environmental Microbiology, v.70, p.1708-1716, 2004. Disponível em: <doi: 10.1128/AEM.70.3.1708-1716.2004>. Acesso em: 04 dez. 2013.
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). Embora alguns trabalhos constatem uma elevada ocorrência de Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) em bovinos no Brasil (CERQUEIRA et al. 1997; 1999CERQUEIRA, A.M.F. et al. High occurrence of Shiga-like toxin-producing strains among diarrheogenic Escherichia coli isolated from raw beef product in Rio de Janeiro City, Brazil. Journal Food Protection, v.60, p.177-180, 1997. Disponível em: <http://www.ingentaconnect.com/content/iafp/jfp/1997/00000060/00000002/art00015>. Acesso em: 03 dez. 2013.
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; GONZALEZ, 2003GONZALEZ, A.G.M. Características fenotípicas e genotípicas de cepas de Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) isoladas de bovinos no Estado do Rio de Janeiro. 2003. 199f (Tese de Doutorado)- Pós-graduação em Microbiologia, IMPPG, Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ.; TRISTÃO, 2007TRISTÃO, L.C.S. et al. Virulence markers and genetic relationships of Shiga toxin-producing Escherichia coli strains from serogroup O111 isolated from cattle. Veterinary Microbiology, v.119, p.358-65, 2007. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17049189>. Acesso em: 02 dez. 2013.
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), pouco se sabe sobre a transmissão por produtos de origem animal em nosso país, como carne, leite e seus derivados.

Epidemiologicamente, o sorotipo O157:H7 tem sido o mais envolvido em surtos de doença humana causada por STEC (KARMALI, 1989KARMALI, M.A. Infection by verocytotoxin-producing Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews, v.2, p.15-38, 1989. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC358098/>. Acesso em: 01 dez 2013.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles...
; TARR, 1995TARR, P.I. Escherichia coli O157:H7: Clinical, diagnostic and epidemiological aspects of human infection. Clinical Infectious Disease, v.20, p.1-10, 1995. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7727633>. Acesso em: 02 dez. 2013.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/77276...
; PATON & PATON, 1998PATON, J.C.; PATON, A.W. Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections. Clinical Microbiology Reviews v.11, p.450-479, 1998. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9665978>. Acesso em: 02 dez. 2013.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/96659...
). Contudo, surtos envolvendo STEC não pertencentes ao sorogrupo O157 (STEC não-O157) têm sido descritos. Infecções envolvendo STEC não-O157 vêm sendo relatadas em vários países e mais de 50 sorotipos destas STEC têm sido isolados de humanos com colite hemorrágica e Síndrome hemolítica urêmica (SHU) (JOHNSON et al., 1996KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms, and Escherichia coli as quality and safety indicators. In: .APHA (AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION). Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4.ed. Washington, 2001. Cap.8, p.69-82.; CAPRIOLI et al., 2005CAPRIOLI, A. et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli: emerging issues on virulence and modes of transmission. Veterinary Researches, v.36, p.289-311, 2005. Disponível em: <http://hal.archives-ouvertes.fr/docs/00/90/29/71/PDF/hal-00902971.pdf>. Acesso em: 3 dez. 2013.
http://hal.archives-ouvertes.fr/docs/00/...
LEOTTA et al., 2008LEOTTA, G.A. et al. Characterization of Shiga Toxin-producing Escherichia coli O157 strains isolated from humans in Argentina, Austrália and New Zealand. Bmc Microbiology, v.8, p.46, 2008. Disponível em: <http://www.biomedcentral.com/1471-2180/8/46>. Acesso em: 02 dez. 2013.
http://www.biomedcentral.com/1471-2180/8...
).

