Papel da luminosidade do biotério no comportamento do rato no labirinto em cruz elevado

Role of vivarium illumination in rat behavior in the elevated plus-maze

ARTIGOS

Papel da luminosidade do biotério no comportamento do rato no labirinto em cruz elevado

Role of vivarium illumination in rat behavior in the elevated plus-maze

Raquel Martinez; Andrea Milena Becerra Garcia; Silvio Morato

Universidade de São Paulo – Ribeirão Preto

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Há pouca informação sobre o efeito dos ambientes onde os ratos são mantidos antes de testes. Para investigar o efeito da iluminação do biotério, ratos Wistar machos foram submetidos a um período de 96 h de iluminação contínua, escuridão contínua ou um ciclo claro escuro de 12:12 h e testados no labirinto em cruz elevado em uma sala iluminada (150 lux) ou escura (0 lux). Os resultados mostram que nem a iluminação contínua nem a escuridão contínua do biotério afetam o comportamento dos ratos, quando comparados aos sujeitos mantidos no ciclo claro-escuro de 12 h. A condição de luminosidade durante o teste, no entanto, foi importante: independentemente da condição de iluminação do biotério, os animais testados no escuro exploraram mais os braços abertos do labirinto, um resultado já relatado na literatura e interpretado como diminuição da ansiedade nesse aparato.

Palavras-chave: labirinto em cruz elevado; comportamento exploratório de ratos; iluminação do biotério; luminosidade durante o teste

ABSTRACT

There is little information about the environments where rats are kept before being tested. In order to investigate the role of vivarium illumination, male Wistar rats were submitted to a 96-h period of continuous illumination, continuous dark or a 12:12 h light/dark cycle and tested in the elevated plus-maze in a lit (150 lux) or a dark room (0 lux). Results showed that neither vivarium illumination nor darkness for 96 h altered the rats' behavior in comparison to that of rats kept under the 12-h light/dark cycle. Luminosity during the test, however, was important: no matter what the vivarium illumination was, rats tested in the dark room explored more the open arms of the maze, an already reported result which is interpreted as decreased anxiety in this apparatus.

Keywords: elevated plus-maze; rat exploratory behavior; vivarium illumination; luminosity during the test

O labirinto em cruz elevado é uma modificação de um procedimento introduzido há quase cinco décadas por Montgomery (1955), inicialmente proposto por Handley e Mithani (1984) e que se utiliza para investigar aspectos da ansiedade (e.g., Cruz, Frei, & Graeff, 1994; Dorow, Horowski, Pashelke, Amin, & Braestrup, 1983; Moser, 1989; Pellow & File, 1986; Rodgers & Cole, 1994). O método é considerado um instrumento útil e válido para medir ansiedade, investigando aspectos comportamentais, fisiológicos e farmacológicos (Anseloni & Brandão, 1997; Cruz et al., 1994; Pellow, Chopin, File, & Briley, 1985; Rodgers & Cole, 1994). O teste consiste em colocar o animal em um labirinto elevado do solo formado por dois braços fechados por paredes e dois abertos, analisando-se a freqüência de entradas e o tempo gasto em cada tipo de braço, e outros comportamentos como deslocamento, levantar-se, esticar-se, etc. O rato explora os dois tipos de braço, mas entra mais e permanece mais tempo nos braços fechados. Considera-se a porcentagem da preferência (entradas e tempo gasto) pelos braços abertos e pelos fechados um índice fidedigno de ansiedade: quanto maiores os níveis de ansiedade, menor a porcentagem de entradas nos braços abertos e de tempo gasto nos mesmos (Handley & Mithani, 1984; Pellow & File, 1986).

Apesar da aparente simplicidade da situação de teste, muitos fatores influenciam a aversão aos braços abertos (para uma revisão, ver Hogg, 1996). Alguns deles são inerentes ao sujeito, como sexo (Imhof, Coelho, Schmitt, Morato, & Carobrez, 1993; Johnston & File, 1991) e idade (Imhof et al., 1993). Outros estão ligados ao procedimento experimental, como uma única ou múltiplas exposições ao labirinto (File, 1992; Griebel, Moreau, Jenck, Martin, & Misslin, 1993; Treit, Menard, & Royan, 1993) e a hora do dia em que o teste é feito (Gentsch, Lichtsteiner, Kraeuchi, & Feer, 1982; Griebel et al., 1993). Além disso, características da própria situação de teste também exercem influência, como por exemplo, os níveis de luminosidade da sala experimental: há um aumento da exploração dos braços abertos quando os animais são testados com baixos níveis de luminosidade ambiental (Cardenas, Lamprea, & Morato, 2001; Gentsch et al., 1982; Griebel et al., 1993; Morato & Castrechini, 1989). Além disso, Garcia, Cardenas & Morato (2005) mostraram que o aumento da exploração dos braços abertos, só acontece no teste com nível de iluminação menor que 1 lux. Acima de 3 lux e até 300 lux, essa exploração não é alterada, o que significa que existe um ponto entre 1 e 3 lux no qual acontece o aumento da exploração dos braços abertos do labirinto.

