Ocorrência e diferenciação de espécies de Listeria spp. em salsichas tipo hot dog a granel e em amostras de carne moída bovina comercializadas no Distrito Federal

Occurrence and differentiation of Listeria spp. in “hot dog” sausages sold in bulk and ground beef samples marketed in the Federal District, Brazil

ARTIGOS CIENTÍFICOS

MICROBIOLOGIA

Ocorrência e diferenciação de espécies de Listeria spp. em salsichas tipo hot dog a granel e em amostras de carne moída bovina comercializadas no Distrito Federal

Occurrence and differentiation of Listeria spp. in “hot dog” sausages sold in bulk and ground beef samples marketed in the Federal District, Brazil

Rafael Rocha de Andrade^I; Patrícia Helena Caldeira da Silva^II; Nara Rúbia Souza^II; Luci Sayori Murata^II; Vitor Salvador Picão Gonçalves^II; Angela Patrícia Santana^II,1

^IFaculdade de Medicina, Universidade de Brasília (UnB), Brasília, DF, Brasil

^IIFaculdade de Agronomia e Medicina Veterinária (FAV), UnB, 70910-900, Brasília, DF, Brasil. E-mail: [e-mail]

RESUMO

Listeria monocytogenes é um patógeno relevante veiculado por alimentos. Sua identificação precisa é importante para a correta determinação do risco associado à ingestão do alimento. O objetivo deste trabalho foi verificar a ocorrência das espécies de Listeria spp. em amostras de salsichas tipo hot dog e carne moída bovina, comercializadas a granel no Distrito Federal. Foram analisadas 162 amostras, sendo 127 de salsichas tipo hot dog e 35 amostras de carne moída bovina. O isolamento e a identificação do gênero foram feitos por metodologia convencional e a distinção das espécies foi verificada por kit bioquímico específico (API-Listeria^®) e por análise de restrição de fragmentos da reação em cadeia da polimerase (RFLP-PCR) do gene 23 rRNA. Foram isoladas 26 cepas de Listeria spp. das amostras de salsichas tipo hot dog, sendo identificadas 18 cepas de Listeria innocua e 08 cepas de Listeria monocytogenes. Das 35 amostras de carne moída bovina, foram isoladas 16 cepas de Listeria spp., sendo identificadas 12 cepas de Listeria innocua e 04 de Listeria monocytogenes. Houve concordância total na distinção das espécies de Listeria spp. através dos dois métodos empregados. A presença de Listeria spp. em amostras de salsicha do tipo hot dog a granel e em carne moída bovina a granel, de estabelecimentos comerciais do Distrito Federal, representa risco à saúde do consumidor.

Palavras-chave:Listeria monocytogenes, produtos cárneos, PCR.

ABSTRACT

Listeria monocytogenes is a pathogen disclosed by foods. Its accurate identification is important for the correct determination of the risk associated with the ingestion of food. The aim of this research was to determine the occurrence of Listeria spp. in samples of hot dog sausages and ground beef, sold in bulk in the Federal District. A total of 162 samples, 127 hot dog sausages and 35 samples of ground beef cattle, were analyzed. The isolation and identification of the genus were made by conventional methodology and distinction of species was verified by specific biochemical kit (API-Listeria^®) and by restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) of 23S rRNA gene. Twenty-six strains of Listeria spp. were isolated. Samples of hot dog sausages identified 18 strains of Listeria innocua and 08 strains of Listeria monocytogenes. Of the 35 samples of ground beef cattle were isolated, 16 strains of Listeria spp., 12 strains of Listeria innocua and 04 strains of Listeria monocytogenes. There was total agreement in the distinction of Listeria species using the two methods. The presence of Listeria spp. in samples of hot dog sausages and ground beef, sold in bulk in commercial establishment of the Federal District represents a risk to consumer health.

Key words:Listeria monocytogenes, meat products, PCR.

