Interação de proteínas Cry1 e Vip3A de Bacillus thuringiensis para controle de lepidópteros-praga

Interaction of Cry1 and Vip3A proteins of Bacillus thuringiensis for the control of lepidopteran insect pests

Paula Cristina Brunini Crialesi-Legori Camila Chiaradia Davolos Ana Rita Nunes Lemes Suzana Cristina Marucci Manoel Victor Franco Lemos Odair Aparecido Fernandes Janete Apparecida Desidério Sobre os autores

Resumos

O objetivo deste trabalho foi avaliar a suscetibilidade das lagartas Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Erebidae) e Chrysodeixis includens (Lepidoptera: Noctuidae) às proteínas Cry1 e Vip3A, bem como determinar se há a interação entre essas proteínas no controle das duas espécies. Bioensaios com as proteínas isoladas e em combinações foram realizados, e as concentrações letais CL50 e CL90 foram estimadas para cada condição. As proteínas Cry1Aa, Cry1Ac e Vip3Af foram as mais efetivas no controle de A. gemmatalis, enquanto Cry1Ac, Vip3Aa e Vip3Af foram mais efetivas no de C. includens. As proteínas Cry1Ac e Cry1Ca causaram maior inibição do desenvolvimento das larvas sobreviventes à CL50, em ambas as espécies. Combinações entre Vip3A e Cry1 apresentam efeito sinérgico no controle das espécies e a combinação Vip3Aa+Cry1Ea destaca-se no controle de A. gemmatalis e C. includens. Essas proteínas combinadas são promissoras na construção de plantas piramidadas, para o controle simultâneo das pragas.

Anticarsia gemmatalis ; Chrysodeixis includens ; manejo da resistência; piramidação de genes; sinergismo; soja transgênica


The objective of this work was to evaluate the susceptibility of Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Erebidae) and Chrysodeixis includens (Lepidoptera: Noctuidae) caterpillars to Cry1 and Vip3A proteins, as well as to determine if there is any interaction between these proteins on the control of the two species. Bioassays with both isolated and combined proteins were carried out, and lethal concentrations LC50 and LC90 were estimated for each condition. Cry1Aa, Cry1Ac, and Vip3Af were the more effective proteins for the control of A. gemmatalis, while Cry1Ac, Vip3Aa, and Vip3Af were more effective for the control of C. includens. Cry1Ac and Cry1Ca proteins caused the highest inhibition to the development of larvae that survived the LC50 dose in both species. Different combinations of Vip3A and Cry1 have synergistic effect in the control of both species, and the combination Vip3Aa + Cry1Ea showed an outstanding control of A. gemmatalis and C. includens. These proteins are promising for building pyramided plants for the simultaneous control of the pests.

Anticarsia gemmatalis ; Chrysodeixis includens ; resistance management; gene pyramiding; synergism; transgenic soybean


Introdução

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva, com atividade inseticida a diversas pragas agrícolas, que pode ser encontrada naturalmente no solo, superfície de plantas, em insetos mortos e em grãos armazenados (Bravo et al., 1998BRAVO, A.; SARABIA, S.; LOPEZ, L.; ONTIVEROS, H.; ABARCA, C.; ORTIZ, A.; ORTIZ, M.; LINA, L.; VILLA-LOBOS, FJ.; GUADALUPE, P.; NUÑEZ-VALDEZ, M.E.; SOBERÓN, M.; QUINTERO, R. Characterization of cry genes in Mexican Bacillus thuringiensis strain collection. Applied and Environmental Microbiology, v.64, p.4965-4972, 1998. ). Em razão de sua atividade entomopatogênica, essa bactéria é amplamente empregada no controle biológico de insetos-praga e pode ser utilizada na forma de bioinseticidas ou em plantas geneticamente modificadas.

