Foram analisados, com técnicas convencionais de citogenética e FISH, 30 exemplares da espécie Ancistrus cuiabae da baía Arrombado, próximo a Poconé, Pantanal do Mato Grosso. Foram observadas metáfases com número diploide 2n = 34 cromossomos para ambos os sexos e três fórmulas cariotípicas distintas, aqui denominadas de citótipo A, verificado em 06 machos e 11 fêmeas (20m, 8sm, 6st, Número Fundamental, NF = 68); citótipo B, em 08 machos e 04 fêmeas (19m, 8sm, 6st, 1a, NF = 67) e citótipo C em apenas 01 macho (18m, 8sm, 6st, 2a, NF = 66). As NORs confirmaram os distintos citótipos verificados, além de evidenciar que os cromossomos portadores de rDNA são os que representam o polimorfismo na espécie Ancistrus cuiabae. No citótipo A, as NORs foram verificadas na região terminal do braço curto do segundo par de cromossomos metacêntricos; no citótipo B, foram evidenciadas no segundo par, heteromórfico, no braço curto do cromossomo metacêntrico e intersticial no seu homólogo acrocêntrico; no citótipo C as NORs foram observadas na região intersticial num par de cromossomos acrocêntricos. A análise da heterocromatina constitutiva evidenciou blocos discretos adjacentes ao rDNA no segundo par de cromossomos de ambos os citótipos. Uma provável inversão pericêntrica é a hipótese proposta para a origem deste polimorfismo na espécie Ancistrus cuiabae. Estes resultados ampliam o conhecimento sobre o gênero Ancistrus, o mais derivado da tribo, contribuem para o conhecimento sobre este grupo de peixes e para inferir sobre a evolução cromossômica dos Ancistrini