INTRODUÇÃO

O gênero Listeria compreende seis diferentes espécies: L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. monocytogenes, L. seeligeri e L. welshimeri (VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001). A associação da L. monocytogenes com alimentos contaminados sugere que esta seja a principal forma de transmissão da listeriose humana, com a maioria dos casos em indivíduos imunossuprimidos, crianças e gestantes (JERSEK, 1999). Segundo LECUIT (2007), o potencial de letalidade está acima de 30%. A ocorrência dessa bactéria em alimentos cárneos refrigerados foi observada em 20% das amostras de frango na Malásia (GOH et al., 2012) e em 26,4% em carcaças bovinas na China (ZHU et al., 2012). Esse microrganismo apresenta como característica a tolerância a baixas temperaturas, o que favorece muitas vezes altas prevalências (SCHMID et al., 2009; ZHU et al., 2012). A L. monocytogenes é considerada patogênica para o homem e a de maior importância para a saúde pública, embora existam evidências de que cepas de L. ivanovii também possuam potencial patogênico (McLAUCHLIN, 1997). São cosmopolitas e facilmente encontradas no solo, nas fezes dos animais e na água (PAILLARD et al., 2003).

Um dos maiores desafios atualmente é a ausência de um método eficiente para se distinguir L. monocytogenes de outras espécies de Listeria associadas na mesma amostra de alimento, especialmente L. innocua. Nos últimos anos, poucos trabalhos fizeram distinção entre diferentes espécies de Listeria em amostras isoladas de alimentos, e a maioria deles faz menção apenas da presença de bactérias do gênero (LACIAR et al., 2006). Em alguns casos, a diferenciação se faz apenas por meio de análises fenotípicas das colônias em meios de cultivo, podendo haver falhas na especificidade e tornando oneroso o preço da análise, devido ao alto custo dos meios empregados.

Tendo em vista a importância deste microrganismo no contexto da saúde pública, no que diz respeito à segurança dos alimentos de origem animal, e por se tratar de um microrganismo potencialmente patogênico, este trabalho teve como objetivo verificar a ocorrência de Listeria monocytogenes em salsichas tipo hot dog a granel e em amostras de carne moída bovina comercializados no Distrito Federal, isolar por método tradicional e identificar as espécies através da comparação entre os métodos API-Listeria e RFLP-PCR do gene 23S rRNA.

MATERIAL E MÉTODOS

Origem das amostras

Foram adquiridas 127 amostras de salsichas tipo hot dog comercializadas a granel e 35 amostras de carne moída bovina provenientes de estabelecimentos comerciais diversos, localizados no Distrito Federal, escolhidas ao acaso, simulando assim uma situação real de compra pelo consumidor. Cada unidade de amostra adquirida era composta por 100g em bandejas não havendo uma marca específica. Essas amostras foram individualizadas em sacos plásticos do próprio estabelecimento e acondicionadas sob refrigeração a 4°C para em seguida proceder ao transporte e o posterior isolamento microbiológico.

Isolamento de Listeria monocytogenes

A etapa de isolamento microbiológico do gênero Listeria seguiu a metodologia preconizada pela Instrução Normativa no 40 (Brasil, 2005). Assim, 25g±1,0g das amostras foram pesadas em sacos de homogeneização estéreis, sendo adicionados 225mL de caldo UVM para incubação a 30°C±2°C por 24 horas. Em seguida, transferiu-se 0,1mL do caldo UVM para 10ml de caldo Fraser, incubados a 35°C por 26h. Distribuiu-se 0,1mL do caldo Fraser, que apresentava hidrólise da esculina, para uma placa de ágar MOX, incubando em seguida a 35°C por 24h. As colônias pequenas e com halo de hidrólise de esculina foram colhidas e plaqueadas em ágar sangue de carneiro a 7% para a realização dos testes bioquímicos.

Identificação das cepas isoladas pelo método API-Listeria e RFLP-PCR

Foram utilizados controles positivos de cepas L. monocytogenes oriundos da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ - Rio de Janeiro), tanto para cultivo microbiológico como para análise molecular. A identificação das cepas foi realizada com kits comerciais API-Listeria^®(API^®-Listeria, bioMérieux, Marcy-l'Etoile, França). Para a realização da extração de DNA, uma colônia isolada de Listeria spp. da placa de ágar sangue foi selecionada e inoculada em um tubo falcon de 15ml, contendo 3ml de caldo L (peptona de caseína 1%, extrato de levedura 0,5% e cloreto de sódio 1%) esterilizado em autoclave a 121°C por 20 minutos e incubada em estufa com agitação (New Brunswick Scientific, Edison, N.J., USA) à 200 rpm, 37°C por 12h. Foram utilizados 400 µl dessa cultura para proceder à extração de DNA com fenol/clorofórmio (1:1), segundo SAMBROOK et al. (2001). Posteriormente, foi realizada a quantificação de DNA total da amostra com marcador de massa molecular High Mass^®Ladder Invitrogen e com visualização em gel de agarose 0,8% com brometo de etídio a 0,02% em transiluminador (Vilbert Lourmat, Marne La Vallee, França)

