Diferentes pré-inóculos, temperaturas e tempos de incubação na produção aflatoxina B1 em arroz

Different previus inoculum, temperature and incubation time in the production of aflatoxin B1 in rice

ARTIGOS CIENTÍFICOS

MICROBIOLOGIA

Diferentes pré-inóculos, temperaturas e tempos de incubação na produção aflatoxina B₁ em arroz

Different previus inoculum, temperature and incubation time in the production of aflatoxin B₁ in rice

Ana Carolina Ritter^I,1; Isa Beatriz Noll^I

^ILaboratório de Toxicologia, Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos (ICTA), Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Av. Bento Gonçalves, 9500, prédio 43212, Campus do Vale, Agronomia, Porto Alegre, RS, Brasil. E-mail: [e-mail]

RESUMO

Estudos indicam que um dos problemas mais sérios que afetam os manejos pré e pós-colheita do arroz é a presença de fungos das espécies Aspergillus ou Penicillium, potencialmente produtores de micotoxinas. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a capacidade produtora de aflatoxina B₁ de cepas isoladas do arroz e observar o efeito do pré-inóculo nas mesmas. Foram utilizados três isolados de Aspergillus flavus, conhecidamente já produtores, que foram testados nas temperaturas de 20 e 25°C, combinadas com tempos de incubação 11, 14 e 21 dias. Os pré-inóculos utilizados foram Yeast Extrat Sucrose (YES) e Czapeck Yeast Extrat (CYA). Todas as cepas retiradas do pré-inóculo em meio YES e inoculadas no arroz, em temperatura de 25°C/18 dias e 20°C/14 dias, produziram aflatoxina B₁. O meio CYA apresentou menor desempenho, uma vez que as três cepas testadas não produziram aflatoxina B₁ na combinação 20°C/14 dias. A 25°C/11 dias de incubação a aflatoxina B₁ não foi detectada.

Palavras-chave:Aspergillus flavus, CYA, YES, tempo de incubação, temperatura, arroz.

ABSTRACT

The production of aflatoxin in rice by three isolates of Aspergillus flavus was investigated for different culture conditions (temperature and incubation time) and previous inoculum (YES- Yeast Extrat Sucrose and CYA- Czapeck Yeast Extrat). All strains withdrawn from the previous inoculum medium YES and inoculated in the rice in temperature of 25°C/18 days and 20°C/14 days, produced aflatoxin B₁. The medium CYA had lower performance since the three strains tested did not produce aflatoxin B₁ in the combination 20°C/14 days. At 25°C/11 days of incubation time aflatoxin was not detectable.

Key words:Aspergillus flavus, CYA, YES, incubation time, temperature, rice.

INTRODUÇÃO

Micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por algumas espécies de fungos filamentosos que podem ocorrer em alimentos, como resultado do crescimento fúngico (GONÇALVEZ et al., 2001; GQALENI et al., 1997 SWEENEY & DODSON, 1998).

Os fungos mais comuns encontrados em alimentos e produtos estocados pertencem ao gênero Aspergillus ou Penicillium (GARCIA et al., 2002; NGUYEN et al., 2007). Algumas espécies de fungos podem produzir micotoxinas, ocasionando significativas perdas econômicas e sérios problemas à saúde humana e animal (HUSSEIN & BRASEL, 2001; IARC, 2002). No entanto, o simples isolamento e a confirmação de fungos micotoxigênicos em alimentos não indicam a presença de micotoxinas (HUSSEIN & BRASEL, 2001; GUITAKOU et al., 2006).

Mais de 20 espécies de Aspergillus produzem micotoxinas, sendo as mais comuns as da divisão flavi, que incluem três espécies: A. flavus, A. parasiticus, A. nomius (VAAMONDE et al., 2003; SALEEMULLAH et al., 2006). As quatro aflatoxinas naturalmente produzidas são B₁, B₂, G₁, G₂; sendo que a B₁ é usualmente encontrada em grandes concentrações, contaminando alimentos (D'MELLO & MACDONALD, 2002; GUITAKOU et al., 2006; MOSS, 2002).

A aflatoxina B1 possui potencial hepatotóxico, carcinogênico e teratogênico tanto em homens como em animais (SWEENEY & DOBSON,1998; MARKLINDER et al.,2005; MOSS, 2002; PILDAIN et al., 2004). Em 1993, a International Agency for Research on Câncer (IARC) (WHO-IARC,1993) considerou as aflatoxinas como carcinogênicas para humanos (grupo I) (HUSSEIN & BRASEL, 2001; IARC, 2002).