Culturas transgênicas que expressam proteínas de B. thuringiensis foram comercializadas pela primeira vez em 1996 (James, 2011JAMES, C. Global status of commercialized biotech/GM crops: 2011. Ithaca: International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications, 2011. (ISAAA Brief, 43).) e são comumente utilizadas para o manejo de insetos-praga em todo o mundo. Essas culturas necessitam de menos aplicações de defensivos químicos e permitem redução dos custos de produção, especificidade contra as pragas-alvo e menor impacto sobre a biodiversidade (James, 2002JAMES, C. Global status of commercialized transgenic crops: 2002. Ithaca: International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications, 2002. 24p. (ISAAA Brief, 27). ). Entretanto, apesar das vantagens, atualmente há grande preocupação com o uso generalizado de culturas Bt, uma vez que elas podem acelerar a seleção de organismos resistentes (Zhang et al., 2013ZHANG, L.; HUANG, F.; LEONARD, B.R.; CHEN, M.; CLARK, T.; ZHU, Y.C.; WANGLIA, D.S.; YANG, F.; NIU, Y. Susceptibility of Cry1Ab maize-resistant and -susceptible strains of sugarcane borer (Lepidoptera: Crambidae) to four individual Cry proteins. Journal of Invertebrate Pathology, v.112, p.267-272, 2013. DOI: 10.1016/j.jip.2012.12.007.
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), quando estratégias de manejo adequadas, como adoção de áreas de refúgio, não são utilizadas. O surgimento da resistência pode estar relacionado à ligação das proteínas inseticidas a receptores no intestino médio das lagartas (Ferré & Van Rie, 2002FERRÉ, J.; VAN RIE, J. Biochemistry and genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis. Annual Review of Entomology, v.47, p.501-533, 2002. DOI: 10.1146/annurev.ento.47.091201.145234.
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). Alternativas para retardar a evolução da resistência têm sido bastante estudadas e misturas de toxinas têm sido consideradas mais eficazes se utilizadas antes da evolução da resistência, mesmo sob pressão de seleção contínua (Xue et al., 2005XUE, J.-L.; CAI, Q.-X.; ZHENG, D.-S.; YUAN, Z.M. The synergistic activity between Cry1Aa and Cry1C from Bacillus thuringiensis against Spodoptera exigua and Helicoverpa armigera. Letters in Applied Microbiology, v.40, p.460-465, 2005. DOI: 10.1111/j.1472-765X.2005.01712.x.
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; Bergamasco et al., 2013BERGAMASCO, V.B.; MENDES, D.R.P.; FERNANDES, O.A.; DESIDÉRIO, J.A.; LEMOS, M.V.F. Bacillus thuringiensis Cry1Ia10 and Vip3Aa protein interactions and their toxicity in Spodoptera spp. (Lepidoptera). Journal of Invertebrate Pathology, v.112, p.152-158, 2013. DOI: 10.1016/j.jip.2012.11.011.
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).

A expressão dos genes cry de B. thuringiensis geralmente ocorre na fase estacionária da célula, com acúmulo do produto na célula-mãe, que é liberada durante a esporulação. Após a ingestão destas células por larvas de insetos suscetíveis e de sua dissolução no lúmen do intestino médio, as proteínas são ativadas e clivadas por proteases, o que leva à produção de fragmentos tóxicos de 60-70 kDa (Bravo et al., 2007BRAVO, A.; GILL, S.S.; SOBERÓN, M. Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their potential for insect control. Toxicon, v.49, p.423-435, 2007. DOI: 10.1016/j.toxicon.2006.11.022.
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), divididos em duas regiões estruturais distintas: a região N-terminal, que contém a toxina ativa; e a região C-terminal.

As proteínas Vip ("vegetative insecticidal proteins") são produzidas e secretadas pelas células bacterianas durante a fase vegetativa e não formam inclusões cristalinas; por esse motivo, e também por não apresentarem homologia de sequência ou estrutural, foram excluídas da nomenclatura das proteínas Cry. As toxinas Vip3 atuam no controle de lepidópteros e, para se tornarem ativas, devem sofrer a clivagem de 199 aminoácidos na região N-terminal (Lee et al., 2003LEE, M.K.; WALTERS, F.S.; HART, H.; PALEKAR, N.; CHEN, J.-S. The mode of action of the Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A differs from that of Cry1Ab delta-endotoxin. Applied and Environmental Microbiology, v.69, p.4648-4657, 2003. DOI: 10.1128/AEM.69.8.4648-4657.2003.
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).

Alguns eventos de plantas piramidadas já estão no mercado, como o algodão com tecnologia WideStrike (Dow Agrosciences), obtido por melhoramento clássico entre eventos que contêm os genes cry1F e cry1Ac (Comissão Técnica Nacional de Biossegurança, 2009COMISSÃO TÉCNICA NACIONAL DE BIOSSEGURANÇA. Parecer técnico nº 1757, de 19 de março de 2009. 2009. Disponível em: <http://www.ctnbio.gov.br/index.php/content/view/12884.html>. Acesso em: 3 abr. 2014.
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), e o milho Bt11XMIR162XGA21 (Syngenta Seeds), que possui os genes cry1Ab, vip3Aa20 e tolerância a herbicida (Comissão Técnica Nacional de Biossegurança, 2010). Recentemente, houve a aprovação da soja transgênica que expressa a proteína Cry1Ac e tem tolerância ao glifosato, resultado de melhoramento clássico dos eventos MON 87701 × MON 89788, cujo cultivo comercial foi realizado no ano agrícola 2013/2014. Este evento é efetivo principalmente para as espécies A. gemmatalis e C. includens (Bernardi et al., 2012BERNARDI, O.; MALVESTITI, G.S.; DOURADO, P.M.; OLIVEIRA, W.S.; MARTINELLI, S.; BERGER, G.U.; HEAD, G.P.; OMOTO, C. Assessment of the high-dose concept and level of control provided by MON 87701 x MON 89788 soybean against Anticarsia gemmatalis and Pseudoplusia includens (Lepidoptera: Noctuidae) in Brazil. Pest Management Science, v.68, p.1083-1091, 2012. DOI: 10.1002/ps.3271.
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).

Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Erebidae) e Chrysodeixis includens Walker (Lepidoptera: Noctuidae) são pragas de importância econômica para a cultura da soja. Atualmente, não há relatos de estudos sobre combinações de toxinas de B. thuringiensis para o controle destas espécies.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a suscetibilidade das lagartas Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Erebidae) e Chrysodeixis includens(Lepidoptera: Noctuidae), às proteínas Cry1 e Vip3A, bem como determinar se há a interação entre essas proteínas no controle das duas espécies.

Material e Métodos

Clones de Escherichia coli XL-1 Blue que continham os genes cry1 de B. thuringiensis foram obtidos junto ao Plant Research International, Wageningen, Netherlands. Estes clones são portadores dos genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ca e cry1Ea, clonados nos respectivos vetores de expressão pPB08, pPBD140, pB03, pBD150 e pBD160. Os clones de E. coli WK6 que continham os genes de B. thuringiensis vip3Aa (National Center for Biotechnology Information, 2013cNATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION. Isp3a protein [Bacillus thuringiensis]: GenBank: CAI43275.1. 2013a. Available at: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/CAI43275>. Accessed on: 28 Nov. 2013.
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), vip3Ae (National Center for Biotechnology Information, 2013b) e vip3Af (National Center for Biotechnology Information, 2013a) provieram da empresa Bayer Crop Science (Ghent, Bélgica). Todos os vetores possuíam genes de resistência ao antibiótico ampicilina.

A produção das proteínas Cry1 foi realizada de acordo com protocolo descrito por Herrero et al. (2004)HERRERO, S.; GONZALEZ-CABRERA, J.; FERRÉ, J.; BAKKER, P.L.; DE MAAGD, R.A. Mutations in the Bacillus thuringiensis Cry1Ca toxin demonstrate the role of domains II and III in specificity towards Spodoptera exigua larvae. Biochemical Journal, v.384, p.507-513, 2004. DOI: 10.1042/BJ20041094.
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. Para isso, os clones foram cultivados durante 60 horas, a 28ºC, com agitação de 200 rpm, em meio TB ("terrific broth") constituído de: 12 g de triptona; 24 g de extrato de levedura; 2,31 g de KH2PO4; 12,54 g de K2HPO4; 4 mL de glicerol; q.s.p 1.000 mL; além de ampicilina (100 µg mL-1). As células cultivadas foram coletadas por centrifugação por 8 min a 5.930 g. O processo de rompimento celular foi realizado em tampão 50 mmol L-1 Tris/HCl pH 8,0, com 5 mmol L-1 EDTA e 100 mmol L-1 NaCl com lisozima (800 μg g-1 de pellet), seguido de lavagens com 20 mmol L-1 Tris/HCl pH7,5, com 1 mol L-1 NaCl e 1% de Triton × 100 e solução salina tamponada com fosfato, 10 mmol L-1Na2HPO4/KH2PO4 pH 7,4, dissolvidos em 0,8% (p/v) NaCl. Ambos os procedimentos de lavagem foram realizados em triplicata. Como etapa final, realizou-se a solubilização das proteínas Cry em tampão 50 mmol L-1 NaHCO3 pH 10,0, com 100 mmol L-1 NaCl e 10 mmol L-1 DTT (adicionado imediatamente antes do uso), e incubação por 3 horas à temperatura ambiente, em agitação horizontal. Essa etapa foi seguida de centrifugação por 15 min, a 39.200 g, a 4ºC. O sobrenadante com a pró-toxina solubilizada foi filtrado em membrana de poliestireno de 0,44 mm.

As proteínas Cry1 foram utilizadas após solubilização dos corpos de inclusão em tampão (50 mmol L-1 NaHCO3 pH 10,0; 100 mmol L-1 NaCl; 10 mmol L-1 DTT) conforme Herrero et al. (2004)HERRERO, S.; GONZALEZ-CABRERA, J.; FERRÉ, J.; BAKKER, P.L.; DE MAAGD, R.A. Mutations in the Bacillus thuringiensis Cry1Ca toxin demonstrate the role of domains II and III in specificity towards Spodoptera exigua larvae. Biochemical Journal, v.384, p.507-513, 2004. DOI: 10.1042/BJ20041094.
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. Para a expressão das proteínas Vip3A, utilizou-se a metodologia descrita por Chakroun et al. (2012)CHAKROUN, M.; BEL, Y.; CACCIA, S.; ABDELKEFI-MESRATI, L.; ESCRICHE, B. Susceptibility of Spodoptera frugiperda and S. exigua to Bacillus thuringiensis Vip3Aa insecticidal protein. Journal of Invertebrate Pathology, v.110, p.334-339, 2012. DOI: 10.1016/j.jip.2012.03.021.
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, que altera a concentração de isopropil-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) para 1 mmol L-1 na indução da expressão. As proteínas foram recuperadas por centrifugação, em tampão fosfato 20 mmol L-1 (NaH2PO4.H2O e Na2HPO4.2H2O) pH 7,4, com 0,5 mol L-1NaCl.