Na etapa de realização da PCR, das cepas isoladas das amostras, foram utilizados dois pares de oligonucleotídeos (primers), S1 e S2, segundo metodologia descrita por PAILLARD et al. (2003). As sequências dos oligonucleotídeos foram S1F (5' agtcggatagtatccttac 3'), S1R (5' ggctctaactacttgtaggc 3'), S2F (5' gcctacaagtagttagagcc 3') e S2R (5' actggtacaggaatctctac 3'), sendo que eles amplificam fragmentos de 460bp e 890bp, respectivamente, do gene 23S rRNA. A programação utilizada para a amplificação dos fragmentos no termociclador (PTC-100, M.J Research Inc., Watertown, USA) foi de 29 ciclos para a seguinte combinação de temperaturas: 95°C por 2min, 94°C por 1min, 57°C por 1min, 72°C por 2,5min e 72°C por 5min. Ao final, a temperatura 4°C foi programada para a retirada dos tubos. As concentrações das soluções para a PCR foram de DNTP (2mM), tampão com concentração final de 1X, MgCl₂ de concentração final de 2,5mM, 10pmoles mL^-1 de cada oligonucleotídeos e 4ng ml^-1 DNA total da amostra, completando-se o volume final de 50 µl com água milli-Q esterilizada. A visualização e a quantificação dos fragmentos S1 e S2 foi realizada com marcador de massa molecular Low Mass Ladder Invitrogen^® em gel de agarose 1,5% com adição de brometo de etídio na concentração de 0,02% e visualizado em transiluminador.

Para a identificação e confirmação da espécie, foram realizadas duas análises de restrição (RFLP) do amplicon de 890bp (S2), obtidas através de digestões com as endonucleases XmnI e CfoI com incubação em banho-maria a 37°C por 2h, segundo metodologia proposta por PAILLARD et al. (2003). Para tanto, em um volume final de 25?L, foram utilizados 100ng do amplicon S2, Tampão Multi-Core^TM com concentração final de 1X (Promega Corporation, Madison, USA), 10 µg µl-1 de BSA acetilado e 2U de endonuclease. Os perfis de restrição foram visualizados em gel de agarose 2,0%, contendo brometo de etídio na concentração de 0,02% em transiluminador. O produto de PCR S2 (890bp) foi cortado primeiramente com a endonuclease XmnI, resultando nos perfis: a) 650pb, 120pb e120pb para as espécies de L. grayi, L. innocua ou L. welshimeri e b) perfil de 770pb e 120pb para L. monocytogenes, L. seeligeri ou L. ivanovii. A restrição do produto de PCR S2 pela CfoI individualiza a L. grayi (600pb, 170pb, 120pb) e L. monocytogenes (470pb, 170pb, 130pb e 120pb). O perfil do corte do S2 (890bp) com CfoI de L. innocua ou L. welshimeri (470pb, 170pb, 130pb e 120pb) e o perfil de L. seeligeri ou L. ivanovii (600pb, 170pb e 120pb) são presuntivos. A digestão do produto de PCR S1 (460pb) com a enzima AluI diferencia a L. innocua (460pb, 330pb e 130pb) da L. welshimeri (270pb, 190pb, 150pb e 120pb) e a digestão do S1 por ClaI diferencia a L. ivanovii (460pb) da L. seeligeri (350pb e 110pb).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Ocorrência de cepas de Listeria spp. em amostras de salsichas tipo hot dog

Das 127 amostras de salsicha tipo "hot dog" a granel, foram isoladas 26 (20.4%) cepas de Listeria spp. Os resultados da análise de identificação bioquímica realizada pelo kit Api-Listeria^® revelaram que, das 26 cepas, 8 (6,2%) eram de L. monocytogenes e 18 (14,1%) eram de L. innocua.

Estes resultados são similares aos observados por PETINATI et al. (2006) na cidade de São Paulo, no que se refere à presença de L. monocytogenes em amostras de salsichas tipo hot dog, com a presença de 55,4%. Entretanto, esses autores não realizaram a identificação das outras espécies de Listeria. BORGES et al. (1999) observaram que, de 81 amostras de salame coletadas na cidade do Rio de Janeiro, 12 (14,8%) estavam contaminadas por Listeria spp., sendo 6 (50%) identificadas como L. innocua e 6 (50%) como L. monocytogenes.

