Suscetibilidade a antifúngicos in vitro de Candida spp. em pacientes do Hospital Universitário Regional de Maringá-PR

Antifungal susceptibility of Candida spp. in vitro among patients from Regional University Hospital of Maringá-PR

Resumos

INTRODUÇÃO: No ambiente hospitalar, são frequentes as infecções por leveduras do gênero Candida spp., o que torna esse assunto um importante alvo de estudos. OBJETIVO: Avaliar o perfil de suscetibilidade aos antifúngicos de espécies de Candida de pacientes internados no Hospital Universitário Regional de Maringá-PR (HURM). MATERIAL E MÉTODOS: As amostras foram submetidas ao teste de microdiluição em caldo (MD), segundo o documento M27-A3 para determinação da concentração inibitória mínima (CIM), e ao teste de difusão em disco de acordo com o documento M44-A2, ambos do Clinical Laboratory Standarts Institute (CLSI). RESULTADOS E DISCUSSÃO: Foram obtidos 91 isolados provenientes de amostras de urina, hemocultura, ponta de cateter, secreção orotraqueal, entre outros, sendo 38 Candida albicans, 23 C. tropicalis, 16 C. gabrata, 10 C. parapsilosis e quatro C. krusei. Dos antifúngicos testados, anfotericina B, voriconazol e anidulafungina foram os mais eficazes. CONCLUSÃO: A comparação entre as metodologias de microdiluição em caldo e disco difusão (DD) mostrou boa correlação para fluconazol para a maioria das espécies de Candida spp., sendo possível destacar que a DD é útil para triagem dos principais antifúngicos usados na prática clínica. No entanto, casos de resistência detectados por DD devem ser confirmados por meio do método de MD, evitando, assim, resultados falsos resistentes, melhorando a eficácia e a segurança do tratamento.

Suscetibilidade; Candida; Microdiluição; Disco difusão


INTRODUCTION: Due to the ubiquity of nosocomial yeast infections of the genus Candida spp., studies in this area have become increasingly relevant. OBJECTIVE: To evaluate the antifungal Candida spp. susceptibility profile of hospitalized patients from the Regional University Hospital of Maringá-PR (HURM). MATERIAL AND METHODS: The samples were submitted to broth microdilution test (MD) according to protocol M27-A3 in order to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and disk diffusion test according to protocol M44-A2, both from Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). RESULTS AND DISCUSSION: We obtained 91 isolates from urine samples, blood culture, catheter tip, endotracheal secretions, among others, from which 38 were Candida albicans, 23 were C. tropicalis, 16 were C. gabrata, 10 were C. parapsilosis, and four were C. krusei. Among the tested antifungal medications, amphotericin B, voriconazole and anidulafungin proved to be the most effective. CONCLUSION: In the comparison between broth microdilution and disk diffusion (DD) methods, fluconazole showed good correlation for most Candida spp., which corroborates the usefulness of DD in the screening of main antifungal agents used in clinical practice. Nonetheless, cases of resistance detected by DD need to be confirmed by MD method, which avoids false-resistant results and maximizes the treatment efficacy and reliability.

Susceptibility; Candida; Microdilution; Disk diffusion


ARTIGO ORIGINAL ORIGINAL PAPER

Suscetibilidade a antifúngicos in vitro de Candida spp. em pacientes do Hospital Universitário Regional de Maringá-PR

Antifungal susceptibility of Candida spp. in vitro among patients from Regional University Hospital of Maringá-PR

Fernanda de Oliveira DemittoI; Renata Claro Ribeiro do AmaralII; Renata Perugini BiasiIII; Eliana GuilhermettiIV; Terezinha Inez Estivalet SvidzinskiV; Lilian Cristiane BaezaVI

IGraduada em Farmácia; mestranda em Ciências da Saúde da Universidade Estadual de Maringá (UEM)

IIGraduada em Farmácia; mestranda em Biociências Aplicadas à Farmácia da UEM

IIIFarmacêutica

IVMestra em Análises Clínicas pela UEM; farmacêutica bioquímica

VDoutora em Microbiologia e Imunologia pela Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP); professora associada da UEM

VIDoutora em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia pela Universidade Estadual Paulista (UNESP); professora adjunta da UEM

Endereço para correspondência

RESUMO

INTRODUÇÃO: No ambiente hospitalar, são frequentes as infecções por leveduras do gênero Candida spp., o que torna esse assunto um importante alvo de estudos.

