CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE COM CORANTE RED A versus TROCA IÔNICA-PERMEABILIDADE EM GEL: COMPARAÇÃO DA PRATICIDADE NA PURIFICAÇÃO DE ENTEROTOXINA ESTAFILOCÓCICA A

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE COM CORANTE RED A versus TROCA IÔNICA-PERMEABILIDADE EM GEL: COMPARAÇÃO DA PRATICIDADE NA PURIFICAÇÃO DE ENTEROTOXINA ESTAFILOCÓCICA A¹

M. KAMOGAE²,N. MIYA³, J.L. PEREIRA³,^*, E.Y. HIROOKA²

RESUMO

O presente trabalho compara processos de purificação de enterotoxina estafilocócica A, utilizando cromatografia de afinidade com corante Red A em relação a troca iônica (SP — Sephadex C-25) — permeabilidade em gel (Sephadex G-75). Aplicou-se nas colunas o sobrenadante da cultura de Staphylococcus aureus 722 em caldo contendo 3% de triptona e suplementado com 1% de extrato de levedura, previamente concentradas com Amberlite CG-50. O processo capturou rapidamente a EEA, porém a proporção de 15 mg de resina para 150 mg de toxina causou saturação, recuperando apenas 10 a 30% de toxina do sobrenadante. A cromatografia de afinidade com Red A permitiu a recuperação de 60,87% de toxina aplicada em 76 horas, em relação a 114 horas requeridas para purificação utilizando coluna de troca iônica e permeabilidade em gel, com rendimento de 6,5%. O perfil eletroforético das amostras purificadas indicaram que, a toxina obtida da coluna Red A apresentou teor de pureza superior, na ordem de 90%, em relação a 60% atingida pelo método clássico.

Palavras-chave: Enterotoxina, estafilococo, purificação, cromatografia de afinidade.

SUMMARY

DYE LIGANT RED A AFFINITY CHROMATOGRAPHY versus ION EXCHANGE PLUS GEL FILTRATION COLUMN: COMPARISON OF THE PRACTICITY IN STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN A PURIFICATION. Culture supernatant of Staphylococcus aureus 722 in 3% triptone plus 1% yeast extract was used for EEA purification, proceeding comparison between dye ligand Red A affinity chromatography and classic chromatography. The capture of SEA with Amberlite CG-50 allowed rapid enterotoxin concentration from the culture supernatant. However, the ratio of 15 mg of the resin to a total of 150 mg of the toxin satured the resin, giving only 10 to 30% of SEA recuperation from the supernatant. The elution of concentrated material throught the Red A column resulted in a recovery of 60,87% of the toxin, and required 76 hours, indicating advantage on classic chromatography. Ion exchange column plus gel filtration recovered only 6,5 % of the SEA, and required 114 hours to conclude the procedure. The eletrophoresis of purified SEA indicated high grade of toxin obtained from Red A column, with 90 % of purity, compared to 60 % of classic column.

Keywords: enterotoxin, Staphylococcus, purification, affinity chromatography.

1 — INTRODUÇÃO

Staphylococcus aureus é um patógeno frequentemente envolvido em surtos de intoxicação alimentar, devido a versatilidade nutricional e capacidade de crescimento em condições ambientais, colocando em risco os alimentos das mais variadas composições [1, 7, 15]. A detecção rápida e eficaz de seus metabólitos requer métodos imunológicos, com limite de sensibilidade entre 1 e 2 ng/g para enterotoxina estafilocócica, já que surtos podem ser desencadeados pela ingestão de 1 a 1000ng/g de EEA [3, 13, 14].

Considerando que a pureza de antígeno seja essencial à produção de reagentes imunológicos, a literatura descreve métodos cromatográficos desde 1959 [2]. O procedimento clássico envolve adsorção em Amberlite CG-50, seguida de filtração em cromatografia de troca iônica e permeabilidade em gel [5]. GENIGEORGES & KUO [8] simplificaram o processo, introduzindo cromatografia de afinidade, acoplando-se IgG em CNBr-Sepharose 4B ativada.

Ainda assim, o elevado custo dos kits comerciais limita a disseminação da detecção direta de enterotoxinas estafilocócicas no controle de qualidade. A dificuldade ocorre principalmente nos países em desenvolvimento, onde S. aureus se destaca entre os agentes mais comuns de toxiinfecção alimentar [20]. REYNOLDS et al [16] inovaram o processo, introduzindo a cromatografia de afinidade com a tiazina acoplada à agarose, que atualmente é comercializada, sob denominação de Red A [11]. Considerando que o fornecimento de enterotoxina pura, a custo acessível seja a primeira etapa para a obtenção de reagentes imunológicos, o presente trabalho analisa a cromatografia de afinidade com Red A em relação ao método clássico, na tentativa de reduzir o custo e o tempo de purificação.

