Infecção por Helicobacter pylori e câncer gástrico: freqüência de cepas patogênicas cagA e vacA em pacientes com câncer gástrico

Helicobacter pylori and gastric cancer: distribution of cagA and vacA genotypes in patients with gastric carcinoma

ARTIGO ORIGINAL ORIGINAL PAPER

Infecção por Helicobacter pylori e câncer gástrico: freqüência de cepas patogênicas cagA e vacA em pacientes com câncer gástrico

Helicobacter pylori and gastric cancer: distribution of cagA and vacA genotypes in patients with gastric carcinoma

Cristiane Melissa Thomazini^I; Nídia Alice Pinheiro^II; Maria Inês Pardini^II; Luís Eduardo Naresse^III; Maria Aparecida Marchesan Rodrigues^IV

^IMestranda do Programa de Pós-Graduação em Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu/Universidade Estadual Paulista (Unesp)

^IIPesquisadora científica do Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro, Faculdade de Medicina de Botucatu/Unesp

^IIIProfessor livre-docente do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da Faculdade de Medicina de Botucatu/Unesp

^IVProfessora titular do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu/Unesp

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

INTRODUÇÃO: Apesar da alta freqüência de infecção por Helicobacter pylori na população, somente uma minoria de indivíduos desenvolve câncer gástrico. É provável que a colonização da mucosa por cepas patogênicas, levando a maior agressão e inflamação da mucosa seja um dos elos da cadeia de eventos da oncogênese gástrica.

OBJETIVOS: Investigar a freqüência de cepas patogênicas cagA e vacA do H. pylori em pacientes com câncer gástrico.

MATERIAL E MÉTODOS: Foram estudados retrospectivamente 42 pacientes com câncer gástrico. A infecção por H. pylori foi avaliada por exame histológico e pelo PCR para identificação dos genótipos cagA e vacA em amostras de material fixado em formalina e incluído em parafina.

RESULTADOS: A análise histológica permitiu a visualização direta do H. pylori em 85,7% dos casos, e o método de PCR para o gene urease C demonstrou a presença de DNA da bactéria em 95% dos casos. O gene cagA foi detectado em amostras de 23 pacientes (54,7%) com câncer gástrico. O alelo s1 do gene vacA foi identificado em amostras de 24 pacientes (57,1%) e o alelo m1, em amostras de 26 pacientes (61,9%). Os alelos s1 e m1 foram identificados simultaneamente em 24 pacientes (57,1%). O alelo s2 foi identificado em amostras de quatro pacientes (9,5%), e o alelo m2, em amostras de três pacientes (7,1%). A freqüência de infecção pelo Helicobacter pylori foi similar em ambos os tipos histológicos de câncer gástrico (intestinal e difuso).

CONCLUSÕES: Os resultados confirmam a relevância dos genótipos patogênicos cagA e vacA do H. pylori para lesões orgânicas significativas tais como o câncer gástrico, sugerindo a participação dessa bactéria na cadeia de eventos da oncogênese gástrica.

Unitermos: Helicobacter pylori, Câncer gástrico, cagA, vacA.

ABSTRACT

BACKGROUND: The rates of Helicobacter pylori infection are very high worldwide, but only a minority of infected patients develop gastric carcinoma. This might be related, among several factors, to the colonization of the human stomach by pathogenic Helicobacter pylori strains.

OBJECTIVE: To investigate the distribution of cagA and vacA genotypes of Helicobacter pylori in paraffin-embedded gastric samples from patients with gastric cancer.

MATERIAL AND METHODS: Paraffin-embedded samples from 42 patients with gastric cancer were histologically examined and evaluated by PCR for H. pylori cagA and vacA (s and m regions) genotypes.

RESULTS: Histological analysis allowed direct visualization of H. pylori in 85.7% of cases and PCR for urease C gene detected H. pylori in 95% of cases. The presence of cagA gene was detected in 23 (54.7%) patients with gastric cancer. The s1 allele from vacA gene was found in samples from 24 (57.1%) patients and the m1 allele in 26 (61.9 %). The s1m1 genotype was detected in 24 (57.1%) patients with gastric cancer. The s2 allele was found in samples from four patients (9.5%) and the m2 allele in three (7.1%) patients. The distribution of H. pylori genotypes was similar in both intestinal and diffuse types of gastric carcinoma.

CONCLUSION: Our results confirm the relevance of the pathogenic cagA and vacA H. pylori genotypes for significant organic lesions, such as gastric cancer, suggesting a possible role for H. pylori in the pathogenesis of gastric carcinoma.

Key words: Helicobacter pylori, Gastric cancer, cagA, vacA.