A expressão de proteínas foi verificada por eletroforese, em gel desnaturante de poliacrilamida a 12%, que continha dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), conforme Laemmli (1970)LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, v.227, p.680-685, 1970. DOI: 10.1038/227680a0.
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, com uso de Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Fermentas, Vilnius, Lituânia) como marcador de massa molecular, tendo-se seguido as recomendações do fabricante.

A concentração das pró-toxinas Cry1 e Vip3A foi estimada por densitometria em gel de SDS-PAGE, por meio do programa BioNumerics (Applied-Maths), a diferentes concentrações (0,05 à 0,8 mg mL-1) da proteína soro albumina bovina (BSA), como referência-padrão de massa molecular. Os lisados proteicos solubilizados de cada pró-toxina foram filtrados em 0,22 µmol L-1 e armazenados a -20ºC.

Para a realização dos bioensaios, utilizaram-se os ovos de A. gemmatalis e C. includens, fornecidos pelo Laboratório de Biologia de Insetos (Esalq/Usp), Piracicaba, SP. Utilizaram-se placas de poliestireno de 128 orifícios (2 cm2) (Cell Wells, Corning Glass Works, Corning, NY, USA) e dieta artificial adaptada conforme Monnerat et al. (2007)MONNERAT, R.G.; BATISTA, A.C.; MEDEIROS, P.T. de; MARTINS, E.S.; MELATTI, V.M.; PRAÇA, L.B.; DUMAS, V.F.; MORINAGA, C.; DEMO, C.; GOMES, A.C.M.; FALCÃO, R.; SIQUEIRA, C.B.; SILVA-WERNECK, J.O.; BERRY, C. Screening of Brazilian Bacillus thuringiensis isolates active against Spodoptera frugiperda, Plutella xylostella and Anticarsia gemmatalis. Biological Control, v.41, p.291-295, 2007. DOI: 10.1016/j.biocontrol.2006.11.008.
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. Diferentes concentrações de pró-toxinas Cry1 (0,1 a 300,0 mg mL-1) e Vip3A (0,5 a 600,0 mg mL-1) foram aplicadas à superfície da dieta, em volume de 50 μL. Em seguida, larvas neonatas foram transferidas individualmente para os poços. Dezesseis larvas foram testadas para cada concentração, tendo-se realizado o experimento em triplicata (total de 48 larvas por concentração de pró-toxina). Como controle dos ensaios realizados, utilizou-se água destilada, tampão de solubilização das proteínas, lisado proteico de E. coli XL-1 Blue e E. coli WK6 sem o vetor de expressão. Estes componentes não causam mortalidade aos insetos. As placas foram acondicionadas a 25±2ºC, com umidade relativa de 70±10% e fotoperíodo de 14:10 horas (luz:escuro). A avaliação foi realizada após sete dias de alimentação continuada.

As CL50 e CL90 foram estimadas pela análise de Probit (Finney, 1971FINNEY, D.J. Probit analysis. Cambridge: Cambridge University, 1971. 333p.), com uso do programa Polo-Plus (LeOra Software, Berkeley, CA, USA), em que a CL50 e CL90 correspondem à concentração letal de proteínas responsável pela mortalidade de 50 e 90% da população, respectivamente. Os intervalos de confiança (95%) para CL50 e CL90 foram calculados, e a não sobreposição deste parâmetro foi utilizada para detectar diferenças significativas entre as proteínas. Avaliou-se a inibição do desenvolvimento (ID) das larvas sobreviventes à CL50. Estas larvas foram pesadas em balança analítica com quatro casas decimais e os valores obtidos foram aplicados à fórmula ID = 100 × (média do peso das larvas da testemunha - média do peso das larvas do tratamento)/(média do peso das larvas da testemunha), proposta de Huang et al. (2006)HUANG, F.; LEONARD, B.R.; GABLE, R.H. Comparative susceptibility of European corn borer, Southwestern corn borer, and sugarcane borer (Lepidoptera: Crambidae) to Cry1Ab protein in a commercial Bacillus thuringiensis corn hybrid. Journal of Economic Entomology, v.99, p.194-202, 2006. DOI: 10.1603/0022-0493(2006)099[0194:CSOECB]2.0.CO;2.
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. A análise de interação das pró-toxinas foi realizada de acordo com a metodologia proposta por Tabashnik (1992)TABASHNIK, B.E. Evaluation of synergism among Bacillus thuringiensis toxins. Applied and Environmental Microbiology, v.58, p.3343-3346, 1992. , tendo-se utilizado como referência inicial a CL50 estimada previamente para cada uma delas. A mortalidade esperada foi estimada com a fórmula proposta pelo autor como, CL50 (m) = 1 / [(pa / CL50 (a)) + (pb / CL50 (b))], em que: CL50 (m) corresponde à CL50 esperada da mistura de proteínas; CL50 (a) e CL50(b) são as respectivas concentrações letais para as pró-toxinas individuais; p significa a proporção de a (pa) e b (pb) na mistura. A mesma fórmula foi utilizada para determinar a interação das pró-toxinas com os dados obtidos para a CL90 e, desta forma, avaliar o fator de sinergismo entre as pró-toxinas testadas para o controle das espécies.