OBJETIVO: Avaliar o perfil de suscetibilidade aos antifúngicos de espécies de Candida de pacientes internados no Hospital Universitário Regional de Maringá-PR (HURM).

MATERIAL E MÉTODOS: As amostras foram submetidas ao teste de microdiluição em caldo (MD), segundo o documento M27-A3 para determinação da concentração inibitória mínima (CIM), e ao teste de difusão em disco de acordo com o documento M44-A2, ambos do Clinical Laboratory Standarts Institute (CLSI).

RESULTADOS E DISCUSSÃO: Foram obtidos 91 isolados provenientes de amostras de urina, hemocultura, ponta de cateter, secreção orotraqueal, entre outros, sendo 38 Candida albicans, 23 C. tropicalis, 16 C. gabrata, 10 C. parapsilosis e quatro C. krusei. Dos antifúngicos testados, anfotericina B, voriconazol e anidulafungina foram os mais eficazes.

CONCLUSÃO: A comparação entre as metodologias de microdiluição em caldo e disco difusão (DD) mostrou boa correlação para fluconazol para a maioria das espécies de Candida spp., sendo possível destacar que a DD é útil para triagem dos principais antifúngicos usados na prática clínica. No entanto, casos de resistência detectados por DD devem ser confirmados por meio do método de MD, evitando, assim, resultados falsos resistentes, melhorando a eficácia e a segurança do tratamento.

Unitermos: Suscetibilidade. Candida. Microdiluição. Disco difusão

ABSTRACT

INTRODUCTION: Due to the ubiquity of nosocomial yeast infections of the genus Candida spp., studies in this area have become increasingly relevant.

OBJECTIVE: To evaluate the antifungal Candida spp. susceptibility profile of hospitalized patients from the Regional University Hospital of Maringá-PR (HURM).

MATERIAL AND METHODS: The samples were submitted to broth microdilution test (MD) according to protocol M27-A3 in order to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and disk diffusion test according to protocol M44-A2, both from Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI).

RESULTS AND DISCUSSION: We obtained 91 isolates from urine samples, blood culture, catheter tip, endotracheal secretions, among others, from which 38 were Candida albicans, 23 were C. tropicalis, 16 were C. gabrata, 10 were C. parapsilosis, and four were C. krusei. Among the tested antifungal medications, amphotericin B, voriconazole and anidulafungin proved to be the most effective.

CONCLUSION: In the comparison between broth microdilution and disk diffusion (DD) methods, fluconazole showed good correlation for most Candida spp., which corroborates the usefulness of DD in the screening of main antifungal agents used in clinical practice. Nonetheless, cases of resistance detected by DD need to be confirmed by MD method, which avoids false-resistant results and maximizes the treatment efficacy and reliability.

Key words: Susceptibility. Candida. Microdilution. Disk diffusion

Introdução

A incidência de infecções hospitalares causadas por fungos (IHF) tem aumentado de maneira significativa nas últimas décadas, tendo inúmeros fatores relacionados com seu desenvolvimento, como antibioticoterapia prévia, nutrição parenteral, ventilação mecânica, prematuridade, imunossupressão, uso de corticoides, neutropenia, quimioterapia, hospitalização prévia, uso de cateter venoso central e outros dispositivos invasivos(11).

Leveduras do gênero Candida são os agentes etiológicos mais frequentemente isolados, sendo responsáveis por 80% das IHF. São o quarto microrganismo responsável por infecções da corrente sanguínea(4, 8, 31).

Candida albicans é ainda considerada a espécie mais isolada, mas tem havido mudanças nesse perfil com a emergência de C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. lusitaniae e C. guillermondii(17). As razões para essa inversão no padrão de distribuição das espécies ainda não foram completamente elucidadas, podendo estar fortemente relacionadas com o potencial de virulência e a resistência desses microrganismos aos antifúngicos(7).