As circunstâncias que promovem a produção de aflatoxinas são geralmente mais restritas que aquelas que promovem o crescimento fúngico (GONÇALVEZ et al., 2001). Composição do substrato, temperatura, teor de água, umidade relativa do ar, atividade de água, pH e linhagem do fungo contaminante são fatores que governam a produção de aflatoxinas, sendo que a temperatura, a umidade e o tipo de substrato são os fatores mais importantes (MALLOZZI & CORRÊA, 1998; GQALENI et al., 1996 TANIWAKI & SILVA, 2001; MOLINA & GIAMUZZI, 2002; GQALENI et al., 1997).

Tendo em vista os aspectos mencionados, o presente estudo teve por objetivos avaliar a capacidade produtora de aflatoxina B₁ de três cepas de Aspergillus flavus no substrato em que foram isolados (arroz) e observar o efeito de diferentes pré-inóculos (meios de cultura sintéticos) nestas cepas conhecidamente aflatoxigênicas.

MATERIAL E MÉTODOS

Isolados utilizados

Para realização deste trabalho, foram utilizados três isolados de Aspergillus flavus, produtores de aflatoxina B₁, encontrados e identificados por HOELTZ (2005) em amostras de arroz com casca. Esses isolados foram denominados A21, A43 e A46 pela fungoteca do Laboratório de Toxicologia (ICTA/UFRGS).

Delineamento experimental

Para realização deste experimento, foi realizado um teste prévio com os três isolados em meios sintéticos (dados não publicados), em que foram testadas temperaturas de 20, 25, 30, 35 e 40°C e tempos de incubação de sete, 11, 14, 18 e 21 dias. As melhores combinações desses dias e as temperaturas encontradas (25°C/11 dias, 20°/14 dias e 25°C/18 dias) foram aplicadas nos testes com arroz.

Meios de cultivo

Meios sintéticos: YES- Yeast Extrat Sucrose (2g extrato de levedura, 150g de sacarose, 20g de agar, 0.5g de sulfato de magnésio e 100mL de água destilada); CYA- Czapeck Yeast Extrat (5,0g de extrato de levedura, 30g de sacarose, 15,0g de agar, 10,0mL^-1 de Czapeck concentrado, 1,0g de H₂HPO₄ e 100mL de água destilada); Agar Sabouraud (neopeptona 10,0g, dextrose 40,0g e ágar 20,0g (MERCK, Darmastadt, Alemanha). Meio Natural: arroz parboilizado, livre de micotoxina, com umidade inicial de 12,89%.

Análise do potencial toxigênico dos três isolados conhecidamente aflatoxigênicos

As três cepas produtoras de aflatoxina B₁ foram testadas em arroz parboilizado. A partir de cada cepa selecionada, uma suspensão de esporos foi preparada em Tween 80%. Os esporos foram contados em uma Câmara de Neubauer e o volume necessário para obter-se 10⁶ml^-1 esporos foi inoculado em erlenmeyers (125mL) com 15g de arroz estéril a 73% de umidade (atividade de água de 0,99), em duplicata (PARK & BULLERMAN, 1983). Estes foram tampados com algodão e incubados em estufa BOD em uma combinação de tempo e temperatura referentes à melhor produção de aflatoxina B₁ obtida a partir de experimentos em meios sintéticos (dados não publicados). Após este período, 30ml^-1 de metanol a 80% foram adicionados aos erlenmeyers e as toxinas foram extraídas sob forte agitação por 5 minutos. Após a filtração, os extratos obtidos foram aplicados com capilares sobre placas de sílica gel 60G (MERCK, Darmastadt, Alemanha) e eluídos com tolueno: clorofórmio: acetato de etila: acido fórmico (35:25:25:10). Após desenvolvimento do cromatograma, as placas foram visualizadas sob luz ultravioleta de comprimento de onda longo (365nm) para detecção da fluorescência característica de aflatoxina B₁ (SMEDSGAARD, 1997; GQALENI et al., 1996; VAAMONDE et al., 2003; BELLÍ et al., 2004; ABRANSON & CLEAR, 1996; LEONTOPOULOS et al., 2003; PARK & BULLERMAN, 1983; GUITAKOU et al., 2006).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As melhores condições de temperatura e tempo de incubação encontradas para produção de aflatoxina testada com os meios sintéticos foram aplicadas nos testes com arroz (25°C/11 dias, 25°/18 dias e 20°C/14 dias). Inicialmente, os fungos produtores foram retirados de pré-inóculos feitos em agar sabouraud (Tabela 1). De acordo com estes testes, apenas a cepa A43 mostrou-se produtora de aflatoxina B₁, no tempo de 18 dias, em temperatura de 25°C. Em virtude destes resultados não serem satisfatórios, realizou-se um novo experimento, em que as cepas produtoras foram inoculadas nos meios CYA e YES por sete dias (pré-inóculo). Neste teste, a contagem de esporos (provenientes dos pré-inóculos em CYA e YES) foi realizada para uma concentração de 10⁶ l ml^-1 e, em seguida, as cepas foram inoculadas nos erlenmeyers contendo as amostras de arroz (15g) a serem analisadas. A partir desse teste, verificou-se que todas as cepas retiradas do pré-inóculo em meio YES e inoculadas no arroz, em temperatura de 25°C/18 dias e 20°C/14 dias, produziram aflatoxina B₁ (Tabela 1).