Introdução

O câncer gástrico permanece entre os problemas mais sérios de saúde em vários países, incluindo o Brasil^{(12, 27)}. O diagnóstico geralmente é feito na fase avançada de progressão da doença, o que dificulta a eficácia dos procedimentos terapêuticos e o prognóstico dos pacientes⁽⁵⁾. Torna-se, portanto, relevante a identificação de fatores que possam ser utilizados como biomarcadores de risco para essa doença.

Os fatores etiológicos envolvidos na gênese do câncer gástrico não são inteiramente conhecidos. Estudos epidemiológicos demonstram a importância de fatores ambientais, notadamente alimentares, na patogenia do câncer gástrico^{(7, 11, 24)}. Um novo fator tem sido investigado na oncogênese gástrica: postula-se que a infecção pelo Helicobacter pylori levando à gastrite crônica, atrofia da mucosa e metaplasia intestinal tenha participação na cadeia de eventos da gênese do câncer gástrico^{(13, 18, 22)}. A Organização Mundial de Saúde classificou o H. pylori como agente carcinogênico do grupo I para a ocorrência de neoplasias gástricas⁽¹³⁾. O H. pylori está presente em grande parcela da população mundial. No entanto, ínfimo número de pessoas desenvolve câncer gástrico. O risco é de cerca de 1% nos indivíduos infectados⁽¹¹⁾. Assim, as diferentes cepas da bactéria com padrões de virulência distintos devem atuar no hospedeiro, levando a diferentes graus de inflamação da mucosa gástrica. A virulência do H. pylori tem sido relacionada a diferentes fatores, incluindo a produção de urease, a presença de flagelos e a citotoxina vacuolizante^{(14, 21)}.

Em estudos recentes observamos que pacientes com infecção por Helicobacter pylori apresentaram danos no DNA das células epiteliais da mucosa gástrica, que se correlacionaram com a intensidade da resposta inflamatória na mucosa e com os genótipos patogênicos cagA e vacA do H. pylori^{(15, 16)}. Esses resultados abrem a perspectiva de se investigar a possível correlação entre os diferentes genótipos da bactéria e as características clinicopatológicas do câncer gástrico.

A presente investigação visa avaliar a freqüência de infecção por Helicobacter pylori em amostras de mucosa gástrica, de material fixado em formalina e incluído em parafina, procedentes de pacientes com câncer gástrico e caracterizar, pela reação da polimerase em cadeia (PCR) com oligonucleotídeos específicos, os genótipos patogênicos cagA e vacA da bactéria.

Material e métodos

Casuística

Quarenta e dois casos de câncer gástrico diagnosticados e arquivados no Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu, da Universidade Estadual Paulista (Unesp), no período de 1998 a 2004, foram analisados neste estudo. As informações clínicas foram pesquisadas nos prontuários dos pacientes.

Seleção das amostras e estudo histopatológico

Amostras de tumor e respectivo tecido normal foram obtidas a partir de tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina. Cortes histológicos de 5mm corados por hematoxilina-eosina foram submetidos a exame histopatológico para caracterização de tipo histológico, contaminação com tecido normal e estadiamento das neoplasias. Os tumores foram classificados em intestinal ou difuso, de acordo com a classificação de Lauren⁽¹⁷⁾. Tumores com expressão morfológica combinada, intestinal e difusa, foram designados mistos. A gastrite foi classificada de acordo com a classificação de Sydney⁽⁹⁾. A pesquisa de Helicobacter pylori foi feita pelo exame histológico, na mucosa gástrica adjacente à neoplasia, em cortes corados pelo método de Giemsa. A caracterização dos genótipos do Helicobacter pylori foi feita por PCR. O estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu/Unesp.

Detecção dos genótipos do H. pylori por PCR

Amostras do tumor e da mucosa adjacente à neoplasia foram obtidas de cortes histológicos do material fixado em formalina, incluído em parafina. A extração do DNA genômico dos tumores e respectivos tecidos normais de cada paciente foi feita por tratamento com proteinase K e pelo Kit Wizard (Promega).

A integridade e a qualidade das amostras extraídas foram verificadas por PCR com oligonucleotídeos iniciadores para o gene constitutivo GAPDH (gliceraldeído 3-fosfato). Foram investigadas seqüências específicas para o gene urease C, gene espécie-específico presente em todas as amostras de H. pylori, que codifica a enzima urease, bem como para o gene de virulência cagA do H. pylori. A composição de bases dos oligonucleotídeos iniciadores, o tamanho das seqüências, as referências e a temperatura de anelamento utilizadas são apresentados na Tabela 1.