Algumas estimativas sugerem que STEC não-O157 sejam responsáveis por 25% dos casos de SHU nos EUA (JOHNSON et al., 1996KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms, and Escherichia coli as quality and safety indicators. In: .APHA (AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION). Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4.ed. Washington, 2001. Cap.8, p.69-82.). Em países como Chile (OJEDA et al., 1995OJEDA, A. et al. Sorbitol-negative phenotype among enterohemorrhagic Escherichia coli strains of different serotypes and from different sources. Journal of Clinical Microbiology, v.33, p.2199-2201, 1995. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7559979>. Acesso em: 02 dez. 2013.
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), Argentina (LOPEZ et al., 1989LOPEZ, E.L. et al. Epidemiology of Shiga toxin-producing Escherichia coli in South American. In: KAPER, J.B.; O'BRIEN A.D. (Eds.). Escherichia coli O157:H7 and other Shiga toxin-producing E. coli strains. Washington, DC: ASM, 1998. p.30-37.) e Austrália (GOLDWATER & BETTELHEIM, 1994GOLDWATER, P.N.; BETTELHEIM, K.A. The role of enterohaemorrhagic E. coli serotypes other than 0157:H7 as causes of disease. In: KARMALI, M.A.; GOGLIO, A.G. (Eds.). Recent advances in verocytotoxin- producing Escherichia coli infections. Amsterdam: Elsevier Science, 1994. p.57-60. (Excerpta Medica International Congress Series 1072).), STEC não-O157 são responsáveis pela maioria dos casos de SHU. Cepas STEC não-O157 têm sido frequentemente isoladas de pacientes com diarreia não-sanguinolenta (PIERARD et al., 1990PIERARD, D. et al. Results of screening for verocytotoxin-producing Escherichia coli in faeces in Belgium. European Journal of Clinical MicrobiologyInfectious Disease, v.9, n.3, p.198-201, 1990. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2186912>. Acesso em: 05 dez. 2013.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21869...
; BROOKS et al.,2005BROOKS, J.T. et al. Non-0157 Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Infections in the United States, 1983-2002. Journal of Infectious Disease, v.192, p.1422-1429, 2005. Disponível em: <http://www.jstor.org/discover/10.2307/30087559?uid=3737664&uid=2&uid=4&sid=21103139523381>. Acesso em: 2 dez. 2013.
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). Na literatura, já foram reportados isolamentos de STEC não- O157 em produtos de origem animal em diversos países (BOSILEVAC & KOOHMARAIE, 2011BOSILEVAC, J.M.; KOOHMARAIE, M. Prevalence and characterization of non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from commercial ground beef in the United States. Applied Environmental Microbiology, v.77, p.2103-2112, 2011.; FARROKH et al., 2013FARROKH, C. et al. Review of Shiga-toxin-producing Escherichia coli (STEC) and their significance in dairy production. International Journal of Food Microbiology, v.162, p190-212, 2013. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22939912>. Acesso em: 10 abr. 2014.
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; MOHAMMED et al., 2014MOHAMMED, M.A. et al. Occurrence, serotypes and virulence genes of non-O157 Shiga toxin producing Escherichia coli in fresh beef, ground beef, and beef burger. Food Control, v.25, p159-164, 2014. Disponível em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956713513004817>. Acesso em: 10 apr. 2014.
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).

Entre os derivados do leite, o queijo é um dos principais produtos, tendo, ademais, alta demanda de consumo. O queijo minas frescal encontra-se entre os queijos mais consumidos no Brasil (LIMA FILHO, 2010LIMA FILHO, R.R. Aumenta o consumo de queijo no Brasil. 2010. Carta Leite, Bebedouro, Set de 2010. Disponível em: <http://www.bovinos.ufpr.br/100921_Aumenta_o_consumo_de_queijo_no_brasil_def.pdf>. Acesso em: 12 abr. 2014.
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).

Diante do exposto, o presente trabalho visa a avaliar a viabilidade de Escherichia coli O153:H25, O113:H21 e O111:H8 (STEC não-O157) em queijo minas frescal.