2 — MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 - Microrganismo

S. aureus 722, produtor de EEA, cedido por Dr. Merlin S. Bergdoll de Food Research Institute — FRI, University of Wisconsin -USA foi aderida em pérola de porcelana e preservada em tubo de ensaio acondicionado com sílica ativada e lã de vidro. Para reativação, transferiu-se uma pérola de porcelana impregnada com estafilococo, em 100 ml de caldo BHI (Difco) e incubou-se a 37º C por 24 horas. Após a confirmação de toxigenicidade pelo método de OSP [17], preparou-se o inóculo, transferindo-se 2ml de cultivo para 50ml de BHI e incubou-se a 37ºC por 24 horas.

2.2 - Produção de EEA

S.aureus 722 foi inoculado em meio contendo 3% de triptona, adicionado de 1% de extrato de levedura a pH 6,5. Procedeu-se cultivo em saco de diálise [6] para purificar EEA através de cromatografia de afinidade por corante Red A e cultura em frasco sob agitação, para troca iônica e filtração em gel [5].

Para o cultivo em saco de diálise, introduziu-se 100 ml do meio de cultura em 60 cm de tubo de diálise (Seamless cell 24x100 CLR) acondicionado em erlenmeyer, contendo 100 ml de tampão fosfato 0,02M pH 7,4 com 0,9% de NaCl. O frasco foi inoculado com 2 ml de S.aureus 722 cultivado em BHI e incubado a 37º C por 24 horas a 220 rpm.

Para a cultura sob agitação, empregou-se frascos tipo "Fermainback " de 2800 ml, contendo 600 ml de meio e inoculou-se com 5% (V/V) de cultura de S.aureus 722. Após incubação a 37º C por 24 horas, procedeu-se centrifugação a 10.000 x g a 4ºC e o sobrenadante adicionado de 1:20.000 de mertiolate, estocado a -15º C.

2.3 - Concentração de EEA

A EEA presente em quatro litros de sobrenadante de cultura foi capturada, mediante adsorção com 150 ml de resina Amberlite CG 50 (Sigma), previamente ativada conforme CHU et al [6]. O sobrenadante diluído com 16 litros de água destilada e ajustado a pH 5,6 foi adicionado de resina e submetido a agitação por uma 1 hora. Após o descarte do sobrenadante, a resina foi lavada 3 a 4 vezes com água destilada e a EEA, eluída em três etapas com 250, 100 e 100 ml de tampão fosfato 0,5M pH 6,2 contendo NaCl 0,5M. O eluído foi concentrado, dialisando-se contra polietileno glicol-PEG 15.000 a 20.000 para o volume final de 80 ml. A seguir procedeu-se outra diálise contra os mesmos tampões utilizados para as respectivas cromatografias e centrifugadas a 10.000 x g por 15 min a 4ºC.

2.4 - Cromatografia de afinidade por corante Red A

Para o procedimento empregou-se a metodologia preconizada por REYNOLDS et al [16] e BREHN et al [4].

O concentrado contendo EEA, dialisado contra tampão fosfato 0,01M pH 6,5, foi aplicado na coluna 2,2 x 40 cm de corante Red A (Sigma). O fluxo foi controlado para uma velocidade de 70 ml/h e a eluíção realizada com 700 ml do mesmo tampão, seguido de 500 ml deste a 0,15M pH 6,8 e 800 ml a 0,30M pH 6,8. Os eluídos que correspondiam a 1ml, foram coletados em coletor de frações (LKB BROMA) e o conteúdo protéico monitorado em absorbância a 277 nm (VARIAN SERIE 634). Nos picos suspeitos procedeu-se o ensaio de OSP-optimun sentitive plate [17] e as frações positivas para EEA foram combinadas, concentradas com PEG 15.000 a 20.000 e dialisadas contra tampão fosfato 0,005M pH 6,8. Após análise de pureza pela eletroforese em gel de poliacrilamida e SDS [10], o material foi liofilizado e estocado a 4ºC. O conteúdo protéico total no liofilizado foi determinado pelo método de LOWRY [12] e a quantidade de EEA, pela fórmula padronizada por SCHANTZ et al [18].

2.5 - Cromatografia de troca iônica e permeabilidade em gel

O método baseou-se na purificação de EEA através de cromatografias sequenciais, descrito por CHU et al [5].

