OCORRÊNCIA DE Escherichia coli O157: H7 EM PRODUTOS CÁRNEOS E SENSIBILIDADE DOS MÉTODOS DE DETECÇÃO

OCCURRENCE OF Escherichia coli O157:H7 IN MEAT PRODUCTS AND SENSIBILITY OF THE DETECTION METHODS

OCORRÊNCIA DE Escherichia coli O157:H7 EM PRODUTOS CÁRNEOS E SENSIBILIDADE DOS MÉTODOS DE DETECÇÃO¹

Neusely da SILVA²,^*, Neliane Ferraz de Arruda SILVEIRA², Carmen CONTRERAS², Nelson José BERAQUET², Fumio YOKOYA³, Cleide Alves do NASCIMENTO², Valéria Marques OLIVEIRA², Chen Lee TSE²

RESUMO

Foi verificada a ocorrência de Escherichia coli O157:H7 em 340 amostras de produtos cárneos e ambiente industrial, provenientes de frigoríficos do Sul e Sudeste do Brasil, no período de abril/98 a abril/99. A presença de E.coli O157:H7 não foi detectada em nenhuma das amostras analisadas e os resultados da avaliação da sensibilidade dos métodos de detecção evidenciaram que tanto o método cultural quanto o imunoensaio da Neogem foram capazes de detectar a presença de E.coli O157:H7 em cultura pura em concentrações iniciais de menos de 0,5Log UFC/mL do caldo de enriquecimento.

Palavras-chave:Escherichia coli O157:H7; carne; produtos cárneos; métodos; imunoensaios enzimáticos; ELISA; Reveal E.coli O157.

SUMMARY

OCCURRENCE OF Escherichia coli O157:H7 IN MEAT PRODUCTS AND SENSIBILITY OF THE DETECTION METHODS. The occurrence of E.coli O157:H7 was evaluated in 340 samples of meat products and industrial environment of meat manufacturers from the South and Southeast regions of Brazil, from April, 1998 to April, 1999. Pathogen was not detected in any of the samples analysed, and the evaluation of the sensibility of the studied detection methods showed that both, culture and immuno-assay methods detected E.coli O157:H7 in pure culture in initial population levels of 0.5Log CFU/mL of enrichment broth.

Keywords: Escherichia coli O157:H7, meat, meat products, methods, enzimatic immunoassay, ELISA, Reveal E.coli O157.

1 ¾ INTRODUÇÃO

E.coli O157:H7 pertence a um grupo de cepas patogênicas de E.coli, conhecidas como entero-hemorrágicas (EHEC) ou produtoras de verotoxina (VTEC). Essas linhagens caracterizam-se pela produção de uma toxina chamada de verotoxina (VT) ou "shiga-like" toxina (ST), similar à produzida pela bactéria Shigella dysenteriae tipo I [16]. A VT provoca uma doença chamada colite hemorrágica que, em casos mais graves, resulta em um quadro conhecido como síndrome urêmica hemolítica (HUS) [10]. As cepas EHEC podem pertencer a diferentes grupos sorológicos somáticos, mas a maioria das linhagens associadas à HUS são do sorótipo O157:H7 [17]. Essas cepas diferem das demais cepas de E.coli em algumas características, sendo mais importantes a não fermentação do sorbitol, a não produção da enzima b-glicuronidase e o crescimento pobre ou nulo a 44°C [9, 10, 11, 12].

O trato-intestinal de ruminantes, particularmente bovinos e ovinos, parece ser o principal reservatório das cepas entero-hemorrágicas de E.coli O157:H7 e E.coli O157:NM. Já foram incriminados em surtos, dentre outros alimentos, leite cru, carne bovina mal cozida e outros produtos à base de carne (rosbifes, hambúrgueres e salsichas tipo "hot-dog"), frutas e vegetais (alface, melão, suco de maçã e diversos tipos de saladas) e maionese industrializada [3,6,15]. No geral, pode-se dizer que a carne bovina é uma das principais fontes potenciais de E.coli O157:H7, uma vez que o trato gastrointestinal de bovinos é o reservatório desses microrganismos [7].