Adicionalmente, manipulações experimentais também alteram o comportamento dos animais no teste do labirinto, tais como o tipo de transporte à sala de teste (Morato & Brandão, 1996), o alojamento individual ou em grupo (Maisonnette, Morato, & Brandão, 1993), e o tempo de permanência no biotério antes do teste (Morato & Brandão, 1997). Apesar de ser um modelo muito utilizado nos testes animais de ansiedade, pouco se conhece sobre o(s) evento(s) responsáveis pela aversão e quais seriam as causas da esquiva dos braços abertos. Demonstrou-se que a aversão natural dos roedores aos espaços abertos pode estar ligada à tigmotaxia (Treit et al., 1993) e não ao medo de altura, como previamente suposto (Pellow & File, 1986). Cardenas et al. (2001) cortaram bilateralmente as vibrissas em diferentes tamanhos a partir do folículo, interferindo com a tigmotaxia normal. Os resultados mostraram que o sistema ligado às vibrissas não é a principal modalidade sensorial responsável pela exploração do labirinto em cruz elevado.

Ao contrário, Schiffman, Lore, Passafiume e Neeb (1970) sugeriram que, quando possível, os ratos utilizam a visão como principal sistema perceptivo para obter informações relevantes sobre o meio ambiente. King e Jones (2001) relataram ainda que, quando ratos eram testados no labirinto em uma condição escura, observava-se um aumento na atividade locomotora e uma diminuição da esquiva dos braços abertos. No entanto, Becker e Grecksch (1996) utilizaram três níveis de luminosidade na sala de teste do labirinto (30, 300 e 900 lux) e concluíram que o comportamento exploratório dos animais não se altera em função dos níveis de luminosidade. Contrariamente, nosso laboratório (Morato & Castrechini, 1989) testou animais com níveis baixos de luminosidade (20 lux) e encontrou um aumento da porcentagem de entradas e do tempo gasto nos braços abertos, quando comparados com os animais testados com altos níveis de luminosidade (1200 lux). Apoiando os nossos resultados, Griebel et al. (1993) relataram que altos níveis de luminosidade diminuem significativamente a atividade total, a porcentagem de entradas e a porcentagem de tempo gasto nos braços abertos, em comparação com os baixos níveis de luminosidade, e concluíram que a luminosidade altera o comportamento exploratório dos ratos no labirinto em cruz elevado.

Nasello, Machado, Bastos e Felicio (1998) estudaram os efeitos da escuridão súbita sobre o comportamento exploratório no labirinto e demonstraram que os animais exibiam um aumento na freqüência e porcentagem de entradas e tempo gasto nos braços abertos, assim como no total de entradas. Esse mesmo aumento na atividade locomotora foi observado quando se testavam os animais no campo aberto na ausência de luminosidade ou em situação de escuridão repentina (Nasello et al., 1998; Valle, 1970).

Martinez, Cardenas, Lamprea e Morato (2002) investigaram o papel da presença de bordas transparentes circundando os braços abertos com diferentes alturas: 1, 5, 10, 20 e 40 cm. Adicionalmente, a parede transparente de 40 cm foi também recoberta com papel branco translúcido ou preto opaco. Os animais evitaram os braços abertos circundados por paredes transparentes de 1 e 40 cm (as últimas permitiam tigmotaxia, tinham a mesma altura das paredes de madeira dos braços fechados e permitiam a visão desimpedida). Além disso, quando as paredes transparentes de 40 cm foram cobertas com os papéis branco ou preto houve um aumento no comportamento exploratório nesses braços, sendo que foi maior com o papel preto e menor com o branco, indicando que a visão pode ser a responsável pela aversão e pela diminuição da exploração aos mesmos.

Com base nas sugestões de que a visão é uma importante modalidade sensorial no comportamento exploratório e no desencadear da ansiedade, o objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos de diferentes condições de iluminação ambiental tanto durante o período de manutenção que antecede o teste no labirinto em cruz elevado como durante o teste.