O fator de sinergismo (FS) serve para indicar quando ocorre a interação sinérgica das pró-toxinas em combinação e é calculado como a razão entre a CL esperada e a CL observada; assim: FS maior do que 1 significa a ocorrência de sinergismo entre as pró-toxinas; FS menor do que 1 representa a interação antagônica; e FS igual a 1 é indicativo de toxicidade aditiva (Wu et al., 1994WU, D.; JOHNSON, J.J.; FEDERECI, B.A. Synergism of mosquitocidal toxicity between CytA and CryIVD proteins using inclusions produced from cloned genes of Bacillus thuringiensis. Molecular Microbiology, v.13, p.965-972, 1994. DOI: 10.1111/j.1365-2958.1994.tb00488.x.
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).

Resultados e Discussão

A expressão das proteínas Cry1 e Vip3A, analisada por SDS-PAGE, foi confirmada pela visualização de bandas com massa molecular de aproximadamente 135 kDa, para as pró-toxinas Cry1, e 88 kDa para as Vip3A (Figura 1). A massa molecular das pró-toxinas Cry está compreendida entre 130 e 135 kDa (Lightwood et al., 2000LIGHTWOOD, D.J.; ELLAR, D.J.; JARRETT, P. Role of proteolysis in determining potency of Bacillus thuringiensis Cry1Ac delta-endotoxin. Applied and Environmental Microbiology, v.66, p.5174-5181, 2000. DOI: 10.1128/AEM.66.12.5174-5181.2000.
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), enquanto a das pró-toxinas Vip3A é de 88,5 kDa (Loguercio et al., 2002LOGUERCIO, L.L.; BARRETO M.L.; ROCHA T.L.; SANTOS C.G.; TEIXEIRA F.F.; PAIVA E. Combined analysis of supernatant-based feeding bioassays and PCR as a first-tier screening strategy for Vip-derived activities in Bacillus thuringiensis strains effective against tropical fall armyworm. Journal of Applied Microbiology, v.93, p.269-277, 2002. DOI: 10.1046/j.1365-2672.2002.01694.x.
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).

Figura 1
Gel SDS-PAGE do lisado bacteriano de Escherichia coli, com os genes vip3Aa, vip3Ae, vip3Af, cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ca e cry1Ea. MM, marcador de massa molecular (kDa).

Em relação à susceptibilidade de A. gemmatalis, Cry1Ac destacou-se das demais pró-toxinas Cry1 e foi, aproximadamente, duas vezes mais tóxica que Cry1Aa, no que se refere aos valores obtidos para CL50 (Tabela 1). Este resultado não foi observado para os valores de CL90, que não diferiram significativamente. Este resultado indica que, em concentrações mais elevadas, ambas as proteínas mostraram-se igualmente efetivas no controle da espécie (Tabela 1). O presente estudo confirma a eficiência da proteína que está presente na soja transgênica, liberada para comercialização desde 2010. De modo semelhante, em estudo conduzido por Fiuza et al. (2013)FIUZA, L.M.; KNAAK, N.; SILVA, R.F.P. da; HENRIQUE, J.A.P. Receptors and lethal effect of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins to the Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera, Noctuidae). ISRN Microbiology, v.2013, 7 p., 2013. DOI: 10.1155/2013/940284.
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para avaliar a suscetibilidade de A. gemmatalis a diferentes toxinas Cry, tanto a proteína Cry1Ac quanto a Cry1Aa foram as mais efetivas no controle da praga, enquanto Cry1Ea foi a menos eficiente.

Tabela 1
Suscetibilidade e inibição de desenvolvimento (ID) de larvas neonatas de Anticarsia gemmatalis às proteínas Cry1 e Vip3 de Bacillus thuringiensis.