E. coli O157:H7 é reconhecida como patógeno de origem alimentar desde 1982, respondendo por milhares de casos de diarréia e síndrome hurêmica hemolítica (HUS) nos Estados Unidos, Europa e Japão. No Brasil, SILVEIRA et al [14] analisaram, no período de janeiro a dezembro de 1997, 886 amostras de hambúrgueres provenientes de frigoríficos do Sul e Sudeste, não sendo detectada a presença desse patógeno em nenhuma das amostras. O presente estudo complementou esses resultados, verificando a ocorrência em outros produtos cárneos e no ambiente industrial. Também foi feita uma avaliação da sensibilidade dos métodos com cultura pura de E.coli O157:H7, injuriada e não injuriada, acompanhada ou não de uma cepa competidora de E.coli comum.

2 ¾ MATERIAL E MÉTODOS

2.1 ¾ Amostragem

As amostras de produtos cárneos diversos e ambiente industrial foram coletadas em frigoríficos localizados nas regiões Sul e Sudeste do Brasil, no período de abril/98 a abril/99.

2.2 ¾ Métodos de análise

Na determinação da ocorrência foi utilizado o método de imunoensaio enzimático da Neogem (Reveal E.coli O157 Test Kit ). Na avaliação da sensibilidade o imunoensaio enzimático foi comparado com o método cultural, ambos descritos abaixo.

2.2.1 ¾ Método cultural

25g da amostra foram homogeneizadas com 225mL de Caldo EC Modificado Novobiocina (mECn), incubadas por 6 horas em "shaker" com temperatura controlada a 37°C e, em seguida, incubadas em incubadora estática por mais 18 horas a 37°C. Uma alçada do caldo enriquecido foi estriada em placas de Ágar McConkey Sorbitol e, após incubação a 35°C/24h foram selecionadas colônias típicas para confirmação, que foi feita através do teste sorológico de aglutinação em lâmina com antisoro O157 (Probac do Brasil), atividade de b-glicuronidase em Caldo Lauril Sulfato Triptose suplementado com 4-metilumbeliferil-b-D-glicuronídeo (LST-MUG), teste de crescimento em Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI) e Lisina Ferro (LIA) e, a partir dos tubos de TSI, provas bioquímicas utilizando-se o kit da BioMerieux (API 20E).

2.2.2 ¾ ELISA Neogem (Reveal E.coli O157 Test Kit)

25g da amostra foram homogeneizadas com 225mL do Caldo Neogem para E.coli O157 (Reveal media 8 hours 9760), incubadas por 8 horas em "shaker" com temperatura controlada a 41°C. O imunoensaio foi realizado com uma alíquota do caldo enriquecido, submetida à fervura, conforme instruções do fabricante. Todas as amostras sinalizadas pelo imunoensaio foram submetidas à confirmação, estriando-se uma alçada do caldo de enriquecimento original (8h de enriquecimento), em placas de Ágar McConkey Sorbitol. Após incubação a 35^oC/24h foram selecionadas colônias típicas para confirmação, que foi feita seguindo o mesmo procedimento utilizado no método cultural, incluindo-se o teste sorológico de aglutinação em lâmina com antisoro O157 (Probac do Brasil).

2.3 ¾ Determinação do limite de sensibilidade dos métodos

Foram feitos vários tipos de avaliações para determinar o limite de sensibilidade do método da Neogem, sempre em paralelo com o método cultural: a) Avaliação com cultura pura não injuriada, feita utilizando-se uma cepa de E.coli O157:H7 inoculada nos caldos de enriquecimento antes do início da análise, em concentrações iniciais variando de 6,5 a menos de 0,5Log UFC/mL de caldo. A seqüência da análise seguiu as mesmas etapas descritas nos itens 2.2.1.e 2.2.2., dispensando-se a confirmação. b) Avaliação com cultura pura injuriada, feita utilizando-se o mesmo procedimento seguido para a cepa não injuriada, com inóculo inicial variando de 2,1 a menos de 0,1Log UFC/mL de caldo. c) Avaliação com cultura mista não injuriada, feita utilizando-se a cepa de E.coli O157:H7 inoculada em concentrações iniciais variando de 5,5 a 3,5Log UFC/mL de caldo, acompanhada de uma cepa de E.coli comum competidora (ATCC 25922), inoculada em concentrações iniciais variando de 1 a 100 vezes a da cepa de E.coli O157:H7. A sequência das análises seguiu as mesmas etapas descritas nos itens 2.2.1. e 2.2.2, dispensando-se as provas bioquímicas em API 20E. d) Avaliação com cultura mista injuriada, feita seguindo-se o mesmo procedimento utilizado na avaliação com cultura mista não injuriada, porém, em concentrações iniciais da cepa competidora de 50 a 5.000 vezes a da cepa de E.coli O157:H7.