A mistura de reação de PCR para detecção do gene GAPDH constou de: tampão de reação 10x [200mM Tris-HCl, 500mM KCl (pH 8.4)]; 1,5mM MgCl₂; 0,4mM de cada dNTP(10mM); 1µl de Platinum Taq DNA Recombinante (5µl/µl) (Invitrogen Life Technologies); 5pmoles de cada oligonucleotídeo (sense e antisense); 1µl de DNA molde (concentrado) e água q.s.p. 25µl. Para a detecção dos genes urease C e cagA foram utilizados: tampão de reação 10x [200mM Tris-HCl, 500mM KCl (pH 8.4)]; 3mM MgCl₂(50mM); 0,2mM de cada dNTP(10mM), 1µl de Platinum Taq DNA Platinum (5µl/µl) (Invitrogen Life Technologies); 5pmoles de cada oligonucleotídeo (sense e antisense); 1µl de DNA molde (concentrado) e água q.s.p. 25µl. A eletroforese do DNA amplificado foi realizada em gel de poliacrilamida 6% e corada pelo nitrato de prata.

Para a amplificação do gene vacA e de seus alelos s1/s2 e m1/m2 foram utilizados 1µl de DNA e oligonucleotídeos específicos para cada região (Tabela 1). Na reação de PCR para os alelos m1 e m2 utilizou-se solução contendo: 1.5µl de AmpliTaq Gold (5µl/ml Applied Biosystems); tampão 10x para PCR [100mMTris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 3mM de MgCl₂ 0.01% de gelatina](Applied Biosystems); 0,4mM de oligonucleotídeos iniciadores sense e antisense; 1µl de DNA molde (concentrado); 0,4mM de dNTPs e água q.s.p. 25ml. Na reação de PCR para a região s do gene vacA utilizou-se solução contendo: 1µl de Accu Primer (Invitrogen Life Technologies); tampão 10x para PCR [100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 0,4mM de dNTPs]; 3mM de MgCl₂; 0,4mM de oligonucleotídeos iniciadores sense e antisense; 1µl de DNA molde (concentrado) e água q.s.p. 25ml. As reações foram realizadas em termociclador do tipo MJ Research, (Waretown, MA, USA). A visualização do produto de PCR foi realizada em gel de poliacrilamida 6% não-desnaturante, corado com nitrato de prata⁽²⁶⁾. Como controles positivos e negativos para vacA (s1/s2 e m1/m2), cagA e urease C, foram utilizadas amostras previamente genotipadas como positivas ou negativas e submetidas a seqüenciamento, em seqüenciador automático ABI Prism 377 (Applied Biosystems) e comparadas às seqüências depositadas nos bancos de dados genômicos públicos.

Resultados

Os atributos demográficos e anatomopatológicos são apresentados na Tabela 2. A idade dos pacientes variou de 27 a 78 anos, sendo a média 62,2 anos. Vinte e quatro pacientes eram do sexo masculino (58%) e 18, do sexo feminino (42%). O exame anatomopatológico demonstrou que o tumor estava localizado no antro gástrico em 26 casos (61,9%). Tumores em localização proximal, situados no corpo ou na cárdia foram observados em 16 casos (38,1%). O tipo histológico mais freqüente foi o adenocarcinoma intestinal, identificado em 34 casos (80,9%). O tipo difuso foi observado em seis casos (14,2%). Neoplasias com fenótipo morfológico misto, constituídas por áreas de padrão intestinal e áreas de padrão difuso foram identificadas em dois casos (4,7%).

A análise histológica da mucosa gástrica adjacente às neoplasias demonstrou em todos os casos a presença de infiltrado inflamatório linfoplasmocitário com neutrófilos, cuja intensidade variou de leve a grave, no cório da mucosa. Metaplasia intestinal foi observada em 22 casos (52,3%). A pesquisa de Helicobacter pylori pelo método de Giemsa foi positiva em 36 casos (85,7%). A freqüência de infecção por Helicobacter pylori foi similar em ambos os tipos histológicos de câncer gástrico (intestinal e difuso).

Distribuição dos genótipos do H. pylori por PCR

A Tabela 3 demonstra a distribuição dos genes urease C, cagA e de genótipos do vacA em amostras da mucosa gástrica de 42 pacientes com câncer gástrico.

O gene urease C, espécie-específico para o H. pylori, foi identificado em amostras obtidas de 40 pacientes (95%) com câncer gástrico. O gene cagA foi detectado em amostras de 23 pacientes (54,7%) com câncer gástrico. O alelo s1 do gene vacA foi identificado em amostras de 24 pacientes (57,1%), e o alelo s2 foi identificado em amostras obtidas de seis pacientes (14,2%) com câncer gástrico. Três amostras apresentaram simultaneamente os alelos s1/s2. O alelo m1 foi detectado em amostras de 26 pacientes (61,9%). O alelo m2 foi encontrado em três amostras (7,1%). Duas amostras apresentaram os dois alelos m1/m2. A combinação alélica s1 e m1 foi identificada em 24 pacientes (57,1%) com câncer gástrico.