Na cromatografia de troca iônica, o concentrado contendo enterotoxina e dialisado contra tampão citrato 0,01M pH 5,0 foi aplicado na coluna 2,5 x 17 cm de SP-Sephadex C-25 (Sigma) e lavado com 500 ml do mesmo tampão. Sob velocidade de 0,97 ml/min, a EEA foi eluída utilizando-se gradiente linear com 600 ml de tampão citrato 0,01M pH 5,0 e 600 ml deste a 0,025M pH 7,5 (Pharmacia FRAC 200 LCD RS 232). Após determinação de concentração protéica por método de LOWRY [12] e de enterotoxina por OSP [17], as frações correspondentes aos picos de EEA foram combinadas e concentradas com PEG 15.000— 20.000, para um volume final de 2,5 ml. A seguir procedeu-se cromatografia de filtração em gel, aplicando o material na coluna 1,6 x 100 cm de Sephadex G-75 (Sigma) e eluiu-se com tampão fosfato 0,05M pH 6,8 contendo NaCl a 1,0 M, numa velocidade de 1,0 ml/min. As frações contendo EEA foram combinadas, dialisadas contra tampão fosfato 0,005M pH 6,8 e o grau da pureza avaliada pela eletroforese [10].

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 - Produção e concentração de EEA

A produção de EEA por S. aureus 722 pelas técnicas empregadas atingiu concentração de 40 mg/ml. Embora a técnica de produção da toxina pelo cultivo em frasco sob agitação (item 2.2) seja suficiente para a purificação de EEA pela cromatografia clássica de CHU et al [5], a cromatografia de afinidade com Red A cujo processo utilizou apenas uma etapa cromatográfica, necessitou de um sobrenadante com menor teor de impurezas. O requisito foi atingido, empregando-se cultivo em saco de diálise (item 2.2), já que o processo permitiu obtenção de sobrenadante límpido, possibilitando a purificação de toxina pela cromatografia com Red A.

A concentração de EEA, baseado na adsorção por Amberlite CG-50, permitiu eliminar uma grande percentagem de constituintes advindos do meio de cultura e metabólitos bacterianos. A subsequente eluição com tampão, concentração com PEG e diálise, permitiu obtenção de material límpido contendo 56mg de EEA, enquanto que o método de frascos sob agitação rendeu 15mg. Os resultados demonstraram perda significativa de toxina durante a captura com Amberlite CG-50 e diálise com PEG, já que a produção total de EEA pela cultura em saco de diálise e frascos sob agitação atingiu, respectivamente, 152 e 140 mg.

Uma justificativa para essa perda em nosso trabalho seria a saturação da resina, em vista da pequena quantidade de Amberlite empregada. Neste trabalho, empregou-se 150 ml de resina Amberlite CG-50, para 3.800 ml de sobrenadante de cultura numa etapa única, que provavelmente causou eliminação de toxina não ligada, após a etapa de decantação. Em comparação ao metodo de SCHANTZ et al [18], empregou-se uma concentração de resina inferior ao recomendado, ou seja, a quantidade de resina utilizada deveria ser duplicada. Além da perda de EEA devido a saturação, a fase obrigatória subsequente consiste na concentração do material eluído de Amberlite CG-50, utilizando PEG 15.000— 20.000. Trabalhos anteriores demonstraram que, o PEG adsorvido no tubo de diálise causaram hidrólise inespecífica [9].

3.2 - Cromatografia de afinidade com corante Red A

. O perfil cromatográfico de amostra aplicada na coluna apresentou 5 picos de eluição, completando-se a obtenção de material purificado dentro de 28 horas. Baseado no valor de absobância a 277 nm, selecionou-se 11 frações que apresentaram as maiores leituras e determinou-se os picos de eluição de EEA (Tabela 1).

As frações 20, 45 e 70, correspondentes ao pico 1, 2 e frações intermediárias apresentaram-se negativas ao ensaio de OSP [17]. As frações 100, 145 e 164, correspondentes ao pico 3, 4 e 5, assim como as frações intermediárias e posteriores ao pico 5 contiveram EEA, cuja detecção requereu diluição num fator de 1/50. As maiores concentrações atingidas ocorreram nos picos 4 e 5, correspondentes às frações 143 a 150 e 160 a 173 (Tabela 1). Considerou-se estes dois picos como a região contendo toxina pura, porém em formas isoelétricas diferentes que, quando combinadas, totalizaram o volume de 45,5 ml. Após concentração com PEG 15.000 a 20.000 e liofilização, o material apresentou 13,85 mg de EEA.