Em todos os casos a simulação de injúria foi feita por choque térmico sub-letal aplicado em banho-maria a 60^oC/5min e a quantificação da população final de E.coli O157:H7 e E.coli comum após o período de enriquecimento foi feita em Petrifilm coliformes/E.coli (3M Company).

Para uma avaliação preliminar do limite de sensibilidade do ELISA propriamente dito, o imunoensaio foi realizado com a cepa pura de E.coli O157:H7 suspensa em Caldo Neogem, com concentrações variando de 9,0 a 3,0Log UFC/mL.

3 ¾ RESULTADOS

3.1 ¾ Ocorrência de E.coli O157:H7 em produtos cárneos e ambiente industrial

Os resultados encontram-se sumariados na Tabela 1. Foram analisadas 340 amostras, não sendo detectada a presença de E.coli O157:H7 em nenhuma das amostras analisadas. Esses resultados complementam os já previamente relatados para produtos cárneos no Brasil [14], atestando, senão a ausência, pelo menos uma baixa freqüência desse patógeno em nossa produção.

3.2 ¾ Determinação do limite de sensibilidade dos métodos de detecção utilizados

3.2.1. Na avaliação preliminar do limite de sensibilidade do ELISA propriamente dito, o imunoensaio da Neogem foi realizado com a cepa pura de E.coli O157:H7 suspensa em Caldo Neogem, sendo a captura das células feita a partir de uma pequena alíquota (5 gotas) do caldo de enriquecimento. Observou-se que, para emissão de um sinal claro, foi necessária uma contagem de E.coli O157:H7 na faixa de 10⁶-10⁸ UFC/mL, valor similar aos normalmente relatados para Salmonella, que também encontra-se na faixa de 10⁶-10⁸/mL [13].

3.2.2. Os resultados da avaliação da sensibilidade dos métodos com cultura pura, utilizando-se uma cepa de E.coli O157:H7 não injuriada, adicionada ao caldo de enriquecimento com contagens iniciais variando de 4,5 a menos de 0,5Log UFC/mL, encontram-se sumarizados na Tabela 2. No caldo EC Modificado Novobiocina (mECn) a contagem E.coli O157:H7 elevou-se em menos de dois ciclos logarítmicos após o período de enriquecimento, porém, mesmo assim, em todos os casos foi possível a recuperação de colônias típicas no Ágar MacConkey Sorbitol. No caldo Neogem a contagem elevou-se a valores acima de 8,0Log UFC/mL em todos os casos, podendo-se obter um sinal positivo no teste de ELISA e também a recuperação de colônias típicas na Ágar MacConkey Sorbitol. Comparado com o caldo mECn, os resultados evidenciaram que a velocidade de crescimento de E.coli O157:H7 foi muito maior no Caldo Neogem, permitindo levar a população aos níveis de detecção do ELISA mesmo a partir de contagens iniciais abaixo de 0,5Log UFC/mL.

3.2.3. Os resultados da avaliação da sensibilidade dos métodos com cultura pura, utilizando-se uma cepa de E.coli O157:H7 submetida a injúria sub-letal (choque térmico a 60^oC/5min), adicionada ao caldo de enriquecimento com contagens iniciais variando de 2,1 a menos de 0,1Log UFC/mL, encontram-se sumarizados na Tabela 3. No caldo EC Modificado Novobiocina (mECn) a contagem E.coli O157:H7 elevou-se em no máximo um ciclo logarítmico, porém, ainda assim, em todos os casos foi possível a recuperação de colônias típicas no Ágar MacConkey Sorbitol. No caldo Neogem a contagem elevou-se em mais de 5 ciclos logarítmicos, em todos os casos, porém, com inóculo inicial abaixo de 0,1Log UFC/mL, não foi possível a obtenção de um sinal positivo no teste de ELISA e a recuperação no Ágar MacConkey Sorbitol foi muito pobre, com desenvolvimento de um número reduzido de colônias típicas. Nesse caso é possível que o inóculo transferido na alçada tenha sido muito pequeno.