Não houve diferença entre as pró-toxinas Cry1Ab, Cry1Ca e Cry1Ea quanto ao controle de A. gemmatalis, pois houve sobreposição dos valores apresentados nos intervalos de confiança das respectivas CL50 e CL90 obtidas (Tabela 1). Essas proteínas mostraram-se menos efetivas do que Cry1Ac e Cry1Aa no controle da lagarta, nos valores obtidos para CL90. Fiuza et al. (2013)FIUZA, L.M.; KNAAK, N.; SILVA, R.F.P. da; HENRIQUE, J.A.P. Receptors and lethal effect of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins to the Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera, Noctuidae). ISRN Microbiology, v.2013, 7 p., 2013. DOI: 10.1155/2013/940284.
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também relataram menor efetividade de Cry1Ea em ensaios de toxicidade com A. gemmatalis. Com base nos valores de CL90, Vip3Af foi a mais eficiente no controle da espécie, tendo sido de sete a oito vezes mais tóxica do que Vip3Aa e Vip3Ae, respectivamente (Tabela 1). Figueiredo et al. (2013)FIGUEIREDO, C.S.; MARUCCI, S.C.; TEZZA, R.I.D.; LEMOS, M.V.F.; DESIDÉRIO, J.A. Caracterização do gene vip3A e toxicidade da proteína Vip3Aa50 à lagarta-do-cartucho e à lagarta-da-soja. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.48, p.1220-1227, 2013. DOI: 10.1590/S0100-204X2013000900005.
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estudaram a suscetibilidade de A. gemmatalis à proteína Vip3Aa50 e relataram uma CL50 3,8 vezes inferior à encontrada no presente estudo para Vip3Aa.

Nos ensaios realizados com C. includens, observou-se que Cry1Ac, Cry1Ca e Cry1Ea apresentaram maior toxicidade entre as pró-toxinas Cry1 testadas (Tabela 2). Em relação à Cry1Aa, as proteínas Cry1Ac, Cry1Ca e Cry1Ea foram de 1,5 a 3,5 vezes mais tóxicas, e Cry1Ab foi de 2 a 4,5 vezes mais tóxica.

Tabela 2
Suscetibilidade e inibição de desenvolvimento (ID) de larvas neonatas de Chrysodeixis includens às proteínas Cry1 e Vip3 de Bacillus thuringiensis.

Embora tenha-se destacado das demais proteínas, Cry1Ac foi mais efetiva para A. gemmatalis do que para C. includens. Estudos realizados com uma linhagem transgênica de soja, que expressava altos níveis de proteína a partir do gene cry1Ac, relataram mortalidade total em lagartas de A. gemmatalis e redução significativa da população de C. includens, em ensaios de suscetibilidade e de alimentação realizados em laboratório (Stewart Junior et al., 1996STEWART JUNIOR, C.N.; ADANG, M.J.; ALL, J.N.; BOERMA, R.; CARDINEAU, G.; TUCKER, D.; PARROT, W.A. Genetic transformation, recovery, and characterization for a fertile soybean transgenic for a synthetic Bacillus thuringiensis cryAc gene. Plant Physiology, v.112, p.121-129, 1996. DOI: 10.1104/pp.112.1.121.
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) e no campo (Walker et al., 2000WALKER, D.R.; ALL, J.N.; MCPHERSON, R.M.; BOERMA, H.R.; PARROTT, W.A. Field evaluation of soybean engineered with a synthetic cry1Ac transgene for resistance to corn earworm, soybean looper, velvetbean caterpillar (Lepidoptera, Noctuidae), and lesser cornstalk borer (Lepidoptera, Pyralidae). Journal of Economic Entomology, v.93, p.613-622, 2000. DOI: 10.1603/0022-0493-93.3.613.
https://doi.org/10.1603/0022-0493-93.3.6...
).

Com base nos valores de CL90, as pró-toxinas Cry1Ac, Cry1Ca e Cry1Ea apresentaram maior toxicidade, e seus intervalos de confiança se sobrepuseram. Walker et al. (2000) relataram que uma linhagem transgênica de soja com altos níveis de proteína a partir do gene sintético cry1Ac ocasionou mortalidade total em larvas de A. gemmatalis e redução significativa da população de C. includens, em ensaios de suscetibilidade e de alimentação realizados em laboratório e no campo.

A pró-toxina Vip3Af foi a mais eficiente das Vip3A no controle de C. includens, quando foram considerados os valores de CL50 (Tabela 2). Esta eficiência foi aproximadamente 25 e 58 vezes maior do que as apresentadas por Vip3Aa e Vip3Ae, respectivamente. Todavia, de acordo com os valores apresentados na CL90, a toxicidade de Vip3Aa e Vip3Af foi semelhante, pois houve sobreposição dos intervalos de confiança. Yu et al. (1997)YU, C.G.; MULLINS, M.A.; WARREN, G.W.; KOZIEL, M.G.; ESTRUCH, J.J. The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut ephitelium cells of susceptible insects. Applied and Environmental Microbiology, v.63, p.532-536, 1997. relataram que algumas proteínas Vip3A podem atuar com mais eficiência no controle de pragas cujas proteínas Cry1 não apresentam o melhor controle.

Não houve mortalidade nos insetos mantidos nos controles, que consistiram de água destilada, tampão de solubilização das proteínas ou lisado proteico de E. coli XL-1 Blue e E. coli WK6 sem o vetor de expressão.

