Caracterização biológica e fisiológica de isolados de Sclerotium rolfsii obtidos de pimentão no Estado do Maranhão

Biological and physiological characterization of Sclerotium rolfsii isolates, obtained from green pepper in the State of Maranhão

ARTIGOS ARTICLES

Caracterização biológica e fisiológica de isolados de Sclerotium rolfsii obtidos de pimentão no Estado do Maranhão^*

Biological and physiological characterization of Sclerotium rolfsii isolates, obtained from green pepper in the State of Maranhão

Ilka Márcia R. de S. SerraI, ^**; Gilson S. da Silva^II

^IDepartamento de Agronomia e Fitossanidade, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Dois Irmãos, CEP 52171-900, Recife, PE, e-mail: [e-mail]

^IIDepartamento de Fitotecnia e Fitossanidade, Universidade Estadual do Maranhão, CEP 65001-970, São Luís, MA

RESUMO

A murcha de esclerócio do pimentão (Capsicum annum), causada por Sclerotium rolfsii é uma das mais importantes doenças dessa solanácea, nas regiões tropicais. Um dos requisitos básicos para obtenção de sucesso no controle dessa doença é o conhecimento do patógeno, especialmente de fatores relacionados à fisiologia e biologia. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar cinco isolados de S. rolfsii, obtidos de pimentão, quanto ao crescimento micelial, produção de escleródios em diferentes regimes de luminosidade e em seis substratos naturais e a compatibilidade vegetativa entre os isolados. O efeito do substrato variou com o isolado na produção de escleródios. Os isolados SR3 e SR5 apresentaram maior produção de escleródios nos substratos aveia-ágar (AA) e fubá-ágar (FA), SR1 em casca de arroz (CA), SR2 em AA e SR4 em FA. O substrato CA favoreceu a formação de escleródios na maioria dos isolados. Quanto à taxa de crescimento micelial os isolados apresentaram pouca variação, sendo SR1, SR2 e SR3 os que apresentaram maior crescimento. Os cincos isolados exibiram comportamento diferente quando submetidos a três regimes de luz (luz contínua, alternância luminosa e escuro contínuo), tendo o primeiro favorecido maior produção de escleródios em relação aos outros. O teste de compatibilidade vegetativa mostrou diversidade genética entre os cincos isolados, possibilitando a classificação em três grupos. Os isolados SR3 e SR5 foram incompatíveis com os demais e entre si. Houve compatibilidade vegetativa entre os isolados SR1, SR2 e SR4. De acordo com os aspectos culturais e fisiológicos estudados, os isolados de S. rolfsii SR3 e SR5 podem ser considerados "strains" diferentes, enquanto SR1, SR2 e SR4 podem ser considerados da mesma "strain".

Palavras-chave adicionais:Capsicum annum, Sclerotium sp., compatibilidade vegetativa, produção de escleródios.

ABSTRACT

Green pepper (Capsicum annum) sclerotium wilt, caused by Sclerotium rolfsii, is one of the most important diseases of this solanaceous in tropical regions. One of the basic requirements for successful in controll of this disease is knowledge of the pathogen, especially of factors related to physiology and biology. The present work aimed to characterize five isolates of S. rolfsii (SR1, SR2, SR3, SR4 e SR5), from green pepper, accessing the mycelial growth, sclerotia production in different photophases and in six natural substracts and the vegetative compatibility among these isolates. The substract effect varied within isolates for sclerotia production. The SR3 and SR5 presented the highest sclerotium production in oat (Avena sativa)-agar (OA) and flour-agar (CA), SR1 in rice (Oryza sativa) hull (RH), SR2 in OA and SR4 in CA. The RH favored sclerotia formation in most isolates. For the mycelial growth rate, the isolates tested showed low variation, but SR1, SR2 and SR3 presented higher growth. The five isolates showed differential behavior when submitted to three different photophases: continuous light (CL), alternating light and dark (L/D) and continuous dark (CD), the highest sclerotia production was found under CL. The vegetative compatibility test showed genetic diversity among the five isolates, clustering them into three groups. The SR3 and SR5 were incompatible one to other and with all other isolates. There was vegetative compatibility among isolates SR1, SR2 and SR4. According to the biological and physiological aspects studied the isolates of S. rolfsii SR3 and SR5 can be considered different "strains", while SR1, SR2 and SR4 belong to the same strain.