3.2.4. Na avaliação da sensibilidade dos métodos com cultura mista sem injúria (Tabela 4) foi utilizado inóculo inicial de E.coli O157:H7 variando na faixa de 3,5 a 1,5Log UFC/mL e proporção de 1:100, 1:10 e 1:1 entre as cepas de E.coli O157:H7 e E.coli comum. Em todas as situações testadas os dois métodos permitiram uma boa recuperação da cepa no Ágar MacConkey Sorbitol e o ELISA da Neogem foi capaz de sinalizar a presença de E.coli O157:H7 mesmo na presença de uma população competidora 100 vezes maior.

3.2.5. Nos testes com inoculação das duas culturas injuriadas (Tabela 5) foi mantida a faixa de inóculo inicial da E.coli O157:H7 mas a proporção entre as cepas passou para 1:5000, 1:500 e 1:50. Nesse caso, a população final de E.coli O157:H7 no Caldo Neogem manteve-se em faixas 10 a 1.000 vezes menores do que as obtidas com a cepa sem injúria e, no Caldo mECn, esse dado não pode ser bem avaliado porque as contagens finais ficaram abaixo das iniciais. A explicação provável para esse resultado é o fato de a elevação da população de E.coli O157:H7 no Caldo mECn não ser muito acentuada, dificultando a competição com a cepa de E.coli comum nas placas de Petrifilm. Ainda assim, os resultados mostraram que, em todas as combinações testadas, tanto o caldo Neogem quanto o caldo mECn permitiram a recuperação da E.coli O157:H7 no Ágar MacConkey Sorbitol, porém, o ELISA da Neogem não conseguiu sinalizar a presença da cepa nas combinações com proporção acima de 1:500. Cabe lembrar que, nos alimentos mais susceptíveis à contaminação por E.coli O157:H7, como hambúrgueres, lingüiças e outros produtos cárneos crus, a contagem de coliformes fecais temotolerantes (E.coli) permitida pela legislação brasileira é de 5,0x10³/g [1], de forma que, numa amostra no limite de tolerância, a presença de menos de 10UFC/g de E.coli O157:H7 poderia não ser detectada pelo ELISA da Neogem. Cabe ainda lembrar que a menor dose infectiva de E.coli O157:H7 conhecida encontra-se na ordem de 10 células/g [2, 4, 8], evidenciando o risco de não detecção do patógeno em produtos potencialmente capazes de provocar a doença.

4 ¾ CONCLUSÕES

• Não foi detectada a presença de E.coli O157:H7 nas amostras analisadas, corroborando os resultados anteriormente obtidos por SILVEIRA et al [14], com amostras de hambúrguer. Embora esse resultado não possa ser interpretado como garantia da ausência desse patógeno nos produtos cárneos brasileiros, atesta que a ocorrência no Brasil é, certamente, mais baixa do que nos Estados Unidos, Europa e outros Japão, onde amostragens similares têm detectado a presença em 0,2 a 3,7% do total de amostras analisadas nos diferentes estudos [5].

• O ELISA da Neogem exigiu contagens mínimas de 10⁶ a 10⁸ UFC de E.coli O157/mL para a emissão de um sinal positivo inequívoco, deixando claro que, assim como todos os ELISAs heterogêneos de captura desenvolvidos para Salmonella ou Listeria, até o momento, não tem sensibilidade para aplicação direta na amostra, sendo essencial a etapa de enriquecimento, para levar a contagem aos níveis de detecção.

• Tanto o método cultural quanto o imunoensaio da Neogem foram capazes de detectar a presença de E.coli O157:H7 em cultura pura, injuriada ou não, em concentrações iniciais de menos de 0,5Log UFC/mL do caldo de enriquecimento.

• Tanto o método cultural quanto o imunoensaio da Neogem foram capazes de detectar a presença de E.coli O157:H7 em cultura mista com E.coli comum competidora, injuriada ou não, em concentrações iniciais de 1,5Log UFC/mL do caldo de enriquecimento, até concentrações 500 vezes maior do competidor.

5 ¾ REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 ¾ AGRADECIMENTOS

Agradecemos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo financiamento do trabalho.

² Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL), Núcleo de Micro-biologia, Av. Brasil, 2880, CEP 13473-001 - Campinas (SP). E-mail: [e-mail]

³ Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)

* A quem a correspondência deve ser enviada.