Material e Métodos

Sujeitos

Utilizaram-se 72 ratos machos de uma derivação Wistar, pesando 200 ± 10 g, provenientes do biotério central da Universidade de São Paulo, em Ribeirão Preto. Todos os sujeitos foram submetidos a um período de habituação de 3 dias antes de iniciar o experimento. Os sujeitos foram alojados em grupos de seis por caixa de polipropileno (40 x 34 x 17 cm). Após o período de habituação, os ratos foram aleatoriamente distribuídos em três grupos conforme a condição de iluminação ambiental. Um grupo (Luz, L) foi submetido a 96 horas de iluminação constante, outro (Escuro, E) a 96 horas de escuridão constante, e um terceiro (Controle, C) foi mantido em ciclo claro-escuro de 12:12 h (luzes acesas às 7:00 h). Um dispositivo termostático manteve a temperatura do biotério entre 24 e 27º C. Todos os sujeitos tiveram livre acesso à água e comida. O teste comportamental realizou-se entre 8:00 e 11:30 h. Os procedimentos relatados neste artigo estão de acordo com as recomendações feitas pela Sociedade Brasileira de Neurociências e Comportamento (Brazilian Society of Neuroscience and Behavior), baseadas no US National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals.

Equipamento

Utilizou-se um labirinto em cruz elevado, descrito detalhadamente alhures (Lamprea, Cardenas, Silveira, Morato, & Walsh, 2000). O aparato consiste de duas superfícies horizontais de madeira com piso de fórmica, medindo 50x10 cm, justapostas pelas pontas, com bordas de acrílico de 1cm de altura (braços abertos), cruzados em angulo reto com duas superfícies de igual tamanho, circundadas por paredes de 40 cm de altura (braços fechados) exceto na parte central onde os braços se cruzam. Todo o aparato eleva-se a 50 cm do piso. A lâmpada se encontrava 1,5 m acima do aparato. Circundando os braços abertos havia uma borda de acrílico de 1 cm de altura com a finalidade de evitar que os ratos caíssem. As sessões experimentais foram gravadas por uma câmera de vídeo com luz infravermelha que permitia gravar no escuro e que se encontrava na sala adjacente ligada a um monitor e a um aparelho de vídeo cassete. Para o registro do deslocamento e outros comportamentos do animal, sobre a tela da televisão, colocou-se uma transparência na qual se podia dividir a imagem do piso do labirinto em quadrados de 10 cm. Posteriormente, registrou-se o número de quadrados atravessados pelo animal e o local exato onde ocorreram os comportamentos gravados.

Procedimento

Após 96 h em uma das três condições de manutenção, todos os sujeitos foram testados no labirinto em cruz elevado. Dividiu-se cada grupo em dois sub-grupos, um testado na condição de luz (150 lux no quadrado central do labirinto) e o outro em total escuridão (0 lux). Desse procedimento resultaram seis grupos: C150, C0, L150, L0, E150 e E0. A primeira letra indica a condição de luminosidade no biotério, descrita na seção Sujeitos e o número representa o nível de luminosidade na sala de teste. Para o teste comportamental, colocou-se gentilmente cada animal na área central do labirinto com o focinho voltado para um dos braços fechados e se permitiu a livre exploração por 5 minutos. Depois de testar cada animal o aparato era limpo com uma solução de etanol de 20%. Registraram-se as medidas convencionais (número de entradas e tempo gasto nos braços), assim como a freqüência e o tempo gasto nas categorias comportamentais descritas a seguir. (a) Mergulhar a cabeça: dirigir a cabeça abaixo do nível do piso do labirinto. (b) Esticar-se: mover lentamente as patas dianteiras mantendo imóveis a traseiras, causando um alongamento do corpo, e voltando as dianteiras à sua posição inicial. (c) Levantar-se: erguer-se total ou parcialmente apoiando-se nas patas traseiras, com as dianteiras tocando ou não as paredes. (d) Limpar-se: seqüência de comportamentos de auto-limpeza específicos da espécie, incluindo passar a língua ou as patas em partes do corpo (Cruz et al., 1994). Registraram-se também o número de entradas e o tempo gasto nas extremidades (20 cm distais) dos braços abertos e fechados bem como a distância percorrida nos braços (estimada a partir do número de quadrados atravessados).

Análises estatísticas

Os dados foram submetidos a uma análise de variância de duas vias (ANOVA), tendo como um dos fatores o nível de iluminação do biotério (três níveis: C, L, E) e como o outro fator a condição de luminosidade da sala de teste (dois níveis: 0 e 150 lux). Sempre que apropriado, utilizou-se o teste de comparações múltiplas entre médias de grupos de Newman-Keuls. Para todos os testes, utilizou-se p < 0,05 como nível de significância.