Additional keywords: Capsicum annum, Sclerotium sp., sclerotia production, vegetative compatibiliy.

INTRODUÇÃO

O pimentão (capsicum annum L.) é uma hortaliça tipicamente de clima tropical. No Brasil é cultivado em todo território nacional, sendo uma das dez hortaliças de maior importância econômica no mercado hortigranjeiro brasileiro, podendo ser consumida sob a forma de frutos verdes, maduros e mesmo industrializados, em forma de pó. No Nordeste, destacam-se como principais produtores os Estados de Pernambuco, Paraíba, Ceará e Bahia em ordem decrescente (Ceasa-PE, 1992).

Dentre as doenças que afetam o pimentão, a murcha de esclerócio, causada por Sclerotium rolfsii Sacc. é uma das mais relevantes. O fungo é um importante fitopatógeno habitante de solo, sendo responsável por podridão de raízes e do colo, murcha e tombamento de plântulas. Apresenta extensa gama de hospedeiros, cerca de 500 espécies botânicas, incluindo dicotiledôneas e monocotiledôneas, distribuindo-se em todas as regiões agrícolas, com predominância nas zonas tropical e subtropical, onde predominam condições de alta umidade e temperatura elevada (Aycock, 1966; Punja & Jenkins, 1984; Punja, 1985; Punja & Rahe, 1992).

Desde o primeiro trabalho de Rolfs em 1892, com S. rolfsii na cultura do tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.), muitos trabalhos foram desenvolvidos sobre o fungo e, apesar disso, esse patógeno continua a causar problemas em diferentes culturas, trazendo prejuízos para a produção (Epps et al., 1951). No Estado do Maranhão, essa doença tem ampla distribuição geográfica e causa perdas elevadas, chegando a 100% em algumas áreas onde se cultiva o pimentão.

Sabe-se que isolados de S. rolfsii originados de diferentes áreas geográficas e hospedeiros apresentam variação nas características morfológicas e fisiológicas (Punja & Grogan, 1983). Diferenças entre espécies são facilmente identificadas pelo tamanho, cor e forma de escleródios (Punja & Rahe, 1992). Entretanto, segundo Harlton et al. (1995), não está devidamente esclarecido que quaisquer dessas diferenças sejam suficientes para garantir a separação de isolados dentro da espécie S. rolfsii. Uma das técnicas que pode ser empregada nesse estudo é a da compatibilidade vegetativa entre isolados, que tem sido usada para avaliar a variabilidade genética em diversos fungos patogênicos à plantas (Leslie, 1993; Dantas, 1999). Nakata (1925) separou isolados de S. rolfsii com base na formação de zona de aversão, ou ausência desta, quando os isolados foram pareados em meios de cultura, sendo os mesmos reunidos em grupos de compatibilidade vegetativa (GCV). Desde então a GCV vem sendo usada na caracterização de isolados de S. rolfsii.

Considerando os fatores físicos que exercem efeito no crescimento e formação esclerodial, destaca-se a luz. Segundo Punja (1985), há melhor desenvolvimento de S. rolfsii, em condições de luminosidade continua, sugerindo que a produção abundante de escleródios na superfície do solo seja em resposta à presença de luz. Essa observação foi também relatada por outros pesquisadores, como McClellan et al., (1955) que verificaram maior produção de escleródios em culturas expostas a luz.

Diversos meios são utilizados para produção de escleródios de S. rolfsii, segundo Pérez Sendín et al. (1986) o fungo apresenta bom crescimento micelial e formação de escleródios em meios de farinha de milho e extrato de malte. Punja (1985) observou que S. rolfsii possui grande adaptabilidade a diferentes fontes de carbono e também utiliza numerosos compostos orgânicos e inorgânicos como fontes de nitrogênio. Segundo observações de Henis et al. (1965) e Zoberi (1980), a glucose é uma importante fonte de carbono para o crescimento micelial e a produção de escleródios.

O controle dessa doença é difícil, em razão da enorme gama de hospedeiros apresentada pelo fungo, bem como pela longa sobrevivência do patógeno no solo. Na definição de estratégias de controle, é fundamental conhecer aspectos da biologia e fisiologia do patógeno, destacando-se o desenvolvimento de meios de cultura onde o patógeno-alvo se reproduza abundantemente. A busca de meios de culturas de baixo custo e eficientes para induzir a produção de escleródios é de grande importância para estudos do patógeno.