Para quantificação de EEA, recomenda-se a fórmula de SCHANTZ [18]. No método de LOWRY [12], a curva padrão confeccionada com albumina de soro bovino — BSA alterou o cálculo, já que BSA contém muitos aminoácidos aromáticos em relação à EEA. O método de LOWRY [12] é aplicável, desde que a curva padrão seja realizada com EEA.

Em relação às outras frações, onde ocorreram reações positivas pelo método de OSP, obteve-se leitura utilizando padrão contendo 4mg/ml. Estas frações foram combinadas e destinadas para o uso, como padrão de referência no método de OSP.

3.3 - Cromatografia por troca iônica e permeabilidade em gel

Na troca iônica, a eluição de EEA iniciou-se com aplicação de 100ml do tampão citrato, obtendo-se 3 picos distintos, correspondendo respectivamente às frações 1 a 3, 4 a 5 e frações 8 a 11. Os picos 2 e 3 mostraram-se positivos para EEA, sendo que a maior concentração situou-se no terceiro pico. As frações correspondentes aos picos 2 e 3 foram combinadas, concentradas para um volume final de 2,5ml e constitui-se num material contendo 5,2 mg/ml de proteína. O tempo total requerido para a finalização da etapa foi de 48 horas.

Este concentrado protéico, aplicado na coluna de permeabilidade em gel, permitiu a eluição de EEA em único pico, entre as frações 10 a 15. As frações foram combinadas e concentradas para um volume final de 10ml, que apresentou 3,5mg/ml de proteína pelo método de LOWRY [12] enquanto que pela fórmula preconizada por SCHANTZ et al [18], apresentou 0,975 mg de EEA (Tabela 2). O tempo requerido para a finalização da etapa foi de 18 horas.

3.4 - Cromatografia com Red A versus clássica

A purificação de EEA pela cromatografia de afinidade com Red A permitiu a conclusão do processo dentro de 76 horas, um valor bastante inferior a coluna clássica, que requereu 114 horas.

A análise eletroforética das amostras, obtidas destes processos cromatográficos, demonstraram grau de pureza diferenciado. O material resultante da coluna de Red A apresentou uma banda homogênea, indicando que atingiu pureza em torno de 90%. No entanto, o material obtido pela cromatografia clássica, não permitiu visualização desta nitidez e atingiu pureza em torno de 60%. O produto final da coluna clássica apresentou duas bandas, com peso molecular entre 24.000 a 29.000 Da.

A literatura relata a eluição de EEA em duas formas isoelétricas na coluna Red A [4, 16],como ocorreu em nosso trabalho, sem no entanto apresentar estas variações moleculares na análise eletroforética.

O perfil eletroforético da amostra pertencente à etapa de concentração, através de captura por Amberlite apresentou duas bandas nítidas, confirmando a eficácia da adsorção de EEA por Amberlite CG-50.

Os resultados confirmaram os dados obtidos por REYNOLDS et al [16] e BREHN & TRANTER [4], que reduziram o tempo de purificação e aumentaram a recuperação de EEA. A coluna de afinidade com Red A permitiu uma recuperação de EEA, na ordem de 60,87%, contra 6,5% da troca iônica e permeabilidade em gel (Tabela 2).

A economia de reagente e de tempo também foi obtida por Lopes et al [11], cuja recuperação de toxina purificada foi na ordem de 38%.

Outra vantagem constatada na utilização de Red A consiste na simplicação, para uma etapa cromatográfica [4], em relação a cromatografia clássica, que além de duas etapas, requer fase de pré-concentração [5].

4 — CONCLUSÕES

A captura de EEA por resina Amberlite CG-50 mostrou-se eficaz, eliminando a maioria dos componentes interferentes. Todavia, recomenda-se aumentar a quantidade do reagente, em vista da recuperação de apenas 30% de toxina.

O desempenho da cromatografia de afinidade com corante Red A na purificação de EEA é indiscutível, permitindo a obtenção de toxina com alto grau de pureza dentro de 76 horas.

Esta cromatografia permitiu a obtenção rápida e prática de EEA, com perspectivas de redução no custo de reagentes e, consequente disseminação da análise rápida de enterotoxinas em alimentos.

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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6 — AGRADECIMENTO

Ao Conselho Nacional de Pesquisa — CNPq, pelo apoio financeiro.

² UNICAMP, FEA-DCA, C.P. 6121 — CEP 13081-970.

³ UEL, CCA-TAM, C.P. 6001 — CEP 86051-970.

* A quem a correspondência deve ser enviada

¹

Recebido para publicação em 18/03/97. Aceito para publicação em 18/06/98.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Dez 1998
• Data do Fascículo
  Maio 1998

Histórico

• Recebido
  18 Mar 1997
• Aceito
  18 Jun 1998