Diagnóstico imuno-histoquímico e caracterização anatomopatológica de clamidiose em psitacídeos

Immunohistochemical diagnosis and pathological characterization of chlamydiosis in psittacine

Renata A. Casagrande Veronica R. Machado Suyene O. de Souza Tatiane T.N. Watanabe Luciana Sonne Saulo P. Pavarini David Driemeier Sobre os autores

Resumos

A clamidiose é causada por Chlamydophila psittaci e representa uma das principais zoonoses de origem aviária. Realizou-se um estudo retrospectivo em psitacídeos do período de 1995 a 2012 e exame imuno-histoquímico (IHQ) anti-Chlamydia. Foram avaliados 111 casos, dos quais 12 foram a óbito devido à clamidiose. As aves eram provenientes de apreensão ou cativeiro (zoológicos, criatórios, centros de triagem e domicílios). À necropsia observou-se fígado aumentado (4/12) com áreas branco-amareladas (3/12), baço aumentado (2/12) e rompido (1/12), saco pericárdico com deposição de fibrina (1/12), polisserosite fibrinosa (1/12) e em três casos não havia lesões. Na avaliação histopatológica evidenciou-se hepatite necrótica mononuclear (7/12), hepatite mononuclear (3/12), hiperplasia de ductos biliares (8/12), esplenite necrótica histiocitária (9/12), hemossiderose em fígado (9/12) e baço (9/12), aerossaculite mononuclear (4/12), pericardite fibrino-heterofílica (2/12), necrose (1/12) e rarefação (1/12) linfoide de bursa de Fabricius, pneumonia fibrinosa (1/12), nefrite mononuclear (1/12) e granulomas renais (1/12). Observaram-se inclusões basofílicas intracitoplasmáticas (corpos elementares) em fígado (2/12), baço e rins (1/12). Evidenciou-se imunomarcação anti-Chlamydia em fígado (11/12), baço (7/9), pulmões (3/9), rins (2/8), intestinos (2/3), sacos aéreos (1/4) e bursa de Fabricius (1/2). A IHQ poderá ser utilizada como forma de diagnóstico definitivo post mortem de clamidiose em psitacídeos no Brasil.

Zoonose; ave; patologia; imuno-histoquímica; clamidiose; Chlamydophila psittaci


Chlamydiosis is caused by Chlamydophila psittaci and is one of the most important avian zoonosis. A retrospective study in psittacines was performed from 1995 to 2012 with immunohistochemistry (IHC) anti-Chlamydia. Hundred eleven cases were evaluated and twelve birds died due to chlamydiosis. The birds were obtained from illegal commerce traffic or captive conditions (zoos, breeding birds, wildlife rehabilitation center and pets). Grossly, there were hepatomegaly (4/12) with yellowish-white areas (3/12), splenomegaly (2/12), splenic rupture (1/12), fibrin deposition in pericardial sac (1/12), fibrinous polyserositis (1/12), and in three cases lesion was not found. Histopathological evaluation revealed mononuclear necrotizing hepatitis (7/12), mononuclear hepatitis (3/12), biliary duct hyperplasia (8/12), histiocytic necrotizing splenitis (9/12), hemosiderosis in liver (9/12) and spleen (9/12), mononuclear aerosaculitis (4/12), fibrin heterophilic pericarditis (2/12), lymphoid necrosis (1/12) and depletion of bursa Fabricius (1/12), fibrinous pneumonia (1/12), mononuclear nephritis (1/12), and renal granulomas (1/12). Basophilic intracytoplasmic inclusions (elementary bodies) were observed in liver (2/12), spleen and kidney (1/12). Positive immunostaining for Chlamydia could be detected in liver (11/12), spleen (7/9), lung (3/9), kidney (2/8), intestines (2/3), air sacs (1/4) and bursa of Fabricius (1/2). It was concluded that IHC can be used as postmortem definitive diagnosis of chlamydiosis in psittacines.