Resultados

A Figura 1 apresenta a porcentagem de entradas e tempo nos braços abertos, assim como a freqüência e o tempo gasto nas extremidades dos mesmos. Com relação à porcentagem de entradas nos braços abertos, a ANOVA mostrou um efeito geral devido ao fator luminosidade durante o teste (F(2,66) = 67,33; p < 0,001), mas não ao fator iluminação do biotério (F(1,660) = 1,40; p = 0,26); tampouco houve interação entre os fatores (F(2,66) = 1,65; p = 0,20). O teste de comparações múltiplas mostrou um aumento na porcentagem de entradas dos animais testados na sala escura (C0, L0 e E0) em comparação com os animais testados na condição de luz (C150, L150 e E150). Quanto ao tempo gasto nos braços abertos, a ANOVA não mostrou efeitos gerais devidos à iluminação do biotério (F(2,66) = 2,33; p = 0,11), mas devidos à luminosidade durante o teste (F(1,660) = 83,67; p < 0,001). Não ocorreu interação entre os fatores (F(2,66) = 0,86; p = 0,43). O teste Newman-Keuls mostrou que todos os animais testados no escuro (C0, L0 e E0) gastaram mais tempo nos braços abertos em comparação com os testados no claro (C150, L150 e E150).

Com relação ao número de entradas nas extremidades dos braços abertos, a ANOVA revelou efeitos gerais devidos ao fator iluminação do biotério (F(2,66) = 19,92; p < 0,001), e à luminosidade durante o teste (F(1,660) = 10,67; p = 0,001), além uma interação entre os fatores (F(2,66) = 4,57; p = 0,01). O teste post hoc mostrou que os animais dos grupos testados na sala escura (C0, L0, E0) entraram significativamente mais nas extremidades do que os testados no claro (C150, L150, E150). Finalmente no tempo gasto nas extremidades abertas, a ANOVA acusou efeitos gerais devidos ao fator iluminação do biotério (F(2,66) = 23,81; p < 0,001) e ao fator luminosidade durante o teste (F(1,66) = 7,53; p = 0,01); não houve interação entre os fatores (F(2,66) = 2,13; p = 0,13). O teste de Newman-Keuls mostrou um aumento no tempo gasto nas extremidades dos braços abertos pelos animais dos grupos testados no escuro (C0, L0, E0) em comparação com os animais testados no claro (C150, L150, E150).

A Figura 2 apresenta o número de entradas nos braços fechados. A ANOVA revelou um efeito geral devido ao fator iluminação do biotério (F(2,66) = 7,27; p = 0,01), mas não à luminosidade durante o teste (F(1,660) = 1,94; p = 0,17); não houve interação entre os fatores (F(2,66) = 0,61; p = 0,54). O teste post hoc revelou que o grupo L150 entrou mais vezes nos braços fechados do que o grupo controle (C150). A Figura 2 também apresenta a distância percorrida pelos animais nos braços fechados. A ANOVA mostrou um efeito geral devido ao fator iluminação do biotério (F(2,66) = 3,92; p = 0,02), mas não à luminosidade durante o teste (F(1,66) = 0,67; p = 0,42); não houve interação entre os fatores (F(2,66) = 0,29; p = 0,75). Apesar da indicação de efeitos da iluminação do biotério pela ANOVA, o teste post hoc não acusou quaisquer diferenças entre os grupos. No teste ANOVA foram comparados os diferentes níveis de uma mesma variável (ex. claro vs escuro), enquanto que no teste post hoc as comparações são feitas entre pares de grupos, razão pela qual possivelmente não foram encontradas as diferenças.

A Tabela 1 mostra as médias (± EPM) dos comportamentos exibidos pelos animais no labirinto em cruz elevado e a Tabela 2 apresenta os resultados das análises estatísticas aplicadas a esses parâmetros. A ANOVA mostrou efeitos gerais devidos ao fator iluminação do biotério na freqüência de levantar-se, (o grupo E0 aumentou a freqüência de levantar quando comparado com o grupo C0), na freqüência de limpar-se (o grupo E150 diminuiu comparado com o C150) e no tempo gasto limpando-se (o grupo L150 diminuiu comparado ao C150). A ANOVA também mostrou efeitos gerais devidos à luminosidade durante o teste, os grupos testados em 0 lux exibiram um aumento nos parâmetros de entradas nos braços abertos, freqüência e o tempo esticando-se e mergulhando a cabeça, bem como na freqüência de levantar-se quando comparados com os testados em 150 lux.