O presente trabalho teve como objetivos caracterizar isolados de S. rolfsii patogênicos ao pimentão, avaliando o seu crescimento micelial, e a compatibilidade vegetativa entre diferentes isolados; o efeito de diferentes substratos e a influência da luminosidade na produção de escleródios.

MATERIAL E MÉTODOS

Utilizaram-se cinco isolados do fungo, obtidos de pimentão, cultivados em diferentes localidades no Maranhão. Os isolados SR1 e SR5 foram oriundos de Paço do Lumiar, SR3 de Buriti, e os isolados SR2 e SR4 procedentes de São Luís. O fungo foi isolado em meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA) e, posteriormente, incubado em estufa do tipo Biochemistry Oxygen Demand (B.O.D.) à temperatura de 25 °C, com fotoperíodo de 12 h.

Para o estudo das características fisiológicas, discos de micélio e meio de cultura (5,0 mm de diâmetro), oriundos de colônia jovem de cada isolado, foram transferidos para o centro de placa de Petri, contendo meio BDA, as quais foram incubadas a 25 °C, com 12 h de fotoperíodo. Foi observado o crescimento do micélio, medindo-se o diâmetro da colônia em intervalos de 24 h, com auxílio de uma régua milimetrada, tomando-se duas medições, em sentidos diametralmente opostos. Em seguida, foi estabelecida a média de crescimento linear para cada placa. As leituras foram iniciadas 24 h após a instalação do experimento, até a colonização de toda a superfície do meio de cultura, que correspondeu a três dias de incubação. O cálculo da velocidade de crescimento foi realizado de acordo com Lilly & Barnett (1951).

O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com quatro repetições, sendo cada repetição constituída por uma placa de Petri. As médias dos dados obtidos foram comparadas utilizando-se o teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

Compatibilidade vegetativa entre os isolados de S. rolfsii

A compatibilidade vegetativa entre os isolados foi avaliada em placas de Petri de 9 cm de diâmetro. Um escleródio de cada isolado foi transferido para placas contendo BDA e pareados em posições opostas e eqüidistantes um do outro. A incubação foi feita à temperatura de 25 ± 1 °C, em regime de luz alternada com fotoperíodo de 12 h. Foram utilizadas quatro repetições. Após a incubação durante três dias, as placas foram avaliadas macroscopicamente observando-se a presença ou não de antagonismo (zona de aversão) na região de contato micelial.

Efeito da luminosidade na capacidade de produção de escleródios dos isolados de S. rolfsii

O meio BDA foi usado para realização desse experimento, por induzir bom crescimento micelial, abundante formação de escleródios, facilitando a contagem dos mesmos, devido à transparência do meio.

Discos de cultura jovem de S. rolfsii, com 5 mm de diâmetro, foram repicados para o centro de placas de Petri contendo BDA, e incubadas sob três regimes de luminosidade: luz contínua, escuro contínuo e alternância luminosa (12 h de luz e 12 h escuro), à temperatura de 25 ± 1 °C. Vinte dias após, as culturas foram avaliadas quanto à produção de escleródios. Procedeu-se a remoção dos escleródios com auxílio de uma pinça e a contagem de todos os escleródios produzidos para cada isolado e tratamento. O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente casualizado, constando de 15 tratamentos, representados pelos três regimes de luz e os cincos isolados, com quatro repetições.

Produção de escleródios em seis diferentes substratos

Para avaliar a produção de escleródios os substratos utilizados foram: a) grãos de arroz (Oryza sativa L.) beneficiados (AB); b) sementes de sorgo [Sorghum bicolor (L.) Moench] (SS); c) casca de arroz (CA); d) quirera de milho (Zea mays L.)-ágar (QA); e) fubá-ágar (FA); f) aveia (Avena sativa L.)-ágar (AA).

Para os tratamentos AB e SS foram utilizados 20 g de cada substrato, e para a CA foram usados 5 g. Os substratos foram embebidos em água destilada por 10 min e autoclavados por 30 min, em dois dias consecutivos. Os meios de QA, FA, AA foram preparados usando a metodologia de Menezes & Silva-Hanlin (1997), onde se utilizou 75,0 g de cada substrato; 17,0 g de ágar e água destilada em quantidade suficiente para 1.000 ml.