As peculiaridades apresentadas por diferentes espécies de Candida, do ponto de vista terapêutico e epidemiológico, justificam a necessidade de identificar as leveduras ao nível de espécie, bem como avaliar a susceptibilidade desses isolados ante os principais antifúngicos. Esse procedimento é fundamental para permitir a escolha da melhor abordagem terapêutica a ser instituída no paciente infectado(19).

Atualmente, a resistência aos antifúngicos entre as espécies de Candida spp. tem sido um problema crescente e já foi detectada em diversos estudos, inclusive possíveis mecanismos moleculares responsáveis por ela(9, 30). Essa resistência pode ser clínica ou in vitro. A primeira pode ser consequência do baixo nível do fármaco no tecido e no sangue, devido à interação entre os fármacos ou à imunodepressão do paciente. A resistência in vitro pode ser do tipo secundária, cujas cepas resistentes foram selecionadas em razão do prévio contato com o antifúngico. É consenso que a resistência ao fármaco depende da interação entre o hospedeiro, o fármaco e o fungo(35).

O desenvolvimento de métodos para avaliar a suscetibilidade aos antifúngicos tem sido objeto de numerosos estudos nas últimas décadas. Assim, o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) tem desenvolvido e padronizado testes para determinação da suscetibilidade in vitro de leveduras, como os métodos de diluição em caldo (MD), considerado o padrão-ouro(6) e a difusão em disco (DD)(5). Em caso de candidemia causadas por leveduras do gênero Candida, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) recomenda como método de triagem a DD para avaliação da suscetibilidade in vitro frente ao fluconazol. O teste de DD é de fácil execução, com rapidez em seus resultados, não necessitando de equipamentos de elevados custos e especializados(24). Portanto, este trabalho tem por objetivo avaliar o perfil de suscetibilidade aos antifúngicos pelas metodologias de MD e DD das espécies de Candida spp. isoladas do Hospital Universitário Regional de Maringá (HURM) durante o ano de 2010.

Material e métodos

Microrganismos

Foram selecionados para este estudo isolados clínicos de Candida spp. pertencentes à micoteca do Laboratório de Micologia Médica da Universidade Estadual de Maringá-PR, provenientes de pacientes internados no Hospital Universitário Regional da referida cidade, durante o ano de 2010.

Foram incluídas somente amostras comprovadamente de infecção urinária, segundo os critérios da Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH), como culturas puras para leveduras, sem desenvolvimento de bactérias, e contagem de colônias obrigatoriamente superior a 105 UFC/ml de urina. Para pacientes em uso de sonda vesical, a coleta da urina foi realizada 24h após a troca do dispositivo(18). Em relação às hemoculturas, estas só foram incluídas neste estudo quando apresentaram desenvolvimento de leveduras em duas amostras. Quanto aos outros sítios (ponta de cateter e aspirado traqueal [TOT]), levou-se em consideração o não desenvolvimento de nenhum outro microrganismo patogênico. Portanto, essas culturas foram obtidas dos seguintes materiais biológicos: sangue, urina, ponta de cateter e TOT.

Identificação laboratorial

Antes da realização das provas de identificação, as leveduras foram cultivadas em CHROMagarTMCandida (Probac) para verificar a pureza das colônias. Elas foram identificadas segundo as provas clássicas de identificação, incluindo formação de tubo germinativo, fermentação, assimilação de carboidratos e morfologia em Ágar fubá, suplementado com tween 80(21). Depois de identificados, os microrganismos foram estocados em Sabouraud Dextrose Caldo com glicerol a - 80ºC. Para os testes de suscetibilidade, as leveduras foram reativadas em Sabouraud Dextrose Agar por 24h a 35ºC.

Microdiluição em caldo

O teste de MD foi realizado de acordo com o documento M27-A3 do CLSI(6). Foram testados os seguintes antifúngicos: anfotericina B (Bristol-Myers Squibb), itraconazol (Janssen), fluconazol (Pfizer), voriconazol (Pfizer) e anidulafungina (Pfizer). O meio de cultura utilizado foi o RPMI-1640 (Gibco), tamponado com ácido morfolinopropanosulfônico (Sigma) pH 7,0 e suplementado com 2% de glicose, como proposto pelo European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)(14).