COLAK et al. (2007) constataram, em 300 amostras de salsicha fermentada (chouriço turco), em Istambul, 63 (21%) positivas para bactérias do gênero Listeria spp., sendo 35 (11,6%) identificadas como Listeria monocytogenes. MENA et al. (2004), em Portugal, observaram uma (3,7%), em 27 amostras de alimentos cárneos refrigerados, contaminada por essa bactéria.

Vale ressaltar que a contaminação por L. monocytogenes em alimentos prontos para consumo, como, por exemplo, a salsicha tipo hot dog, é mais preocupante do que a contaminação por essa bactéria em alimentos que serão submetidos ao cozimento. Isso se deve ao hábito de muitas pessoas consumirem esses produtos sem antes submetê-lo a um tratamento térmico, pois esse microrganismo possui a habilidade de crescer em temperaturas de refrigeração e a capacidade de formar biofilmes (PELISSER et al., 2001; LIU et al., 2002)..

A metodologia de isolamento de L. monocytogenes proposta pela Instrução Normativa no 40 (BRASIL, 2005) foi eficaz e proporcionou o isolamento de culturas puras de bactérias do gênero Listeria spp. Os inconvenientes desse método foram o tempo de isolamento, de aproximadamente sete dias, e o custo elevado dos meios de cultura necessários, conforme metodologia proposta.

Ocorrência de cepas de Listeria spp. em amostras de carne moída bovina

Das 35 amostras de carne moída bovina, isolaram-se 16 (45,7%) cepas de Listeria spp.. Os resultados da análise bioquímica realizada pelo kit API-Listeria^® revelaram que, dessas 16 cepas, 4 (11,4%) foram L. monocytogenes e 12 (34,2%) L. innocua.

KASNOWSKI (2004), em pesquisa realizada na cidade do Rio de Janeiro, com amostras de alcatra bovina, observou que, de um total de 173 cepas de Listeria spp. isoladas, 72 (41,62%) eram originárias de peças inteiras (cortes) e 101 (58,38%) de carne moída, sendo a L. innocua mais observada que a L. monocytogenes. De modo similar, MANTILLA et al. (2007b) verificaram a presença de Listeria spp. em 30 amostras de carne moída bovina, também na cidade do Rio de Janeiro, na qual 15 (50%) amostras estavam contaminadas e, desse total, 13 (86%) eram L. innocua e duas (14%) L. monocytogenes. OKTEN et al. (2006), na Turkia, verificaram que, de 30 amostras de carne bovina, quatro (13,75%) estavam contaminadas por Listeria monocytogenes. MANTILLA et al. (2007a) justificam que a carne moída é um alimento que possui maior risco de contaminação por Listeria spp., uma vez que é preciso a manipulação para sua fabricação e por possuir maior área de superfície. Entretanto, um estudo mais aprofundado deve ser conduzido no sentido de se verificar qual ou quais os principais pontos de incorporação dessa bactéria neste tipo de alimento.

No estudo de prevalência de Listeria spp. em produtos cárneos, em vários países (entre os anos de 1971 e 1994), JAY et al. (1996) afirmam que a contaminação de L. monocytogenes é altamente variável neste tipo de alimento e que a ocorrência média desta bactéria encontrada foi de 16%. Segundo esses autores, a detecção desta bactéria em carnes era esperada devido à sua ampla disseminação na natureza, e também sugere que essa bactéria esteve sempre presente nos produtos cárneos e seus derivados, fato que a fez ser considerada como indicadora biológica de contaminação ambiental ou fecal. MENA et al. (2004) relatam que, de 17 amostras de carne crua analisadas em Portugal, três (17,7%) estavam contaminadas com L. monocytogenes, afirmando ainda que a ocorrência dessa bactéria em carnes cruas se deve ao fato de sua natureza ubiquitária.

Extração e quantificação de DNA total e realização da RFLP-PCR das cepas de Listeria spp. isoladas de salsichas tipo hot dog e carne moída bovina

Após a extração de DNA total de 400 µL dos inóculos em meio L, obteve-se concentração média aproximada de DNA total de 6ng µl-1. A extração de DNA total, por fenol/clorofórmio (1:1) foi realizada com êxito em todas as 42 cepas de Listeria spp. isoladas dos dois tipos de alimentos de origem animal.