Zoonosis; bird; pathology; immunohistochemistry; ornithosis; Chlamydophila psittaci


ANIMAIS SELVAGENS

  • Diagnóstico imuno-histoquímico e caracterização anatomopatológica de clamidiose em psitacídeos
    Immunohistochemical diagnosis and pathological characterization of chlamydiosis in psittacine
  • Renata A. CasagrandeI,II; Veronica R. MachadoI; Suyene O. de SouzaI; Tatiane T.N. WatanabeI; Luciana SonneI; Saulo P. PavariniI; David DriemeierI,*

    IDepartamento de Patologia Clínica Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Av. Bento Gonçalves 9090, Porto Alegre, RS 95320-000, Brasil

    IIInstituto Federal Catarinense, SC-283 Km 8, Vila Fragosos, Concórdia, SC 89700-000, Brasil

    RESUMO

    A clamidiose é causada por Chlamydophila psittaci e representa uma das principais zoonoses de origem aviária. Realizou-se um estudo retrospectivo em psitacídeos do período de 1995 a 2012 e exame imuno-histoquímico (IHQ) anti-Chlamydia. Foram avaliados 111 casos, dos quais 12 foram a óbito devido à clamidiose. As aves eram provenientes de apreensão ou cativeiro (zoológicos, criatórios, centros de triagem e domicílios). À necropsia observou-se fígado aumentado (4/12) com áreas branco-amareladas (3/12), baço aumentado (2/12) e rompido (1/12), saco pericárdico com deposição de fibrina (1/12), polisserosite fibrinosa (1/12) e em três casos não havia lesões. Na avaliação histopatológica evidenciou-se hepatite necrótica mononuclear (7/12), hepatite mononuclear (3/12), hiperplasia de ductos biliares (8/12), esplenite necrótica histiocitária (9/12), hemossiderose em fígado (9/12) e baço (9/12), aerossaculite mononuclear (4/12), pericardite fibrino-heterofílica (2/12), necrose (1/12) e rarefação (1/12) linfoide de bursa de Fabricius, pneumonia fibrinosa (1/12), nefrite mononuclear (1/12) e granulomas renais (1/12). Observaram-se inclusões basofílicas intracitoplasmáticas (corpos elementares) em fígado (2/12), baço e rins (1/12). Evidenciou-se imunomarcação anti-Chlamydia em fígado (11/12), baço (7/9), pulmões (3/9), rins (2/8), intestinos (2/3), sacos aéreos (1/4) e bursa de Fabricius (1/2). A IHQ poderá ser utilizada como forma de diagnóstico definitivo post mortem de clamidiose em psitacídeos no Brasil.

    Termos de indexação: Zoonose, ave, patologia, imuno-histoquímica, clamidiose, Chlamydophila psittaci.

    ABSTRACT

    Chlamydiosis is caused by Chlamydophila psittaci and is one of the most important avian zoonosis. A retrospective study in psittacines was performed from 1995 to 2012 with immunohistochemistry (IHC) anti-Chlamydia. Hundred eleven cases were evaluated and twelve birds died due to chlamydiosis. The birds were obtained from illegal commerce traffic or captive conditions (zoos, breeding birds, wildlife rehabilitation center and pets). Grossly, there were hepatomegaly (4/12) with yellowish-white areas (3/12), splenomegaly (2/12), splenic rupture (1/12), fibrin deposition in pericardial sac (1/12), fibrinous polyserositis (1/12), and in three cases lesion was not found. Histopathological evaluation revealed mononuclear necrotizing hepatitis (7/12), mononuclear hepatitis (3/12), biliary duct hyperplasia (8/12), histiocytic necrotizing splenitis (9/12), hemosiderosis in liver (9/12) and spleen (9/12), mononuclear aerosaculitis (4/12), fibrin heterophilic pericarditis (2/12), lymphoid necrosis (1/12) and depletion of bursa Fabricius (1/12), fibrinous pneumonia (1/12), mononuclear nephritis (1/12), and renal granulomas (1/12). Basophilic intracytoplasmic inclusions (elementary bodies) were observed in liver (2/12), spleen and kidney (1/12). Positive immunostaining for Chlamydia could be detected in liver (11/12), spleen (7/9), lung (3/9), kidney (2/8), intestines (2/3), air sacs (1/4) and bursa of Fabricius (1/2). It was concluded that IHC can be used as postmortem definitive diagnosis of chlamydiosis in psittacines.

    Index terms: Zoonosis, bird, pathology, immunohistochemistry, ornithosis, Chlamydophila psittaci.

    INTRODUÇÃO

    A clamidiose, uma doença infecciosa de aves e mamíferos, é causada pela bactéria intracelular obrigatória Chlamydophila psittaci (C. psittaci). Esse agente já foi detectado em mais de 460 espécies de aves e os psitacídeos são os mais acometidos (Kaleta & Taday 2003). Em humanos C. psittaci causa a clamidiose, uma das principais zoonoses de origem aviária (Heddema et al. 2006, Vanrompay et al. 2007, Petrovay & Balla 2008, Harkinezhad et al. 2009, Raso et al. 2010).