A suspensão de leveduras foi ajustada em espectrofotômetro (530 nm) para obter a concentração final de 0,5 a 2,5 × 103 células/ml; o teste foi realizado em microplacas de 96 poços; a incubação foi feita a 35ºC por 48h, com agitação constante; a leitura foi realizada em leitora de microplacas (Expert plus-ASYS®) a 490 nm; a concentração inibitória mínima (CIM) foi definida como a menor concentração do antifúngico, capaz de promover 50% de inibição para os azólicos e a anidulafungina e 90% para anfotericina B. Os resultados foram expressos em: sensível (S), sensível dependente de dose (SDD) e resistente (R). Os critérios de interpretação foram baseados no documento M27-A3 do CLSI(6): fluconazol CIM µ 8 µg/ml (S), CIM 16-32 µg/ml (SDD), CIM ≥ 64 µg/ml (R); itraconazol CIM µ 0,125 µg/ml (S), CIM 0,25-0,5 µg/ml (SDD), CIM ≥ 1 µg/ml (R); voriconazol CIM µ 1 µg/ml (S), CIM 2 µg/ml (SDD), CIM ≥ 4 µg/ml (R); anidulafungina CIM µ 2 µg/ml (S), CIM > 2 µg/ml (não suscetível); e anfotericina B CIM ≥1 µg/ml (R).

Teste de difusão em disco

O teste de DD foi realizado de acordo com o documento M44-A2 do CLSI(5). Os discos utilizados foram anfotericina B (CECON), itraconazol (CECON), voriconazol (OXOID) e fluconazol (CECON). Empregou-se o meio de cultura Agar Müller Hinton (DIFCO) suplementado com 2% de glicose e 0,5 g/ml de azul de metileno. A suspensão de leveduras foi ajustada para conter 1 a 5 × 106 células/ml (correspondente à escala 0,5 de Mac Farland). As placas foram incubadas por 24-48h a 35ºC. A leitura foi feita segundo as recomendações do fabricante, medindo o halo de inibição do crescimento. Os resultados foram expressos em S, SDD e R. Os critérios de interpretação para fluconazol e voriconazol foram baseados no documento M44-A2 do CLSI(5): fluconazol ≥ 19 mm (S), 15-18 mm (SDD), µ 14 mm (R); voriconazol ≥ 17 mm (S), 14-16 mm (SDD), µ 13 mm (R). Para os demais antifúngicos, os critérios de interpretação foram baseados nas recomendações do fabricante: itraconazol ≥ 20 mm (S), 12-19 mm (SDD), µ 11 mm (R); e anfotericina B ≥ 10 mm (S), µ 10 mm (R).

Foram utilizadas as cepas padrões de C. parapsilosis ATCC 22019 e C. albicans ATCC 90028 como controle para ambos os testes de suscetibilidade.

Resultados e discussão

No período avaliado, foram obtidos 91 isolados, sendo 38 de C. albicans (41,8%), 23 de C. tropicalis (25,3%), 16 de C. glabrata (17,6%), 10 de C. parapsilosis (10,9%) e quatro de C. krusei (4,4%). A maioria, portanto, foram espécies de C. não albicans (58,2%) em relação a C. albicans (41,8%) (Tabela 1). Segundo Krcmery e Barnes(19), aproximadamente 50% das infecções fúngicas em pacientes internados em Unidade de Terapia Intensiva (UTI) são provocadas por C. não albicans, sendo as espécies mais comuns C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei e C. parapsilosis.

Infecções fúngicas causadas por C. não albicans são de interesse especial por duas razões:

  • virulência e patogenicidade;

  • ocorrência da resistência às drogas antifúngicas atualmente disponíveis

    (10).

A maioria dos isolados foram provenientes de 64 amostras de urina (70,3%), seguido por 13 de sangue (14,3%), nove de ponta de cateter (9,9 %) e cinco de TOT (5,5%).

Está comprovado que pelo menos 20% dos indivíduos hospitalizados podem desenvolver candidúria ao longo de sua internação, particularmente pacientes de UTI ou expostos a outros fatores de risco, como idade avançada, antibioticoterapia de amplo espectro, uso de corticosteroides e imunossupressores, presença de anormalidades do trato urinário, diabetes, sondagem vesical de demora e longo tempo de internação hospitalar(15, 16). Estudos indicam que candidúria pode estar significativamente associada à candidemia, aumentando ainda mais o fator de risco para o desenvolvimento de complicadas infecções(3).