Em cada substrato, foram depositados discos de micélio e meio de cultura (5,0 mm de diâmetro), oriundos de colônias jovens de cada isolado de S. rolfsii, desenvolvidos em BDA. Após a inoculação, os substratos foram incubados durante 25 dias em câmara do tipo B.O.D. a 25 ± 2 °C, com fotoperíodo de12 h. Ao término da incubação procedeu-se a remoção dos escleródios conforme citado no experimento anterior.

Foi utilizado um delineamento experimental inteiramente casualizado, em esquema fatorial 5 X 6, constando de 30 tratamentos, representados pelos cincos isolados de S. rolfsii e os seis diferentes substratos, com quatro repetições. As médias dos dados obtidos foram comparadas utilizando-se o teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade, sendo os dados transformados em Öx + 0,5.

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o SANEST (Sistema para análise estatística).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados obtidos para taxa de crescimento micelial dos cinco isolados de S. rolfsii são apresentados na Tabela 1. Embora tenha ocorrido pouca variação entre os isolados, foi possível separá-los em dois grupos distintos. O isolado SR5 foi o que apresentou menor velocidade de crescimento, diferindo (P<0,05) dos demais, exceto de SR4.

As diferenças nas taxas de crescimento micelial verificadas podem ser atribuídas à variabilidade genética entre os isolados, fato que pode ser observado nos outros aspectos estudados no presente trabalho.

Os resultados observados nesse experimento diferem daqueles obtidos por Lang (1989), que encontrou para S. rolfsii, em meio BDA, uma taxa de crescimento micelial entre 150 a 300 mm/h, a 25 °C e por Punja (1985), o qual verificou taxas médias de 850 a 970 mm/h, a 27 °C. Estes dados, visivelmente superiores aos encontrados neste trabalho, podem ser indicativo da variabilidade entre os isolados S. rolfsii usados nestes e nos outros trabalhos mencionados.

Compatibilidade vegetativa entre os isolados de S. rolfsii

Os resultados referentes à compatibilidade vegetativa mostraram que as hifas dos isolados SR1 (proveniente de Paço do Lumiar) e os isolados SR2 e SR4 (provenientes de São Luis) formaram anastomose, ou seja, houve superposição de uma colônia sobre a outra, conforme mostra a Figura 1A. Isto indica que esses isolados podem ser agrupados em um mesmo GCV (grupo compatível vegetativamente). Alguns autores consideram que, nesse caso, há similaridade genética entre os isolados e uma provável origem geográfica comum, tendo também, semelhantes atributos biológicos, fisiológicos e patogênicos (Punja & Grogan, 1983; Katan et al., 1991; Harlton et al. 1995). Não foi observada anastomose de hifas nos isolados SR3 (proveniente de Buriti) e SR5 (proveniente de Paço do Lumiar), quando pareados com os outros isolados, ocorrendo uma zona de aversão entre os mesmos, indicando incompatibilidade (Figura 1B) e, provavelmente dissimilaridade genética. No pareamento dos isolados SR3 e SR5, foi observada a ocorrência de zona de aversão, sugerindo que os mesmos não apresentam compatibilidade vegetativa, logo pertencem a GCV diferentes.

Efeito da luminosidade na capacidade de produção de escleródios dos isolados de S. rolfsii

Os resultados obtidos para influência da luminosidade na produção de escleródios dos cinco isolados de S. rolfsii (Tabela 2) mostraram interação entre os isolados e regime de luminosidade. Os isolados SR3 e SR5 produziram maior (P<0,05) número de escleródios sob luz contínua e menor sob escuro contínuo. Resultados semelhantes foram obtidos por Pérez Sendín et al. (1986) e McClellan et al. (1955) os quais conseguiram maior número de escleródios do fungo em condições de claro contínuo e menor quantidade de escleródios em escuro contínuo.

Em condições de luz contínua e alternância luminosa, os isolados SR3 e SR5 superaram os demais (P<0,05), concordando com os resultados obtidos por Lang (1989) e Blum et al. (1993) que verificaram efeito da luz na produção de escleródios de diferentes isolados de S. rolfsii, principalmente quando os isolados foram submetidos às condições de claro contínuo e alternância luminosa. Entretanto, em condição de escuro contínuo, embora os isolados SR3 e SR5 tenham diferido em relação aos demais isolados, SR3 foi o que apresentou maior (P<0,05) produção de escleródios (Tabela 2).

Não houve efeito dos regimes de luz utilizados sobre a produção de escleródios pelos isolados SR1, SR2 e SR4 constatando-se que há variação entre os isolados quanto a este critério.