    As aves podem desenvolver uma forma aguda, subaguda, crônica e inaparente (subclínica) da doença, dependendo do estado imunológico e da patogenicidade da bactéria (Andersen & Vanrompay 2008). Os sinais clínicos são inespecíficos e incluem anorexia, depressão, penas eriçadas, conjuntivite, sinusite, rinite, dispneia, diarreia, poliúria, tremores e convulsões (Gerlach 1994, Andersen & Vanrompay 2008). A forma mais comum é a subclínica, na qual as aves são portadoras e a eliminação do agente é intermitente (Proença et al. 2011).

    No Brasil os relatos de clamidiose em aves são escassos. Um surto foi descrito em 58 papagaios apreendidos do tráfico com mortalidade de 96,5% (Raso et al. 2004) e outro em 15 psitacídeos em um Centro de Triagem de Animais Silvestres (Ecco et al. 2009). Em um estudo a detecção de C. psittaci em psitacídeos de cativeiro, aparentemente saudáveis, variou de 16,7 a 56,1% (Raso et al. 2002) e em psitacídeos de vida livre de 6,3 a 26,7% (Raso et al. 2006). Além das aves selvagens, essa enfermidade também é considerada bastante importante em aves de produção, podendo causar graves problemas respiratórios e alta mortalidade, principalmente em criações de perus (Van Loock et al. 2006).

    A clamidiose possui prevalência subestimada devido à ausência de sinais clínicos patognomônicos, pela dificuldade de se ter um diagnóstico definitivo e pela ausência de testes comerciais padronizados (Proença et al. 2011). No entanto, um diagnóstico rápido e acurado é necessário, devido à alta mortalidade que pode ocorrer nas aves (Raso et al. 2004) e ao seu potencial zoonótico (Longbottom & Coulter 2003). Dentre os diferentes métodos de diagnóstico, a imuno-histoquímica (IHQ) é considerada o método post mortem mais acurado para tecidos fixados em formol (Elder & Brown 1999, Ecco et al. 2009).

    O objetivo deste trabalho foi descrever, através de um estudo retrospectivo, as características anatomopatológicas e imuno-histoquímicas de casos suspeitos de clamidiose em psitacídeos enviados ao Setor de Patologia Veterinária (SPV) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), no período de 1995 a 2012.

    MATERIAL E MÉTODOS

    Os arquivos de necropsia e exame histopatológico de psitacídeos foram levantados e revisados do período de 1995 a 2012 do SPV-UFRGS. Dados referentes às aves foram registrados, agrupados e analisados. Realizou-se a busca dos blocos de parafina e posteriormente os cortes e coloração pelo método de hematoxilina e eosina (H&E) para caracterização histológica das lesões.

    Nos casos em que havia amostra de fígado, os fragmentos de todos os órgãos foram submetidos à técnica de IHQ pelo método estreptavidina-biotina ligada à peroxidase. O bloqueio da atividade da peroxidase endógena foi realizado com a incubação dos cortes dos tecidos em solução a 10% de peróxido de hidrogênio (30 vol.) em metanol. Para a recuperação antigênica utilizou-se proteinase K (DakoCytomation) em temperatura ambiente por sete minutos. O anticorpo monoclonal anti-Chlamydia (clone ACI, 10R-C124A, Fitzgerald) foi diluído em 1:100 em solução salina tamponada com fosfato (PBS). As lâminas foram incubadas em câmara úmida por 14-16 horas (overnight) a 4ºC como o anticorpo primário e, após esta etapa, os cortes foram incubados com anticorpo secundário biotinilado ligado a estreptavidina-peroxidase (kit LSAB-HRP, K0690, DakoCytomation). O cromógeno utilizado para a revelação foi o 3-amino-9-etilcarbazol (AEC, K3469, DakoCytomation) e foi utilizada hematoxilina de Mayer na contracoloração, seguida de montagem em meio aquoso (S1964, DakoCytomation). Como controle positivo utilizou-se um corte histológico de fígado de um psitacídeo com marcação IHQ positiva para Chlamydia proveniente da Universidade da Georgia, Estados Unidos (UGA, USA).

    As diferentes intensidades de marcação foram indicadas da seguinte forma: (-) ausência de marcação, (+) marcação discreta, (++) marcação moderada e (+++) marcação acentuada.

