Uso da ciclofosfamida em modelo de imunodepressão experimental em ovinos

Ovine experimental immunosuppression using cyclophosphamide

Uso da ciclofosfamida em modelo de imunodepressão experimental em ovinos

Ovine experimental immunosuppression using cyclophosphamide

Maurício Garcia; Silvio P. Sertório; Glaucie J. Alves; Sabrina C. Chate; Roberta Carneiro; Maria A. Lallo

Curso de Medicina Veterinária, Universidade Paulista, Rua Enjolras Vampré 146, São Paulo, SP 04290-070. E-mail: [e-mail]

RESUMO

A ciclofosfamida (CY) foi usada para avaliar o efeito no sistema imune de ovinos. Carneiros adultos castrados foram divididos em 3 grupos, com 6 animais cada. Os Grupos I (dia 0) e II (dia 1) foram tratados com a CY (40 mg/kg, dose única, IV), e o Grupo III não foi tratado, permanecendo como controle. Todos os grupos foram imunizados no dia 0 com a vacina B19 contra a brucelose. No dia 6, todos animais foram sangrados e foi realizado o teste de soro-aglutinação para detecção de anticorpos anti-brucella. Foram também realizadas, diariamente durante 7 dias, contagens de linfócitos sangüíneos e dosagens de gamaglobulinas séricas por eletroforese. Os resultados encontrados mostraram uma diminuição estatística da resposta imune. Foram encontrados, nos Grupos I e II, baixos títulos de anticorpos anti-brucella, além de linfopenia e hipogamaglo-bulinemia. Uma alta mortalidade (40%) foi encontrada nos animais tratados.

Termos de indexação: Imunodepressão, ciclofosfamida, imunologia, ovinos.

ABSTRACT

Cyclophosphamide (CY) was used to evaluate the effect on the immune system of sheep. Castred adult rams were divided into 3 groups, with 6 animals each one. Group I (day 0) and Group II (day 1) were treated with CY (40 mg/kg, single dose, IV), and Group III was not treated and remained as control. All groups were immunized on day 0 with B19 brucellosis vaccine. On day 6, all animals were bled and serum agglutination test for brucellosis antibodies detection was performed. During 7 days blood lymphocyte counts and electrophoresis gammaglobulin dosage were daily performed. The results showed statistical decrease of immune response. Low serum titers of brucellosis antibodies were found in Groups I and II, and lymphopenia and hypogammaglobulinemia were also found in these groups. A high mortality rate (40%) occurred in the treated animals.

Index Terms: Immunosupression, cyclophosfamide, immunology, sheep.

INTRODUÇÃO

As mudanças recentes na pecuária brasileira e mundial apontam para um novo paradigma de criação, em que o uso de defensivos animais é limitado ao mínimo indispensável, senão completamente abolido, no sentido de serem produzidos alimentos, tanto carne quanto leite, isentos de quaisquer resíduos químicos. A palavra de ordem hoje é a prevenção e manutenção de animais sadios para que possam utilizar as suas próprias defesas para o combate das diversas enfermidades que são comuns em rebanhos submetidos a manejos intensivos.

O estudo do sistema imune dos ruminantes desempenha, assim, um papel chave neste cenário. Dentro deste contexto, os modelos experimentais de imunodepressão apresentam-se como uma valiosa ferramenta para avaliar o comportamento do sistema imune. O estabelecimento de tais modelos, bem documentados e com boa reprodutibilidade, permite a realização de inúmeros experimentos, tais como a avaliação do efeito de imuno-moduladores e o desenvolvimento de novas técnicas de mensuração da resposta imune.

Diversas drogas têm sido empregadas em modelos de imunodepressão em várias espécies, como a dexametasona, a ciclosporina, a ciclofosfamida e o metotrexato. Todavia, o efeito destas drogas não é o mesmo em todas as espécies. O metotrexato, por exemplo, é capaz de inibir a resposta imune em camundongos tratados com 2,5 mg/kg em dose única (Romanycheva et al. 1978). Entretanto, Greenwood & Keny (1978) não conseguiram provocar alterações hematológicas em ovinos tratados durante 3 dias com 5 mg/kg de metotrexato.