Discussão

No presente estudo descrevemos a análise de cepas do H. pylori por PCR na mucosa gástrica de 42 pacientes com câncer gástrico. A investigação foi retrospectiva, em amostras de tecido fixado em formalina e incluído em parafina. Tal abordagem foi oportuna, porque permitiu detectar a presença de DNA do H. pylori e estimar a possível relação de cepas patogênicas dessa bactéria com parâmetros clinicopatológicos do câncer gástrico.

A detecção do H. pylori foi avaliada por dois métodos: pela análise histológica, que permitiu a visualização direta da bactéria em 85,7% dos casos e pelo PCR, para o gene urease C, que demonstrou a presença de DNA da bactéria em 95% dos casos. O método de visualização direta ao microscópio é eficiente e de baixo custo, entretanto requer habilidade diagnóstica do analista para identificar a bactéria⁽¹⁰⁾. Já o método de PCR, apesar do custo, apresenta maior sensibilidade, como pode ser documentado por nossos resultados, visto que foi capaz de identificar o genótipo do H. pylori em cinco amostras que haviam sido negativas ao exame histológico.

O gene cagA, que é marcador da ilha de patogenicidade cagPAI, codificadora de componentes do sistema de secreção da bactéria^{(4, 19)} foi identificado em 54,7% dos casos de câncer gástrico analisados no presente estudo. Esses dados estão de acordo com investigações prévias, que demonstraram que pacientes infectados por cepas de H. pylori que expressam o gene cagA têm maior probabilidade de desenvolver câncer gástrico do que aqueles infectados por cepas que não expressam cagA^{(3, 20)}. No Brasil, estudo de casos controle desenvolvido em Belo Horizonte, Minas Gerais, demonstrou que o status cagA tem alto impacto no risco para desenvolvimento de câncer gástrico distal⁽²³⁾.

Os alelos s1 e m1 do gene vacA, que codifica a produção da citotoxina vacuolizante^{(25, 28)}, foram detectados em 57,1% e 61,9% dos casos, respectivamente, na presente investigação. A citotoxina vacA é considerada importante fator de virulência, visto que contribui para a produção, pela urease, de alcalóides que podem induzir danos no DNA das células epiteliais^{(14, 25, 28)}. Em estudo recente observamos que a colonização da mucosa gástrica por cepas cagA/vacA s1 m1 do H. pylori associou-se a resposta inflamatória mais intensa e maiores níveis de danos no DNA das células epiteliais⁽¹⁶⁾. Esses dados referendam a correlação dos genótipos patogênicos cagA e vacA do H. pylori com a agressão crônica à mucosa expressa em nível morfológico por infiltrado inflamatório rico em enzimas e radicais livres capazes de lesar as células epiteliais. A reparação inadequada de lesões no DNA das células pode levar a mutações e instabilidade genômica, constituindo a etapa de iniciação do processo de carcinogênese.

Com relação à combinação dos diferentes alelos do Helicobacter pylori, verificamos que cepas cagA + s1m1 foram encontradas em maior número de casos de câncer gástrico. Na literatura observamos que cepas cagA + s1/m1 são mais virulentas⁽²⁾. Bactérias com o genótipo m1 estão relacionadas com maior liberação de citotoxinas⁽¹⁾. Dessa forma, a presença de cepas cagA + s1/m1 pode estar relacionada a maior agressão e inflamação na mucosa, contribuindo para a gênese do câncer gástrico.

Não encontramos diferenças quanto à distribuição dos genótipos cagA e vacA do H. pylori em relação ao sexo e à idade dos pacientes, bem como quanto aos tipos histológicos intestinal ou difuso do câncer gástrico. Apesar de a presente casuística ser pequena, nossos resultados estão de acordo com os relatados pelos estudos de Queiroz, que também não observaram correlação dos genótipos da bactéria com atributos demográficos e com parâmetros histopatológicos do câncer gástrico⁽²³⁾.

Em síntese, a presença de infecção por Helicobacter pylori, avaliada em nosso estudo pela análise histológica, permitiu a visualização direta da bactéria em 85,7% dos casos, e pelo PCR, para o gene urease C, demonstrou a presença de DNA da bactéria em 95% dos casos, sendo a combinação alélica mais freqüente cagA + vacA s1/m1. Esses resultados destacam a alta prevalência de infecção por Helicobacter pylori no estômago de pacientes com câncer gástrico atendidos na região de Botucatu, São Paulo, e confirmam a relevância do genótipo cagA m1/s1 na patogênese do câncer gástrico.

Agradecimentos

À Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (Fundunesp), processo 940/04, pelo auxílio à pesquisa.

Primeira submissão em 29/09/05

Última submissão em 21/12/05

Aceito para publicação em 11/01/06

Publicado em 20/02/06

Apoio financeiro: Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (Fundunesp).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Jun 2006
• Data do Fascículo
  Fev 2006

Histórico

• Revisado
  21 Dez 2005
• Recebido
  29 Set 2005
• Aceito
  11 Jan 2006