Em razão da alta ocorrência e gravidade das infecções fúngicas, verifica-se que é de extrema importância obter o diagnóstico rápido e preciso para que se inicie um tratamento eficaz e seguro. Devido a fatores limitantes dos métodos de diagnóstico convencionais, o tratamento com antifúngicos é frequentemente empírico em pacientes com risco elevado para infecção, causando problemas de toxicidade e aparecimento de resistência aos antifúngicos(13, 28).

Os resultados dos testes de MD e DD estão sumarizados na Tabela 2.

Neste estudo, o teste de MD recomendado para avaliação da suscetibilidade in vitro de leveduras aos antifúngicos mostrou, em relação ao fluconazol, 100% de sensibilidade para os isolados de C. albicans e C. parapsilosis. Para C. tropicalis, foi detectado 4,3% de resistência; para C. krusei, foi encontrado 100% de isolados SDD; e para C. glabrata, 18,8% de SDD e 6,2% de R. Em relação a C. glabrata e C. krusei, esses resultados eram esperados, visto que essas espécies têm baixa sensibilidade intrínseca ao fluconazol(36).

O aumento da CIM exigida pelas diferentes espécies de leveduras pode estar relacionado à exposição prévia ao fluconazol(32), que é a droga de escolha, seja para profilaxia ou para tratamento, na maioria dos casos, por sua farmacocinética favorável e baixa toxicidade, quando comparado a outros antifúngicos(20); o uso excessivo pode selecionar o aparecimento de resistência em isolados previamente sensíveis(1).

Foi observado que voriconazol foi mais efetivo em alguns isolados de leveduras resistentes ao fluconazol; por exemplo, 100% dos isolados de C. krusei foram sensíveis, bem como 93,8 % de C. glabrata e 95,7% de C. tropicalis. Ambos os azólicos, fluconazol e voriconazol mostraram eficácia equivalente in vitro. Esse fato pode estar relacionado com a resistência cruzada devido à similaridade da estrutura química desses azólicos(27), pois os isolados resistentes ao fluconazol também apresentaram resistência ao voriconazol.

Dos antifúngicos testados, a anfotericina B e a anidulafungina mostraram os melhores resultados nos testes in vitro. Apesar disso, na prática clínica, a anfotericina B deve ser administrada com cautela e ser reservada apenas para casos resistentes a outros medicamentos devido ao risco de toxicidade apresentado(34).

A anidulafungina pertencente à classe das equinicandinas é uma nova classe de antifúngicos que atua inibindo a síntese da (1,3)-β-D-glucana, um polissacarídeo presente em grande parte da estrutura da parede celular do fungo. Esse antifúngico é indicado no tratamento de pacientes com candidemia e outras formas de infecção invasiva por Candida spp.(12). Fica claro que a anidulafungina vem sendo uma droga promissora para o tratamento de infecções fúngicas, visto que no estudo realizado todos os isolados mostraram-se sensíveis a esse antifúngico. Esta é uma opção terapêutica em infecções causadas por espécies que têm baixa sensibilidade ou que são resistentes ao fluconazol, como C. glabrata e C. krusei. Diferentes trabalhos afirmam que as equinocandinas consistem de uma boa opção de tratamento, pois têm excelente atividade antifúngica ante as cinco espécies responsáveis por 97% das infecções fúngicas, como C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis e C. krusei(2).

O método de DD possui menor custo e fácil aplicação para rotina laboratorial quando comparado com o método de MD(24), porém está padronizado e validado somente para fluconazol e voriconazol. Neste estudo, foram incluídos outros antifúngicos usados na prática clínica, entretanto, alguns resultados foram discrepantes em relação ao método de referência.

Caso fossem levados em conta somente os resultados observados em DD, o itraconazol teria sido o antifúngico menos eficiente, uma vez que 10,5% de C. albicans, 52,2% de C. tropicalis e 30% de C. parapsilosis foram SDD, e 25% de C. krusei e 68,8% de C. glabrata foram resistentes. Quando comparamos os resultados de DD com MD, a concordância foi de 86,8% para C. albicans, 43,5% para C. tropicalis, 31,3% para C. glabrata, 70% para C. parapsilosis e nenhuma correlação para C. krusei. Essa discrepância pode ser atribuída à dificuldade de difusão do princípio ativo no agar(25). Além disso, alguns isolados de Candida spp. podem apresentar fenômeno de crescimento residual, o que implica uma superestimação da CIM, principalmente para antifúngicos nitrogenados, como os derivados azólicos(22).