Em camundongos, Doherty (1981) mostrou que a ciclofos-famida inibe a produção de anticorpos, mas não conseguiu demonstrar o efeito da droga na resposta celular cutânea. Já Tarayre et al. (1990) encontraram leucopenia em camundongos tratados com essa droga.

Outro exemplo desta diversidade de efeito é a dexametasona, um potente glicocorticóide usado em diversos modelos de imunodepressão. Tal efeito foi bem documentado em várias espécies, como bovinos (Roth & Kaerbele 1985, Pruett et al. 1987, Doherty et al. 1995), ratos (Wira et al. 1990, Bakker et al. 1997) e até galinhas (Isobe & Lillehoj 1993). Todavia, Saulnier et al. (1991) falharam ao tentar demonstrar o efeito imunodepressor da dexametasona em suínos e Minton & Blecha (1991) e Garcia et al. (1999) também não conseguiram encontrar tal efeito em ovinos.

Esses resultados ressaltam a necessidade de serem desenvolvidos modelos próprios para cada espécie, já que as conclusões obtidas em uma espécie não podem necessariamente ser extrapolada para outra.

A ciclofosfamida é uma mostarda nitrogenada que tem sido usada no tratamento de diversos tipos de câncer. A droga é um potente imunodepressor, atuando em células com alta atividade mitótica, inibindo tanto a resposta imune humoral quanto celular (Bach & Strom 1986).

Um dos efeitos colaterais da ciclofosfamida, a queda de cabelos, chamou a atenção de alguns pesquisadores para a possibilidade do uso da droga para facilitar a tosquia em ovinos. Logo, surgiram várias publicações sobre a chamada "tosquia química" com a ciclofosfamida, como citado em Homan et al. (1969) e Dolnick et al. (1969). Nestes animais, a lã pode ser completamente removida com a mão ao redor do 10^o dia após a aplicação da droga.

O uso da ciclofosfamida em ovinos levou pesquisadores como Bakke et al. (1972) e Schaumloffel et al. (1973) a estudar o seu metabolismo nesta espécie. Além destes pesquisadores, muitos outros se dedicaram ao tema e vários aspectos foram descritos, como o efeito no bulbo folicular da lã, na atividade testicular, na gestação, na atividade da acetilcolinesterase, no crescimento da lã e nas infecções micóticas (Dolnick et al. 1970, McIntosh et al. 1971, Jackson et al. 1975).

Apesar desta grande variedade de trabalhos, são poucos os estudos específicos sobre o efeito da ciclofosfamida no sistema imune de ovinos. Prasad et al. (1986) estudaram o efeito da droga na resposta à vacinação contra o ectima contagioso. Bogda-nov & Kusnedelcheva (1977) encontraram hipogamaglo-bulinemia em ovelhas adultas tratadas com ciclofosfamida. Jun & Johnson (1979) relataram o efeito imunosupressor da droga em ovinos com carcinoma induzido experimentalmente. Yegana et al. (1983) não conseguiram evidenciar significativas alterações leucocitária ou na fração de gamaglobulina após a aplicação da ciclofosfamida em ovinos.

Diversos protocolos para o uso da ciclofosfamida em ovinos têm sido propostos, com diferentes propósitos, com doses variando de 10 a 50 mg/kg, tanto via oral quanto intravenosa (Dolnick et al. 1969, McIntosh et al. 1971, Bakke et al. 1972, Jackson et al. 1975, Bogdanov & Kusnedelcheva 1977, Gordon 1982, Yegana et al. 1983, Prasad et al. 1986).

O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da ciclofosfamida em um modelo de imunodepressão em ovinos, através da titulação de anticorpos anti-brucella, pós-vacinais, e também pela contagem de linfócitos sangüíneos e pela dosagem de gamaglobulinas séricas.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 18 ovinos sem raça definida, machos adultos e castrados, com pesos ao redor de 35 kg. Os animais foram mantidos em baias com cama de serragem e alimentados com feno de alfafa.