Produção de escleródios em seis diferentes substratos

Os resultados obtidos para a produção de escleródios dos cinco isolados de S. rolfsii, nos diferentes substratos utilizados no experimento (Tabela 3) mostraram que o efeito do substrato variou com o isolado. O isolado SR1 produziu maior (P<0,05) número de escleródios em casca de arroz, SR3 e SR5 em aveia e fubá, SR4 em fubá e SR2 em aveia, fubá e casca de arroz. Esses resultados podem ser comparados com os obtidos por Lang (1989), que constatou uma maior produção de escleródios em meio de aveia-ágar e os obtidos por Blum et al. (1993); Fernandes et al. (1993); Ferraz & Café Filho (1998), que verificaram maior formação de escleródios com a adição de fubá de milho aos meios de cultura.

Todos os isolados, exceto SR1, produziram escleródios em sorgo concordando com Beute & Rodriquez-Kabana (1979) que obtiveram grande número escleródios de S. rolfsii em sementes de sorgo autoclavadas. Resultados interessantes com este substrato foram obtidos por Neto & Blum (2004) que verificaram que semente de sorgo proporcionou bom crescimento micelial e germinação de escleródios de S. rolfsii.

De maneira geral, o arroz beneficiado não favoreceu a produção de escleródios em quaisquer dos isolados testados. No entanto, este resultado difere daqueles obtidos por Matsumoto et al. (2000), que obtiveram grande quantidade de escleródios tanto em arroz autoclavado como cru. A discordância dos resultados pode ser atribuída à variabilidade e a origem dos isolados. Matsumoto et al. (2000) utilizaram isolados obtidos de pepino e feijoeiro, procedentes do Paraná, região de clima e solo amplamente distintos do Maranhão, local de origem dos isolados estudados neste trabalho.

O substrato casca de arroz favoreceu a produção esclerodial de todos os isolados, com exceção do SR4, que somente iniciou o processo de produção após a leitura final do experimento. Não foram encontradas referências ao uso de casca de arroz, como substrato para produção de escleródios de S. rolfsii. O baixo custo, bem como a fácil obtenção, tornam esse substrato com elevada potencialidade para a utilização nos estudos com este fungo.

Os isolados SR3 e SR5 apresentaram maior (P<0,05) produção de escleródios, em quase todos os substratos estudados, destacando-se significativamente em aveia-ágar e fubá-ágar, sendo favorecidos pela luminosidade contínua (Tabelas 2 e 3). Os resultados sugerem a existência de diferenças genéticas quanto à formação de escleródios entre isolados, fato já observado anteriormente para este fungo por Ferraz & Café Filho (1998); Harlton et al. (1995); Zoberi (1980). Deve ser destacado que estes mesmos isolados divergiram quanto à taxa crescimento micelial, apresentando SR3 e SR5 crescimento de 152,2 mm/h e 113,5 mm/h, respectivamente, e quanto à compatibilidade vegetativa.

É importante salientar que os isolados SR3 e SR5, além de mostrar maior capacidade na produção de escleródios, cuja formação foi mais precoce (24-48 h) que os isolados SR1, SR2 e SR4, as colônias derivadas desses escleródios apresentaram menos vigor que aquelas oriundas de escleródios dos isolados SR1, SR2 e SR4. Estes últimos mostraram maior vigor na germinação, talvez em função do seu maior tamanho.

Observação similar foi verificada por Lang (1989) quando avaliou a produção de escleródios de dois isolados de S. rolfsii, obtidos de chuchu (Sechium edule Swartz) e feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), respectivamente.

Embora tenham sido utilizados poucos isolados, os resultados deste trabalho evidenciam que a variabilidade existente em S. rolfsii tem expressão distinta em função de características fisiológicas como crescimento micelial, compatibilidade vegetativa e produção de escleródios em diferentes substratos e regime de luminosidade.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Dr. Rildo Sartori B. Coelho (Universidade Federal Rural de Pernambuco) pela valiosa contribuição na revisão do manuscrito.

Aceito para publicação em 01/10/2004

Autor para correspondência: Ilka Márcia R. de S. Serra

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Trabalho de conclusão do curso de Agronomia da primeira autora. Universidade Estadual do Maranhão (2001).

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Bolsista do CNPq

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  18 Mar 2005
• Data do Fascículo
  Fev 2005

Histórico

• Aceito
  01 Out 2004