MATERIAL E MÉTODOS:

As cepas utilizadas no presente trabalho foram E. coli O153:H25, O113:H21 e O111:H8 (STEC não-O157), isoladas de bovino no estado do Rio de Janeiro (GONZALEZ, 2003GONZALEZ, A.G.M. Características fenotípicas e genotípicas de cepas de Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) isoladas de bovinos no Estado do Rio de Janeiro. 2003. 199f (Tese de Doutorado)- Pós-graduação em Microbiologia, IMPPG, Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ.). A identificação destes microrganismos foi confirmada através de testes bioquímicos e morfológicos. Inóculos de 103 e 105 células ml-1 de cada cepa foram adicionados separadamente em leite do tipo B pasteurizado, utilizado no processamento dos queijos minas frescal. Ao leite aquecido a 35°C, adicionaram-se 200ppm de CaCl2, e 0,0625g L-1 de coalho Halamix (Chr. Hansen A/S). Uma vez obtido um coágulo firme, foi realizado o corte da massa, com consequente liberação de soro. Procedeu-se à mexedura a 45°C por 15 minutos. A dessoragem foi realizada manualmente, com o auxílio de peneiras. A salga foi realizada através da adição de sal (2,1%), diretamente na massa do queijo, após a etapa de dessoragem. Após o preparo, estes foram armazenados a 8°C (FURTADO, 2005FURTADO, M.M. Principais problemas dos queijos: causas e prevenção. São Paulo: Fonte Comunicação e Editora, 2005. 200p.). Os leites utilizados como matéria-prima e os queijos não inoculados foram submetidos a análises para verificação de algumas características físico-químicas, como pH, acidez e umidade e dos padrões microbiológicos de Salmonella sp, Estafilococos coagulase positiva, Coliformes termotolerantes e Listeria spp, descritos na Resolução RDC no 12, de 02 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Portaria no 146, de 07 de março de 1996. Aprova os regulamentos técnicos de identidade e qualidade dos produtos lácteos. Diário Oficial da União, Brasília, 11 de março de 1996. seção 1. Disponível em: <http://extranet.agricultura.gov.br/sislegis-consulta/consultarLegislacao.do?operacao=visualizar&id=1218>. Acesso em: 05 nov. 2013.
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), complementado com análises de psicrotróficos totais. Também foi realizada a pesquisa de E. coli O157:H7 no leite (ZADIK et al., 1993ZADIK P.M. et al. Use of tellurite for the selection of verocytotoxigenic Escherichia coli O157. Journal of Medical Microbiology, v.39, p.155-158, 1993. Disponível em: <http://jmm.sgmjournals.org/content/39/2/155.abstract?ijkey=dc61d48776cdaab7734a4c11d33f260f007da8a7&keytype2=tf_ipsecsha>. Acesso em: 02 out. 2011.
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), a fim de garantir a ausência deste microrganismo na matéria-prima.

Os queijos foram mantidos a 8°C e analisados quanto à recuperação de células viáveis de E.coli (KORNACKI; JOHNSON, 2001KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms, and Escherichia coli as quality and safety indicators. In: .APHA (AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION). Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4.ed. Washington, 2001. Cap.8, p.69-82.), assim como contagem de psicrotróficos totais (COUSIN et al., 2001COUSIN,M.A. et al. Psychrotrophic microorganisms. In: APHA (American Public Health Association). Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4.ed. Washington, 2001. Cap.13, p.159-166.) nos tempos de 0 (após o processamento), 7 e 15 dias. Todos os experimentos foram realizados em três repetições independentes, em duplicata.

Após a contagem e isolamento de E.coli dos queijos inoculados, realizou-se pesquisa por Polymerase Chain Reaction (PCR) dos genes produtores de toxina shiga (stx1 e stx2) (GONZALEZ, 2003GONZALEZ, A.G.M. Características fenotípicas e genotípicas de cepas de Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) isoladas de bovinos no Estado do Rio de Janeiro. 2003. 199f (Tese de Doutorado)- Pós-graduação em Microbiologia, IMPPG, Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ.).