Foram constituídos 3 grupos experimentais, com 6 animais cada grupo. Os animais dos Grupos I e II receberam 40 mg/kg de ciclofosfamida (Genuxal®, Asta Médica) por via intravenosa e os animais do Grupo III permaneceram como controle.

Pretendeu-se avaliar a capacidade dos animais em produzir anticorpos específicos após a aplicação de determinado antígeno. Para tanto, foi utilizada a vacina contra a brucelose bovina como antígeno. Assim, todos os animais foram imunizados com 2 ml de vacina contra a brucelose, amostra B19 (Aborvac®, Fort Dodge), por via subcutânea. Seis dias após a vacinação, foi feita a titulação de anticorpos anti-brucella, através da soro-aglutinação rápida em placa. A técnica empregada é uma variante da técnica tradicional descrita por Huddleson & Abel em 1928 e foi padronizada por Garcia et al. (2000). O soro foi previamente diluído com solução salina (0,9% NaCl), de acordo com as seguintes concentrações: 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 e 1:100. De cada diluição, 100µl foram misturados com 50µl de um antígeno comercial para diagnóstico da brucelose bovina (Instituto Butantan) sobre uma placa de vidro. A mistura foi suavemente homogeneizada e, após 8 minutos, foi avaliada a aglutinação. O título foi o correspondente à maior diluição que apresentou reação com aglutinação positiva.

Para se avaliar o melhor momento para a aplicação da ciclofos-famida, com relação ao momento da imunização anti-bruclla, os animais do grupo I foram imunizados no mesmo dia em que foram tratados com a ciclofosfamida e os animais do grupo II foram imunizados 24 horas após.

Como elementos adicionais para a avaliação do sistema imune, foi feita a contagem de linfócitos sangüíneos em câmara hemati-métrica e extensões sangüíneas (Hewitt 1984) e a dosagem de gama-globulinas séricas, por eletroforese (Barta & Pourciau 1984). Tais avaliações foram feitas diariamente, durante uma semana após a aplicação da ciclofosfamida.

Os dados foram analisados estatisticamente por análise de variância (Zar 1996), para um valor de p=5%. Foi empregada planilha eletrônica comercial (Excel 97®, Microsoft) de acordo com as recomendações de Dretzke & Heilman (1998).

RESULTADOS

Os resultados da titulação de anticorpos vacinais anti-brucella mostraram haver uma diminuição estatisticamente signi-ficante nos animais dos grupos I (média = 1,4) e II

(média = 11,5) , com relação ao grupo controle (média = 37,5). Notou-se, ainda, que a média do grupo I foi menor que a encontrada no grupo II, mostrando que a aplicação simultânea da ciclofosfamida no momento da imunização provoca uma imunodepressão mais intensa do que aquela obtida com a aplicação da ciclofosfamida um dia antes da imunização (Quadro 1, Fig. 1).

Nos animais tratados com ciclofosfamida, encontrou-se uma intensa linfopenia (Quadro 2, Fig. 2). A linfopenia já pode ser detectada 24 horas após a aplicação da droga, atingindo seu patamar mais baixo ao redor do 4^o e 5^o dia, iniciando, então, uma lenta recuperação.

Com relação aos valores da gamaglobulina, os resultados foram mais discretos, mas ainda estatisticamente significantes. Conforme exposto no Quadro 3 e na Fig. 3, notou-se uma hipogamaglobulinemia nos animais dos Grupos I e II. A hipogamaglobulinemia torna-se evidente ao redor do 2º dia após a aplicação da droga, atingindo seu patamar mais baixo ao redor do 4º dia (Quadro 3, Fig. 3).

Os animais tratados com ciclofosfamida apresentaram queda de lã que se iniciou ao redor do 3º dia após a aplicação da droga e, ao redor do 10º dia, já podia ser encontrada a queda total da lã (Fig. 4). Dos 12 animais inoculados, cinco morreram, perfazendo uma mortalidade de 40%. Das cinco mortes, três ocorreram na primeira semana após a aplicação da droga e duas mais tardiamente. Os animais apresentaram lesões degenerativas no fígado e rim.