    RESULTADOS

    No período de 1995 a 2012, foram realizados 128 diagnósticos histopatológicos de amostras de psitacídeos, em 111 casos realizou-se IHQ anti-Chlamydia e em 16 houve marcação. As características e manifestações clínicas desses psitacídeos encontram-se no Quadro 1. Todas as aves positivas para a IHQ anti-Chlamydia eram provenientes do estado do Rio Grande do Sul.


    Quanto à origem, seis aves (casos 4 a 9) eram de uma apreensão de aproximadamente 450 caturritas (Myiopsitta monachus) efetuada pela Polícia Ambiental do Rio Grande do Sul (Surto 1). Após a apreensão as aves foram encaminhadas para zoológicos, hospitais e clínicas veterinárias e nesses locais várias pessoas auxiliaram no cuidado das aves, pois muitas eram filhotes e não se alimentavam sozinhas. Alguns dias após, aproximadamente 25 pessoas apresentaram náuseas, dores de cabeça e no corpo, febre e tiveram diagnóstico de psitacose. Algumas caturritas apresentavam sinais clínicos inespecíficos (Quadro 1), no entanto, a maioria estava aparentemente saudável. Todas as aves foram submetidas à eutanásia, 14 foram enviadas para necropsia, e dessas seis foram positivas na IHQ.

    O segundo surto foi diagnosticado em um zoológico, no qual três psitacídeos morreram em uma semana (casos 11, 12 e 13). Os outros seis casos (1-3, 10, 14 e 15) ocorreram de forma isolada e as aves eram provenientes de centros de triagem e cativeiros domiciliares (Quadro 1). O caso 16 era proveniente de um criatório de calopsitas (Nymphicus hollandicus) com plantel de 50 casais. Nos últimos meses havia morrido aproximadamente 50 filhotes de 15 a 90 dias de idade. Desses animais mortos, seis foram encaminhados para necropsia e apenas um (caso 16) apresentou clamidiose. O proprietário, que tinha contato bastante próximo com os animais, estava com quadro de doença respiratória crônica intermitente não responsiva ao tratamento com antibióticos há mais de dois meses.

    De acordo com os achados anatomopatológicos e de IHQ, 12 aves morreram devido à clamidiose (casos 1, 4, 5, 7 a 14 e 16). As outras quatro apresentavam IHQ positiva para Chlamydia nas células de Kupffer do fígado, no entanto, não se observou lesão compatível com clamidiose. Essas aves morreram devido à: septicemia bacteriana (caso 2), endocardite bacteriana (caso 3) e aspergilose (casos 6 e 15).

    As alterações observadas na necropsia dos psitacídeos com clamidiose foram: fígado aumentado (4/12) e com áreas branco-amareladas (3/12) (Fig.1), baço aumentado (2/12) e rompido (1/12), saco pericárdico com deposição de fibrina (1/12) e órgãos da cavidade celomática recobertos por fibrina (1/12). Em três casos não havia lesões macroscópicas significativas.