Os isolados A43 e A21 retirados do pré-inóculo CYA se mostraram produtores, porém, em apenas uma condição de cultivo (25°C em 18 dias). O isolado A46 mostrou-se deficiente em relação à produção de aflatoxina quando inoculado no meio CYA. Este dado foi similar ao encontrado por PARK & BULLERMAN (1983), que concluíram que a produção de AFB₁ depende acima de tudo da linhagem isolado fúngico.após estudarem inóculo de Aspergillus flavus e parasiticus em arroz.

O meio YES utilizado como pré-inoculo apresentou maior desempenho, quando comparado com meio CYA, uma vez que houve produção de aflatoxina B₁ pelos três isolados testados (Tabela 1), além de mais de uma condição (25°/18 dias e 20°C/14 dias). LEONTOPOULOS et al. (2003) concluiram que YES Agar é um ótimo meio para biossíntese de aflatoxina B₁ e que, além de ser de fácil preparação, é relativamente barato.

Vários substratos já foram testados para verificar o potencial toxigênico fúngico. Um exemplo foi o estudo realizado por KOKKONEN et al. (2004), que, após analisarem vários substratos para examinar a capacidadedo fungo em produzir micotoxinas, verificaram que linhagens de Penicillium produziram várias micotoxinas diferentes, dependendo do meio e da linhagem. A partir deste dado, os autores concluíram que existe uma grande necessidade de se utilizar mais de um meio de cultura para verificar e identificar os metabólitos fúngicos.

O arroz se mostrou um meio utilizável para testes de potencial toxigênico devido ao fato de que todos os isolados conhecidamente aflatoxigênicos utilizados neste experimento produziram aflatoxina. PARK & BULLERMAN (1983) inocularam esporos de duas espécies de Aspergillus flavus e parasiticus, em arroz e queijo, e analisaram o efeito da variação de temperatura nestes substratos (25°C, 18°C, 5-25°C, 15°C e 5°C). Tais autores concluíram que o queijo não é um bom substrato para produção de aflatoxinas, ao contrário do arroz.

De acordo com RAYBAUDI et al. (2000), em um estudo de potencial toxigênico, realizado com isolado de Aspergillus flavus e parasiticus, cerca de 37% dos isolados apresentaram produção de aflatoxinas em arroz, enquanto que somente cerca de 4% dos testados produziram aflatoxinas em ágar coco. Já BRESLER et al. (1995) inocularam espécies de Aspergillus em arroz e constataram que quatro de 34 isolados de A. flavus foram produtores de aflatoxinas e seis de um total de 12 A. parasiticus se mostraram aflatoxigênicos neste meio. Tais autores concluíram que fungos toxigênicos podem ser facilmente encontrados, mas a produção de micotoxinas pode aparecer somente durante uma prolongada estocagem de produtos contaminados.

As temperaturas de 20°C e 25°C mostraram-se boas para produção de aflatoxina B₁ nas amostras de arroz analisadas neste trabalho. Para OSWEILER (1998), a faixa de temperatura para formação de aflatoxinas é de 25°C a 32°C, contudo, a temperatura de 13°C por dois ou mais dias ainda permite a formação de aflatoxina. SAMAPUNDO et al. (2007), ao inocularem A.flavus em grãos de pipoca, verificaram que os isolados testados tiveram ótimo crescimento a 30°C.