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

De acordo com os resultados físico-químicos e microbiológicas obtidos do leite tipo B pasteurizado, a matéria-prima foi considerada em conformidade com os parâmetros legais e de literatura, sendo própria para a elaboração dos queijos. Não foi detectado coliforme a 45ºC e E. coli O157:H7 nas amostras de leite, assegurando que os microrganismos enumerados no experimento não foram oriundos da matéria-prima utilizada. As análises físico químicas dos queijos não inoculados apresentaram valores médios de umidade 58%, pH 6,6 e acidez 0,11%. Os valores de umidade, pH e acidez estavam em conformidade com os padrões oficiais de queijo Minas Frescal (BRASIL, 1996, BRASIL, 2006). Não foram observadas contagens de E. coli e a contagem de psicrotróficos variou de 3,6 x 104 UFCg-1 a 5,0x105 UFC g-1.

Os leites inoculados com a cepa O153: H25 a 103UFC ml-1 apresentaram contagem média de 3,8x104 UFC g-1 após a produção do queijo e 5,4x 105UFC g-1 de psicrotróficos. Nas contagens de sete e quinze dias, as médias foram 6,5x106UFC g-1 e 1,9x107UFC g-1 para E.coli e de 2,7x107UFC g-1 e 2,2x109UFC g-1 para psicrotróficos, respectivamente (Figura 1).

Figura 1
: Contagens de STEC não O157 em queijo minas frescal, preparado após inoculação de 103UFC ml-1 dos microorganismos em leite.

Já os leites inoculado a 105 apresentaram contagem média de 9,8x106 após a produção do queijo e 4,0x106UFC g-1 de psicrotróficos totais. Nas contagens de sete e quinze dias, as médias foram 1,9x107 e 2,2x107UFC g-1 para E. coli e de 2,2x109 e 3,6x109 UFC g-1 para psicrotróficos totais, respectivamente (Figura 2).

Figura 2: Contagens de STEC não O157 em queijo minas frescal, preparado após inoculação de 105UFC ml-1 dos microorganismos em leite.

Os leites inoculados com a cepa O113:H21 à 103 apresentaram contagem média de 9,5x104UFC g-1 de E. coli após a produção do queijo e de 2,2x106UFC g-1 de psicrotróficos totais. Nas contagens de sete e quinze dias, as médias foram de 7,5x107 e 6,4x107UFC g-1 para E. coli e de 7,4x108 e 6,1x108UFC g-1 psicrotróficos totais, respectivamente. Os leites inoculados a 105 desta cepa apresentaram contagem média de 5,7x106UFC g-1 após a produção do queijo e 6,6x106UFC g-1 de psicrotróficos totais. Nas contagens de sete e quinze dias, as contagens médias foram de 5,5x107UFC g-1 e 9,2x107UFC g-1 para E. coli e de 7,6x108UFC g-1 e 1,1x109UFC g-1 para psicrotróficos, respectivamente.

Os leites inoculados com a cepa O111:H8 a 103 apresentaram contagem média de 7,6x104 UFC g-1 de E. coli após a produção do queijo e de 2,5x104 UFC g-1 de psicrotróficos totais. Nas contagens de sete e quinze dias, as médias foram 1,5x107 e 1,2x109UFC g-1 para E. coli e de 1,8x108UFC g e 3,6x1010 UFC g-1 para psicrotróficos totais, respectivamente. Os leites inoculados a 105 apresentaram contagem média de 1,2x106UFC g-1 após a produção do queijo e 4,1x104UFC g-1 de psicrotróficos totais. Nas contagens de sete e quinze dias, as médias foram 1,7x107UFC g-1 e 2,5x109UFC g-1 para E. coli e de 1,0x108UFC g-1 e 3,1 x 1010 para psicrotróficos totais, respectivamente. Todos os isolados selecionados foram positivos para os genes produtores de toxina.