As proteínas Cry1Ac e Cry1Ca provocaram ID próximos de 100% para as duas espécies, quando alimentadas com dietas com CL50 (Tabelas 1 e 2). Em C. includens, essa inibição também foi verificada com Cry1Aa. Nos ensaios com A. gemmatalis, Cry1Ac foi 20 vezes mais efetiva que Cry1Ca; porém, quando o desenvolvimento das larvas foi avaliado, verificou-se que Cry1Ca reduziu o desenvolvimento das larvas tanto quanto Cry1Ac.

A inibição do desenvolvimento das larvas que sobreviveram à CL50 resultou no aumento do período de desenvolvimento, o que pode levar à redução da população de larvas, em decorrência da maior exposição a inimigos naturais (Ashfaq et al., 2011ASHFAQ, M.; YOUNG, S.Y.; MCNEW, R.W. Larval mortality and development of Pseudoplusia includens (Lepidoptera: Noctuidae) reared on a transgenic Bacillus thuringiensis-cotton cultivar expressing Cry1Ac insecticidal protein. Journal of Economic Entomology, v.94, p.1053-1058, 2011. DOI: 10.1603/0022-0493-94.5.1053.
https://doi.org/10.1603/0022-0493-94.5.1...
). As pró-toxinas Vip3A foram eficientes para as duas espécies-alvo do presente estudo, com a maior inibição do desenvolvimento (ID=96%) obtida com Vip3Aa em A. gemmatalis, e a menor (ID=70%), com Vip3Af em C. includens (Tabelas 1 e 2).

Com base na interação de pró-toxinas Vip3A e Cry1, deduz-se que, das 15 combinações de proteínas avaliadas para cada espécie, somente quatro mostraram-se promissoras para uso no controle biológico de A. gemmatalis, e três para o controle de C. includens. O desenvolvimento de resistência de insetos-praga a toxinas Cry foi relatado em relação à proteína Cry1Ab expressa em milho, na África do Sul (Van Rensburg, 2007VAN RENSBURG, J.B.J. First report of field resistance by the stem borer Busseola fusca (Fuller) to Bt transgenic maize. South African Journal of Plant and Soil, v.24, p.147-151, 2007. DOI: 10.1080/02571862.2007.10634798.
https://doi.org/10.1080/02571862.2007.10...
), Cry1F expressa em milho, em Porto Rico (Storer et al., 2010STORER, N.P.; BABCOCK, J.M.; SCHLENZ, M.; MEADE, T.; THOMPSON, G.D.; BING, J.W.; HUCKABA, R.M. Discovery and characterization of field resistance to Bt Maize: Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in Puerto Rico. Journal of Economic Entomology, v.103, p.1031-1038, 2010. DOI: 10.1603/EC10040.
https://doi.org/10.1603/EC10040...
), e Cry1Ac em algodão, na Índia (Dhurua & Gujar, 2011DHURUA, S.; GUJAR, G.T. Field-evolved resistance to Bt toxin Cry1Ac in the pink bollworm, Pectinophora gossypiela (Saunders) (Lepidoptera: Gelechiidae), from India. Pest Management Science, v.67, p.803-898, 2011. DOI: 10.1002/ps.2127.
https://doi.org/10.1002/ps.2127...
). Assim, a combinação de proteínas inseticidas é uma alternativa eficiente para o manejo de resistência, visto que combinações efetivas poderiam ser usadas no desenvolvimento de variedades de plantas transgênicas, pois as proteínas Vip3 não têm semelhança com as Cry e, portanto, reconhecem diferentes receptores no intestino médio de larvas suscetíveis (Abdelkefi-Mesrati et al., 2011ABDELKEFI-MESRATI, L.; BOUKEDI, H.; DAMMAK-KARRAY, M.; SELLAMI-BOUDAWARA, T.; JAOUA, S.; TOUNSI, S. Study of the Bacillus thuringiensis Vip3Aa16 histopathological effects and determination of its putative binding proteins in the midgut of Spodoptera littoralis. Journal of Invertebrate Pathology, v.106, p.250-254, 2011. DOI: 10.1016/j.jip.2010.10.002.
https://doi.org/10.1016/j.jip.2010.10.00...
). Assim, algumas combinações destas diferentes proteínas podem atuar em sinergia para o controle de insetos-praga.

Para A. gemmatalis, a combinação Vip3Aa+Cry1Ab apresentou sinergia e foi cerca de quatro a sete vezes mais eficiente do que as combinações Vip3Aa+Cry1Ea e Vip3Ae+Cry1Ab (Tabela 3), que também se apresentaram sinérgicas com os valores de CL90.

Tabela 3
Avaliação de sinergismo, quanto à CL50 e à CL90, de combinações de pró-toxinas Vip3a e Cry1 para Anticarsia gemmatalis.