Dos antifúngicos testados, a anfotericina B foi o que mostrou melhor correlação para C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis e C. krusei; a concordância entre as metodologias de MD e DD foi de 100% e para C. albicans, de 97,4%.

Em relação ao fluconazol e ao voriconazol, medicamentos de escolha para o tratamento das infecções invasivas, foi observado 100% de correlação, quando comparados os resultados da DD e MD para C. albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis. Entretanto, C. glabrata e C. krusei foram as espécies que apresentaram menor correlação para fluconazol, 37,5% e 0%, respectivamente. Os halos obtidos apresentaram menores diâmetros, dado compatível com suscetibilidade reduzida dessas espécies ao fluconazol. Para voriconazol, a correlação ficou em torno de 50% para ambas as espécies.

Um estudo realizado por Pfaller et al.(29) relacionando suscetibilidade com antifúngicos por diferentes metodologias em C. glabrata observou baixa correlação quando comparado a MD com os métodos de DD e E-test, 64,7% e 52,3%, respectivamente. Nesse estudo, a maioria das discrepâncias observadas foi quase inteiramente devido aos menores erros que consistem em deslocamentos entre a categoria de S ou R para SDD. Portanto, os casos "resistentes" detectados por DD devem ser confirmados pelo método de MD para evitar falsos resistentes, principalmente observados em C. não albicans(32).

Para Pfaller et al.(32), resultados falso-sensíveis não costumam ocorrer, assim o método de DD poderia ser usado na rotina laboratorial para a triagem da atividade antifúngica, sobretudo para fluconazol. Entretanto, nos casos em que foi detectada resistência por DD, há necessidade de um método confirmatório por MD.

Com base nesses resultados e de acordo com dados fornecidos por outros estudos(23, 26, 29), é possível destacar que o método de DD é útil para a determinação de resistência ao fluconazol, no entanto, ele não é confiável para a diferenciação entre isolados suscetíveis e SDD. Além disso, sabe-se que o principal objetivo é detectar a resistência aos antifúngicos. Portanto, o método de DD pode ser extremamente útil para tal determinação(33), porém mais pesquisas devem ser realizadas para garantir a padronização do método para outros agentes antifúngicos, além do fluconazol e do voriconazol.

Conclusão

Atualmente, os testes de suscetibilidade in vitro fornecem orientações importantes para o tratamento de candidíase. O teste de MD, apesar de ser considerado o método de referência, nem sempre está disponível na rotina laboratorial, em oposição a metodologias mais simples, como o teste de DD. Apesar dos dados apresentados sugerirem que a metodologia de DD pode ser implantada para a triagem dos principais antifúngicos utilizados na prática clínica para tratamento da maioria dos casos de candidíase invasiva, como fluconazol, voriconazol e anfotericina B, é importante o laboratório dispor do método de MD para confirmação de isolados resistentes. Outrossim, é fundamental identificar as leveduras ao nível de espécie e realizar estudos de vigilância epidemiológica continuamente para surpreender mudanças no perfil de suscetibilidade em função das práticas terapêuticas.

Agradecimentos

Agradecemos a ANVISA, a Organização Pan-Americana da Saúde (OPAS), a Fundação Araucária e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) o suporte financeiro.

  • Endereço para correspondência:
    Lilian Cristiane Baeza
    Universidade Estadual de Maringá
    Avenida Colombo, 5.790, zona 7
    CEP: 87020-900 - Maringá-PR
    Tel.: (44) 3011-4809
    Fax: (44) 3011-4959
    e-mail:
  • Primeira submissão em 30/11/11

    Última submissão em 24/05/12

    Aceito para publicação em 10/09/12

    Publicado em 20/10/12

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    Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      11 Dez 2012
    • Data do Fascículo
      Out 2012

    Histórico

    • Recebido
      30 Nov 2011
    • Aceito
      10 Set 2012
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