DISCUSSÃO

Os experimentos com imunologia aplicada à clínica dependem substancialmente do desenvolvimento de modelos de boa reprodutibilidade. O que parece simples à primeira vista, muitas vezes se revela complexo no momento da execução. Por outro lado, modelos considerados bons para uma determinada espécie nem sempre se aplicam a outra. Em experimento anterior, Garcia et al. (1999) não conseguiram provocar imunodepressão em ovinos com a dexametasona, resultado semelhante ao encontrado por Minton & Blecha (1991), apesar de diversos autores terem obtido sucesso em provocar a imunodepressão com a mesma droga em outras espécies (Roth & Kaerbele 1985, Pruett et al. 1987, Wira et al. 1990, Isobe & Lillehoj 1993, Doherty et al. 1995, Bakker et al. 1997). Assim, a principal motivação deste experimento foi a de avaliar o efeito de outra droga, a ciclofosfamida, em modelo de imunodepressão em ovinos.

Os resultados encontrados mostraram claramente o efeito imunodepressor da ciclofosfamida. Os animais do grupo controle apresentaram aglutinação de seu soro frente ao antígeno brucélico mesmo quando seu soro era previamente diluído, em alguns casos, até 60 vezes. Já alguns animais inoculados não apresentavam tal aglutinação, mesmo com o soro puro, sem diluição. Resultado semelhante foi encontrado por Prasad et al. (1986), que encontraram forte imunodepressão em animais imunizados contra o ectima contagioso, após serem tratados com a ciclofosfamida.

A linfopenia e a hipogamaglobulinemia encontrada nos animais inoculados reforçaram também esse efeito imunodepressor. Cabe ressaltar, porém, que a linfopenia foi um resultado mais expressivo que a hipogamaglobulinemia. Esse achado semelhante ao relatado por Silva (2000), parece sinalizar que a dosagem de gamaglobulinas não é um indicador tão seguro de imunode-pressão; ao menos não parece ser muito sensível.

A escolha da ciclofosfamida baseou-se na indicação pré-existente na literatura (Bogdanov & Kusnedelcheva 1977, Jun & Johnson 1979, Yegana et al. 1983, Prasad et al. 1986) e na facilidade de aquisição no mercado a um custo razoavelmente acessível (Genuxal^®, Asta Médica). A escolha da dose de 40 mg/kg também se baseou na literatura, que indica doses de 10 a 50 mg/kg (Quadro 1). Entretanto, observou-se uma alta mortalidade nos animais inoculados (40%), fato que indica a necessidade de reconsideração dessa dose em experimentos dessa natureza. Portanto, seria conveniente retestar a ciclofosfamida com uma dose menor para verificar se é possível repetir o efeito imunodepressor observado neste trabalho, todavia, com uma provável redução significativa da mortalidade.

CONCLUSÕES

Com base nos resultados obtidos concluimos que a ciclofos-famida pode ser usada em modelo de imunodepressão em ovinos, pois é capaz de causar diminuição na produção de anticorpos vacinais, linfopenia e hipogamaglobulinemia. Por outro lado, o efeito da diminuição de anticorpos vacinais ocorre de maneira mais intensa quando a droga é aplicada no mesmo momento da imunização, em comparação ao efeito obtido quando da aplicação um dia antes. Na dose de 40 mg/kg, usada neste experimento, a ciclofosfamida mostrou-se relativamente tóxica, causando mortalidade de 40% dos animais inoculados.

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Recebido em 9 de novembro de 2001.

Aceito para publicação em 14 de maio de 2003.

Trabalho realizado com suporte financeiro da FAPESP, Proc. nº 99/10980-3.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  27 Out 2004
• Data do Fascículo
  Set 2004

Histórico

• Aceito
  14 Maio 2003
• Recebido
  09 Nov 2001