• [1] ANVISA, 2001. Resolução RDC 12 de 02 de janeiro de 2001 - Regulamento Técnico Sobre Padrões Microbiológicos para Alimentos. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Ministério da Saúde, D.O.U. de 10/01/2001, Seção 1
• [2] ATTENBOROUGH, M. & MATTHEWS, K.R. Food safety through the meat supply chain. Journal of Applied Microbiology, v.88, p144S-148S, 2000.
• [3] BEUCHAT, L.R. Pathogenic microorganisms associated with fresh produce. Journal of Food Protection, v.59, n.2, p.204-216, 1996.
• [4] CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (CDC). Multistate outbreak of Escherichia coli O157:H7 infections from hamburgers-Western United States, 1992. Morbidity and Mortality Weekly Report, v.42, p.258-263, 1993.
• [5] DESMARCHELIER, P.M. & GRAU, F.H. (1997). Escherichia coli In: HOCKING, A.D., ARNOLD, G., JNSON, I. et al.eds. Foodborne Microrganisms of Public Health Significance. Sydney, Australia: Australian Institute of Food Science and Technology Inc., Chapter 7, p.231-264.
• [6] ERICKSON, J.P., STAMER, J.W., HAYES, M. et al An assessment of Escherichia coli O157:H7 contamination risks in commercial mayonnaise from pasteurized eggs and environmental sources, and behavior in low pH dressings. Journal of Food Protection, v.58, n.10, p.1059-1064, 1995.
• [7] KNIGHT, P. Hemorragic Escherichia coli: the danger increases. ASM News, v.59, n.5, p.247-250, 1993.
• [8] LIOR, H. Escherichia coli O157:H7 and verotoxigenic Escherichia coli (VTEC). Dairy, Food and Environmental Sanitation, v.14, n.7, p.378-382, 1994.
• [9] MARCH, S.B.; RATNAM, S. Sorbitol MacConkey Medium for detection of Escherichia coli O157:H7 associated with haemorragic colits. Journal of Clinical Microbiology, v.23, p.869-872, 1986.
• [10] MENG , J.; DOYLE, M.P.; ZHAO, T. et al. Detection and control of Escherichia coli O157:H7 in foods. Trends in Food Science & Technology, v.51, p.179-184, 1994.
• [11] OKREND, A.J.G, ROSE, B.E., MATNER, R. An improved screening method for the detection and isolation of Escherichia coli O157:H7 from meat, incorporating the 3M Petrifilm Test Kit HEC for hemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Journal of Food Protection, v.53, p.936-940, 1990.
• [12] SHUTERLAND, J.P.; BAYLISS, A.J.; BRAXTON, D.S. Predictive modelling of growth of Escherichia coli O157:H7:the effects of temperature, pH and sodium chloride. International Journal of Food Microbiology, v.25, p.29-49, 1995.
• [13] SILVA, N. Imunoensaios enzimáticos aplicados à detecção de Salmonella em alimentos. Coletânea do ITAL, v.21, n.2, p.173-185, 1991.
• [14] SILVEIRA N.F.A., SILVA N., CONTRERAS C., MIYAGUSKU L., BACCIN M.D.F., KOONO E., BERAQUET N.J. Occurrence of Escherichia coli O157 : H7 in hamburgers produced in Brazil. Journal of Food Protection, v.62, n.11, p.1333-1335, 1999.
• [15] TAUXE, R., KRUSE, H. HELDBERG, C. et al Microbial hazards and emerging issues associated with produce ž a preliminary report to the National Advisory Commitee on Microbiologic Criteria for Foods. Journal of Food Protection, v.60, n.11, p.1400-1408, 1997.
• [16] WEAGANT, S.D.; BRYANT, J.L.; JINNEMAN, K.G. An improved rapid technique for isolation of Escherichia coli O157:H7 from foods. Journal of Food Protection, v.58, n.1, p.7-12, 1995.
• [17] WILLSHAW,G.A., THIRLWELL, J., JONES, A.P., et al Vero citoxin-producing Escherichia coli O157:H7 in beefburgers linked to an outbreak of diarrhoea, haemorrhagic colits and haemolytic uraemic syndrome in Britain. Letters in Applied Microbiology, v.19, p.304-307, 1994.

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Recebido para publicação em 06/02/01. Aceito para publicação em 07/06/01.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Abr 2002
• Data do Fascículo
  Ago 2001

Histórico

• Recebido
  06 Fev 2001
• Aceito
  07 Jun 2001