PARK & BULLERMAN (1983) demonstraram que a produção de aflatoxinas pode ser afetada por flutuação de temperatura. A exposição de A. parasiticus a temperaturas altas (entre 40 e 50°C), por um curto período de tempo, reduz o crescimento e a produção de aflatoxinas.

No que se refere ao crescimento fúngico no arroz analisado, pode-se perceber que a partir do 2^o dia de incubação em qualquer uma das temperaturas testadas já houve um crescimento superficial destes bolores. Estes dados novamente são similares com os obtidos por PARK & BULLERMAN (1983), que também notaram um crescimento de Aspergillus flavus a partir do segundo dia de incubação, na temperatura de 25°C. GQALENI et al. (1997) demonstraram em seu estudo que as espécies de Aspergillus flavus estudadas tiveram uma ótima temperatura para colonização do substrato na faixa de 25 a 30°C. Segundo TANIWAKI & SILVA (2001), o A. flavus apresenta temperatura mínima de crescimento por volta de 12°C, máxima próxima de 48°C e ótima entre 30 e 42°C.

No 11^o dia, o crescimento atingiu seu máximo. A esporulação dos isolados foi notada a partir do 7o dia. Para LEONTOPOULOS et al. (2003), o máximo crescimento do micélio de um isolado de Aspergillus flavus foi ao 6^o dia após a inoculação. Depois deste período, uma moderada desaceleração do crescimento do micélio foi observada. Tais resultados indicam também a importância que o meio YES exerce sobre os isolados fúngicos em relação à esporulação fúngica. PARK & BULLERMAN (1983) constataram que o crescimento de Aspergillus flavus e A. parasiticus em ágar BDA não foi bom, pois não houve esporulação suficiente. A partir deste resultado, antes de inocularem os esporos desses isolados em arroz, esses pesquisadores fizeram o crescimento destes isolados em meio YES, sendo que a esporulação foi notoriamente boa para contagem de esporos e inoculação no meio natural.

BU'LOCK (1965) afirma que o mecanismo de esporulação tem uma conexão com metabólitos secundários. Para PARK & BULLERMAN (1983), o tempo requerido para iniciar o crescimento e a esporulação de Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus em amostras de arroz foi afetado pela temperatura, pelo substrato e pela linhagem do fungo. O início do crescimento ocorreu mais rápido a 25°C, seguido de 18°C da temperatura cíclica (5-25°C) e 15°C. Esses autores concluíam que a temperatura foi um fator determinante para o crescimento e a esporulação fúngica.

A atividade de água de 0,99 do arroz mostrou-se boa para produção de aflatoxinas, conferindo com os resultados encontrados por GQALENI et al. (1997), em que a atividade de água do substrato (CYA e YES) de 0,99 foi considerada ótima para produção de aflatoxinas. No mesmo, estudo a produção de aflatoxina foi afetada por diferentes substratos, tempos de incubação e presença de outras micotoxinas produzidas por A. flavus. Samapundo et al (2007) observaram que isolados de Aspergillus, quando inoculados em grãos de pipoca, não cresceram em atividade de água de 0.801. Em geral, as aflatoxinas são produzidas a valores de aw de 0,95 a 0,99 com um valor mínimo de 0,82 para A.flavus (ICMSF,1996; NIELSEN, et al., 2004).

CONCLUSÃO

Os resultados deste estudo sugerem que os meios sintéticos CYA e, principalmente, YES servem como um execelentes substratos (pré-inóculo) para produção de aflatoxinas, pois demonstram que são capazes de ativar a produção das mesmas. O arroz, quando incubado em um período de 14 ou 18 dias em temperaturas de 20 e 25°C, também mostrou-se um bom substrato natural para detecção de aflatoxina B1. Estes dados revelam também que temperatura e umidade devem ser evitadas nos silos de armazenamento de arroz. A quantificação de aflatoxina B1 e os fatores que levam os meios CYA e YES utilizados como pré-inóculos a promoverem uma melhor produção de aflatoxinas refletem a necessidade de novos estudos.

Recebido para publicação 17.01.08

Aprovado em 04.06.08

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1

Autor para correspondência.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  02 Jul 2008
• Data do Fascículo
  Dez 2008

Histórico

• Aceito
  04 Jun 2008
• Recebido
  17 Jan 2008