O uso simultâneo de Vip3Aa+Cry1Ea apresentou sinergia no controle de C. includens, tendo sido duas vezes mais efetiva do que as combinações Vip3Ae+Cry1Aa e Vip3Ae+Cry1Ea. A combinação Vip3Aa+Cry1Ea foi três vezes mais efetiva do que as combinações Vip3Ae+Cry1Aa e Vip3Ae+Cry1Ea (Tabela 4).

Tabela 4
Avaliação de sinergismo, quanto à CL50 e à CL90, de combinações de pró-toxinas Vip3a e Cry1 para Chrysodeixis includens.

As demais combinações, avaliadas para A. gemmatalis e C. includens, apresentaram valores de fator de sinergismo inferior ao requerido para sugerir benefício no controle destas pragas (FS>1). Essas combinações indicaram interações antagônicas, e são necessários estudos para verificar qual o mecanismo de ação delas em cada espécie.

Existem relatos de que proteínas Cry podem agir sinergicamente e aumentar sua toxicidade contra insetos suscetíveis (Wirth et al., 2001WIRTH, M.C.; DELÉCLUSE, A.; WALTON, W.E. Cyt1Ab and CyteBa1 from Bacillus thuringiensis subsp. medellin and B. thuringiensis subsp. israelensis synergize Bacillus sphaericus against Aedes aegypti and resistant Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) . Applied and Environmental Microbiology, v.67, p.3280-3284, 2001. DOI: 10.1128/AEM.67.7.3280-3284.2001.
https://doi.org/10.1128/AEM.67.7.3280-32...
; Xue et al., 2005XUE, J.-L.; CAI, Q.-X.; ZHENG, D.-S.; YUAN, Z.M. The synergistic activity between Cry1Aa and Cry1C from Bacillus thuringiensis against Spodoptera exigua and Helicoverpa armigera. Letters in Applied Microbiology, v.40, p.460-465, 2005. DOI: 10.1111/j.1472-765X.2005.01712.x.
https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2005...
). Esses estudos ajudam na busca de genes cry mais apropriados para introdução no genoma de plantas cultivadas.

A eficácia de uma combinação não é estimada com base na eficácia dos componentes individuais, mas com base no estudo de sinergismo (Bliss, 1939BLISS, C.I. The toxicity of poisons applied jointly. Annals of Applied Biology, v.26, p.585-615, 1939. DOI: 10.1111/j.1744-7348.1939.tb06990.x.
https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.1939...
). Plantas piramidadas oferecem alternativa viável para retardar a resistência em populações de insetos-praga. A principal vantagem deste método é que a resistência causada por uma toxina pode não acarretar resistência cruzada à outra toxina (Alyokhin, 2011ALYOKHIN, A. Scant evidence supports EPA's pyramided Bt corn refuge size of 5%. Nature Biotechnology, v.29, p.577-578, 2011. DOI: 10.1038/nbt.1911.
https://doi.org/10.1038/nbt.1911...
), uma vez que os receptores são diferentes. Segundo Abdelkefi-Mesrati et al. (2011)ABDELKEFI-MESRATI, L.; BOUKEDI, H.; DAMMAK-KARRAY, M.; SELLAMI-BOUDAWARA, T.; JAOUA, S.; TOUNSI, S. Study of the Bacillus thuringiensis Vip3Aa16 histopathological effects and determination of its putative binding proteins in the midgut of Spodoptera littoralis. Journal of Invertebrate Pathology, v.106, p.250-254, 2011. DOI: 10.1016/j.jip.2010.10.002.
https://doi.org/10.1016/j.jip.2010.10.00...
, as diferenças entre toxinas de B. thuringiensis são muito importantes, e o uso de toxinas Vip3 juntamente com as Cry seria indicado para inibir a resistência em insetos-pragas.

Conclusões

  1. Entre as pró-toxinas avaliadas, Cry1Ac e Vip3Af são as mais efetivas para o controle de Anticarsia gemmatalis e Chrysodeixis includens, como toxinas isoladas.

  2. A maior inibição de desenvolvimento é proporcionada por Cry1Ac e Cry1Ca.

  3. A combinação Vip3Aa+Cry1Ea destaca-se e é promissora para a construção de plantas piramidadas, com vistas ao controle de A. gemmatalis e C. includens.

Agradecimentos

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes), pelo apoio financeiro; ao Prof. Dr. José Roberto Postali Parra e à técnica Neide Graciano Zério, do Laboratório de Biologia dos Insetos, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (Esalq), Universidade de São Paulo (USP), pelo fornecimento de ovos das espécies avaliadas neste estudo; ao Prof. Dr. Ruud de Maagd, por ceder os clones das proteínas Cry1; e à empresa Bayer CropScience, por ceder os clones das proteínas Vip3A.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    Fev 2014

Histórico

  • Recebido
    28 Nov 2013
  • Aceito
    31 Jan 2014
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