São escassos os relatos na literatura sobre o comportamento de STEC não-O157 sob condições que controlam o desenvolvimento microbiano em alimentos, apesar de terem sido relatadas como importante agente etiológico de doenças em humanos, em algumas regiões do mundo (PATON & PATON, 1998PATON, J.C.; PATON, A.W. Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections. Clinical Microbiology Reviews v.11, p.450-479, 1998. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9665978>. Acesso em: 02 dez. 2013.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/96659...
; BRETT et al., 2003BRETT, K.N. et al. Bovine non-O157 Shiga toxin 2-contaning Escherichia coli isolates commonly possess stx2-EDL933 and/or stx2vhb subtypes. Journal of Clinical Microbiology, v.41, p.2716-2722, 2003. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12791914>. Acesso em: 08 dez. 2013.
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). No Brasil, esse sorotipo tem sido isolado com considerável frequência em fezes bovinas (GONZALEZ, 2003GONZALEZ, A.G.M. Características fenotípicas e genotípicas de cepas de Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) isoladas de bovinos no Estado do Rio de Janeiro. 2003. 199f (Tese de Doutorado)- Pós-graduação em Microbiologia, IMPPG, Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ.; IRINO, 2005).

Em relação a E.coli, o aumento na contagem logo após o processamento do queijo demonstra que temperaturas de processamento do QMF (35° e 42°C) favorecem a atividade microbiana durante o tempo de processamento. Durante o tempo de armazenamento, houve aumento da produção microbiana mesmo a 8°C, temperatura máxima recomendada pela legislação brasileira (BRASIL,1997BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Portaria no 352, de 4 de setembro de 1997. Aprova o regulamento técnico para fixação de identidade e qualidade de queijo Minas frescal. Diário Oficial da União Brasília, de 08 de setembro de 1997, seção 1, p.19684. Disponível em: <http://extranet.agricultura.gov.br/sislegis-consulta/consultarLegislacao.do?operacao=visualizar&id=1220>. Acesso em: 05 nov. 2013.
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), portanto a temperatura de 8ºC, para o armazenamento do produto, não foi suficiente para inibir a multiplicação da cepa do presente estudo. A temperatura de armazenamento é um ponto crítico para a segurança do produto, assim como a higiene de toda cadeia produtiva do QMF, já que este caracteriza-se por ser um produto de alta umidade, a ser consumido fresco. Testes preliminares realizados, em meio de cultivo TSB, com o microrganismo em questão à temperatura de 4°C, pH 5,5 e pH 7,0 demonstraram que, apesar de ter células viáveis, houve uma redução da contagem microbiana em relação ao inoculo de até dois ciclos logarítmicos em 7 e 15 dias, sinalizando, portanto, que trabalhos futuros devem ser realizados em QMF para verificar limites seguros de temperatura, podendo levar à revisão dos limites máximos de temperatura recomendados pela legislação.

CONCLUSÃO:

Demonstra-se que, caso haja contaminação da matéria-prima com STEC não O157 (deste estudo), o processamento do QMF não elimina os microrganismos e a temperatura máxima recomendada pela legislação não inibe ou elimina o crescimento bacteriano, mantendo-se o risco à população. Reforça-se, portanto, a atenção à qualidade da matéria-prima, das ferramentas de qualidade no campo e na indústria de alimentos para garantir a inocuidade do produto final.

  • BOSILEVAC, J.M.; KOOHMARAIE, M. Prevalence and characterization of non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from commercial ground beef in the United States. Applied Environmental Microbiology, v.77, p.2103-2112, 2011.
  • BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC, no 12 de 02 de janeiro de 2001. Aprova o regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos. Diário Oficial da União, Brasília, Seção 1. Disponível em: <http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/a47bab8047458b909541d53fbc4c6735/RDC_12_2001.pdf?MOD=AJPERES>. Acesso em: 05 nov. 2013.
    » http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/a47bab8047458b909541d53fbc4c6735/RDC_12_2001.pdf?MOD=AJPERES
  • BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Portaria no 146, de 07 de março de 1996. Aprova os regulamentos técnicos de identidade e qualidade dos produtos lácteos. Diário Oficial da União, Brasília, 11 de março de 1996. seção 1. Disponível em: <http://extranet.agricultura.gov.br/sislegis-consulta/consultarLegislacao.do?operacao=visualizar&id=1218>. Acesso em: 05 nov. 2013.
    » http://extranet.agricultura.gov.br/sislegis-consulta/consultarLegislacao.do?operacao=visualizar&id=1218
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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    Jan 2015
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