Em seu estudo, PAILLARD et al. (2003) também obteve êxito na forma de obtenção de DNA total em todas as 182 cepas de Listeria spp. testadas. Porém, esse processo foi realizado por meio de fervura das cepas. Neste trabalho, optou-se por realizar a extração de DNA total por meio do fenol/ clorofórmio para se minimizar o risco de reações inespecíficas da PCR ou de falsos negativos, devido ao excesso de proteínas.

A PCR com os primers descritos por PAILLARD et al. (2003) foi realizada com êxito em todas as 42 cepas de Listeria spp., isoladas previamente dos dois tipos de alimentos, e proporcionou em todas as amostras a obtenção de fragmentos S1 (460pb) e S2 (890pb), que foram quantificados através do uso do marcador Low Mass Invitrogen^® (Figura 1A). A menos que se faça o sequenciamento de cada um deles, estes oligonucleotídeos não permitem diferenciar as espécies, apenas confirmam o gênero Listeria. Vale ressaltar que as cepas utilizadas como template por PAILLARD et al. (2003) foram isoladas de seis efluentes de estações de tratamento de água, localizados na cidade Bordeaux, França. Os mesmos oligonucletídeos funcionaram com as cepas oriundas de outra matriz, sugerindo a conservação do gene 23S rRNA.

A figura 1B mostra os amplicons S2 de três cepas isoladas de amostras de salsichas tipo hot dog a granel, submetidos individualmente à reação enzimática com a endonuclease XmnI, o que resultou em fragmentos de 770pb e 120pb, característicos das espécies L. monocytogenes, L. seeligeri ou L. ivanovii, e de 650pb, 130pb e 120pb no caso de detecção das espécies L. innocua, L. grayi e L.welshimeri.

Após a análise de restrição com a enzima XmnI, os amplicons S2 (890pb) dessas três amostras foram submetidos individualmente a uma segunda reação enzimática, dessa vez utilizando a enzima CfoI (Figura 1C). A análise de restrição dessa reação enzimática demonstrou a presença de fragmentos de 470pb, 170pb, 130pb e 120pb nas três amostras. Dessa forma, as duas amostras que obtiveram fragmentos de 770pb e 120pb, após digestão com a enzima XmnI (A.3 e A.5 da Figura 1A), foram identificadas como L. monocytogenes. A amostra presente em C.4 da figura 1C foi submetida a uma nova reação de digestão enzimática para diferenciação da espécie envolvida, utilizando o amplicon S1 (460pb) com a enzima AluI (Figura 1D), obtendo os fragmentos de 330pb e 130pb, que caracterizaram a espécie Listeria innocua, conforme descrito por PAILLARD et al. (2003).

Neste estudo, a análise de restrição dos produtos de PCR S1 e S2 identificou a espécie de Listeria spp. em todas as amostras previamente isoladas de salsichas tipo hot dog e carne moída bovina, a granel, comercializadas no Distrito Federal, conforme metodologia desenvolvida por PAILLARD et al. (2003). Todas as cepas de Listeria spp. identificadas pela RFLP em nosso estudo apresentaram concordância com a identificação obtida pelo teste de identificação bioquímica realizada pelo kit comercial API-Listeria^®.

CONCLUSÃO

Neste estudo, foi possível verificar a ocorrência de Listeria spp. em amostras de salsicha do tipo "hot dog" e carne moída bovina do Distrito Federal, com o isolamento de 42 cepas e, destas, 8 (6,2%) eram Listeria monocytogenes, 18 (14,1%) L. innocua em salsichas, 4 (11,4%) L. monocytogenes e 12 (34,2%) L. innocua em carne moída bovina. A identificação foi possível tanto pela RFLP-PCR como pelo API^®-Listeria. Por se tratar de uma doença de grande interesse na saúde pública, uma vez que possui alta taxa de letalidade, a biologia da Listeria spp. precisa ser melhor estudada para que ocorra maior controle dessa bactéria associada à linha de produção na indústria de produtos cárneos.

Recebido 24.05.12

Aprovado 08.08.13

Devolvido pelo autor 01.12.13

CR-2012-0308.R2

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Autor para correspondência.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  18 Dez 2013
• Data do Fascículo
  Jan 2014

Histórico

• Aceito
  08 Ago 2013
• Recebido
  24 Maio 2012