Discussão

Independentemente da condição de iluminação do biotério, observa-se um aumento na porcentagem de entradas e no tempo gasto nos braços abertos quando os animais são testados no escuro, em comparação com os animais testados no claro. O mesmo tipo de efeito foi observado quanto à exploração das extremidades abertas. Isso mostra que os efeitos observados deveram-se ao nível de luminosidade durante o teste, apoiando a hipótese amplamente relatada na literatura de que o nível de iluminação da área experimental é um determinante crítico do comportamento no labirinto em cruz elevado (Griebel et al., 1993). A literatura relata um aumento da esquiva aos braços abertos quando a sala do teste é muito iluminada (Griebel et al., 1993; Jerome, Moody, Connor, & Fernandez, 1957; Morato & Castrechini, 1989). Essa esquiva é confirmada no nosso trabalho e evidencia-se pela diminuição na porcentagem de entradas e tempo gasto nos braços abertos e em suas extremidades (Pellow et al., 1985; Setem, Pinheiro, Motta, Morato, & Cruz, 1999). Na literatura, essas medidas são inversamente associadas aos níveis de ansiedade (Cruz et al., 1994; Setem et al., 1999), sugerindo que a diminuição no nível de luminosidade da sala de teste exerce um efeito ansiolítico sobre o comportamento exibido no labirinto em cruz elevado.

A redução no comportamento de esticar-se aqui descrita já foi relatada na literatura após a injeção de drogas ansiolíticas (Cole & Rodgers, 1993) bem como seu aumento devido à injeção de drogas ansiogênicas (Anseloni & Brandão, 1997), sugerindo que o escuro durante o teste é o principal causador do efeito ansiolítico. Na mesma linha de raciocínio, a ausência de luz também fez aumentar a freqüência e duração do comportamento de mergulhar a cabeça, inversamente associado à ansiedade (Anseloni & Brandão, 1997; Cole & Rodgers, 1993). A ausência de luz durante o teste alterou apenas os comportamentos ligados à ansiedade, evidenciado pelo fato de que as medidas de atividade geral não se modificaram. Apenas um grupo apresentou aumento na freqüência de entradas nos braços fechados mas não na distância percorrida nem no comportamento de levantar-se, sugerindo talvez que esse aumento seja um efeito isolado.

Com relação à influência do ciclo claro/escuro sobre o comportamento no labirinto em cruz elevado, Bertoglio e Carobrez (2002) testaram animais nas fases diurna e noturna do ciclo, e observaram uma redução na porcentagem de entradas e no tempo gasto nos braços abertos, quando os animais foram testados na fase noturna. Por outro lado, quando o teste acontece em condições de baixa luminosidade essas medidas aumentam independentemente da fase do ciclo.

Nossos resultados mostraram que forçar os animais a permanecerem por 96 h em escuridão ou iluminação constantes não altera as medidas convencionais de ansiedade nem as de atividade exploratória no labirinto em cruz elevado. No entanto, o nível de luminosidade durante o teste foi crucial para definir o comportamento exploratório dos ratos. Isso sugere que, durante a exploração de um ambiente novo a visão pode ser a principal modalidade sensorial utilizada pelos ratos, conforme já sugerido por Schiffman et al. (1970) de modo geral e por nosso laboratório (Martinez et al., 2002), no caso mais específico do labirinto em cruz elevado.

Pode-se concluir, portanto, que a luminosidade durante o teste foi a responsável pelas diferenças observadas no comportamento exibido no labirinto em cruz elevado, e que a condição iluminação do biotério não alterou o padrão comportamental dos animais. Uma possível explicação é que a visão pode ser usada como principal sistema perceptivo para a obtenção de informação relevante e para causar a aversão natural aos espaços abertos somente na situação de teste, a qual pode ser reduzida quando os animais são testados no escuro. A principal contribuição do presente trabalho, é a demonstração de que a permanência forçada numa determinada condição de iluminação no biotério estaria, assim, desvinculada da situação de teste.

Recebido em 30.abr.04

Revisado 04.jul.05

Aceito em 01.ago.05

Raquel Chacon Ruiz Martinez é mestre e doutoranda em Psicobiologia pela Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. E-mail: [e-mail]

Andrea Milena Becerra Garcia é mestre e doutoranda em Psicobiologia pela Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. E-mail: [e-mail]

Silvio Morato, doutor em Farmacologia pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP, é professor associado no Departamento de Psicologia e Educação, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Set 2006
• Data do Fascículo
  Ago 2005

Histórico

• Recebido
  30 Abr 2004
• Revisado
  04 Jul 2005
• Aceito
  01 Ago 2005