    • Abdul-Aziz T., Fletcher O. & Barnes H.J. 2008. Hepatobiliary system, p.202-237. In: Fletcher O.J. (Ed.), Avian Histopathology. Omni Press, Madison.
    • Andersen A.A. & Vanrompay D. 2008. Avian Chlamydiosis (psittacosis, ornithosis), p.971-986. In: Saif Y.M. (Ed.), Diseases of Poultry. 12th ed. Blackwell, Iowa.
    • Ecco R., Preis I.S., Martins N.R.S., Vilela D.A.R. & Shivaprasad H.L. 2009. An outbreak of chlamydiosis in captive psittacines. Braz. J. Vet. Pathol. 2(2):85-90.
    • Elder J. & Brown C. 1999. Review of techniques for the diagnosis of Chlamydia psittaci infection in psittacine birds. J. Vet. Diagn. Invest. 11:539-541.
    • Gerlach H. 1994. Chlamydia, p.984-996. In: Richie B.W., Harrison G.J. & Harrison L.R. (Eds), Avian Medicine: principles and application. Wingers, Florida.
    • Harkinezhad T., Verminnen K., De Buyzere M., Rietzschel E., Bekaert S. & Vanrompay D. 2009. Prevalence of Chlamydophila psittaci infections in a human population in contact with domestic and companion birds. J. Med. Microbiol. 58:1207-1212.
    • Heddema E.R., Van Hannen E.J., Duim B., De Jongh B.M., Kaan J.A., Van Kessel R., Lumeij J.T., Visser C.E. & Vandenbroucke-Grauls C.M.J.E. 2006. An outbreak of psittacosis due to Chlamydophila psittaci genotype A in a veterinary teaching hospital. J. Med. Microbiol. 55:1571-1575.
    • Kaleta E.F. & Taday M.A. 2003. Avian host range of Chlamydophila spp. based on isolation, antigen detection and serology. Avian Pathol. 32:435-462.
    • Longbottom D. & Coulter L.J. 2003. Animal chlamydiosis and zoonotic implications. J. Comp. Pathol. 128:217-244.
    • Petrovay F. & Balla E. 2008. Two fatal cases of psittacosis caused by Chlamydophila psittaci J. Med. Microbiol. 57:1296-1298.
    • Proença L.M., Fagliari J.J. & Raso T.F. 2011. Infecção por C. psittaci: uma revisão com ênfase em psitacídeos. Ciência Rural 41:841-847.
    • Raso T.F., Berchieri Jr A. & Pinto A.A. 2002. Evidence of Chlamydophila psittaci infection in captive amazon parrots in Brazil. J. Zoo Wildl. Med. 32:118-121.
    • Raso T.F., Godoy S.N., Milanelo L., De Souza C.A.I., Matuschima E.R., Araújo J.P. & Pinto A.A. 2004. An outbreak of chlamydiosis in captive blue-fronted Amazon parrots (Amazona aestiva) in Brazil. J. Zoo Wildl. Med. 35:94-96.
    • Raso T.F., Seixas G.H.F., Guedes N.M.R. & Pinto A.A. 2006. Chlamydophila psittaci in free-living Blue-fronted Amazon parrots (Amazona aestiva) and Hyacinth macaws (Anodorhynchus hyacinthinus) in the Pantanal of Mato Grosso do Sul, Brazil. Vet. Microbiol. 117:235-241.
    • Raso T.F., Carrasco A.O.T., Silva J.C.R., Marvulo M.F.V. & Pinto A.A. 2010. Seroprevalence of antibodies to Chlamydophila psittaci in zoo workers in Brazil. Zoonoses Public Helth 57:411-416.
    • Sachse K., Vretou E., Livingstone M., Borel N., Pospischil A. & Longbottom D. 2009. Recent developments in the laboratory diagnosis of chlamydial infections. Vet. Microbiol. 135:2-21.
    • Van Loock M., Loots K., Van Heerden M., Vanrompay D. & Goddeeris B.M. 2006. Exacerbation of Chlamydophila psittaci pathogenicity in turkeys superinfected by Escherichia coli Vet. Res. 37:745-755.
    • Vanrompay D., Ducatelle R. & Haesebrouck F. 1992. Diagnosis of avian chlamydiosis: specificity of the modified Gimenez staining on smears and comparison of the sensitivity of isolation in eggs and three different cell cultures. Zentralbl. Veterinärmed B 39:105-112.
    • Vanrompay D., Van Neron A., Ducatelle R. & Haesebrouck F. 1994. Evaluation of five immunoassays for detection of Chlamydia psittaci in cloacal and conjunctival specimens from turkeys. J. Clin. Microbiol. 32:1470-1474.
    • Vanrompay D., Harkinezhad T., Van de Walle M., Beeckman D., Van Droogenbroeck C., Verminnen K., Leten R., Martel A. & Cauwerts K. 2007. Chlamydophila psittaci transmission from pet birds to humans. Emerg. Infect. Dis. 13(7):1108-1110.
    • Verminnen K., Van Loock M., Hafez H.M., Ducatelle R., Haesebrouck F. & Vanrompay D. 2006. Evaluation of a recombinant enzyme-linked immunosorbent assay for detecting Chlamydophila psittaci antibodies in turkey sera. Vet. Res. 37:623-632.
    • Webster J.D., Miller M.A., DuSold D. & Ramos-Vara J. 2009. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. J. Histochem. Cytochem. 57(8):753-761.

    Diagnóstico imuno-histoquímico e caracterização anatomopatológica de clamidiose em psitacídeos Immunohistochemical diagnosis and pathological characterization of chlamydiosis in psittacine

    Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      25 Nov 2014
    • Data do Fascículo
      Set 2014

    Histórico

    • Aceito
      04 Set 2014
    • Recebido
      Abr 2014
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