Comparação entre duas metodologias para a realização do teste de redução do tetrazólio nitroazul (NBT) em caprinos

Comparison among two methodologys at realization nitroblue tetrazolium reduction test (NBT) in caprines

Resumo:

O teste de redução do tetrazólio nitroazul (NBT) é um dos métodos mais utilizados para a avaliação do metabolismo oxidativo dos neutrófilos. Porém, o custo por amostra e o tempo de utilização do corante são desvantagens do método. O objetivo deste trabalho foi comparar duas metodologias para realização do teste do NBT a fim de maximizar a sua utilização e diminuir o custo por amostra processada. Foram utilizadas 10 cabras, adultas clinicamente sadias e colhidas amostras de sangue por meio de venipunção jugular em tubos de 10mL sendo retirada uma alíquota de 500μL em tubo "eppendorff" contendo 2μL de heparina. Através desta alíquota foram realizadas três metodologias para o teste do NBT: A) técnica original Park & Good (1970); B) redução de 50% do volume do corante; C) redução de 50% e armazenamento do corante a -20°C por 180 dias. Foram confeccionados e corados esfregaços sanguíneos (May Grünwald-Giemsa) das amostras com as metodologias propostas e realizada contagem de 100 neutrófilos em microscopia óptica para determinar o percentual de neutrófilos reativos ao NBT. A análise estatística pelo método de Análise de Medidas Repetida (ANOVA) demonstrou diferenças significativas (P<0,05) entre os dois métodos e o original (A=14,4±4,6; B=1,9±1,4; C=1,1±0,9), porém apresentou alta correlação pelo teste de Spearman entre os métodos (r_s=0,82 (AxB), r_s=0,75 (BxC) e r_s=0,93 (AxC)). Conclui-se que o teste de Redução do Tetrazólio Nitroazul (NBT) segundo a metodologia descrita por Park & Good (1970) e a redução do corante em 50% do seu volume e a sua redução associada ao congelamento por 180 dias a -20ºC podem ser realizadas em caprinos, porém os valores devem ser comparados com as respectivas metodologias utilizadas.

Termos de Indexação:
Teste de redução do tetrazólio nitroazul; metabolismo oxidativo; neutrófilos; caprinos

Abstract:

The nitroblue tetrazolium reduction test (NBT) is one of the most used methods to evaluate the oxidative metabolism of neutrophils. However, the cost for each sample and dye's life-time are disadvantages of the method. This paper aim was to compare two NBT test methodologies in order to maximize its use and decrease the cost for each sample. It was made using 10 adult and healthy goats and blood samples were taken through venipuncion in jugular vein, using 10mL tubes, and then a 500μL sample was taken in eppendoff tubes with 2μL of heparin. Using this sample were made three methodologies for the NBT test: A) Park & Good (1970) original technique; B) dye reduction in 50% of the volume; C) 50% reduction and dye storage at -20°C for 180 days. It was made and dyed the blood smear (May Grünwald-Giemsa) from the samples, using the proposed methodologies and then made the counting of 100 neutrophils in optic microscopy, to determinate the percentage of NBT reactive neutrophils. The statistic analysis by the method of Repeated Measuring Analysis (ANOVA) evinced significant differences (P<0,05) between the two methods and the original (A=14.4±4.6; B=1.9±1.4; C=1.1±0.9), however it showed high correlation by the Spearman test between the methods (rs=0,82 (AxB), rs=0,75 (BxC) e rs=0.93 (AxC)). It was concluded that the original Park & Good (1970) method and two methodologies for dye reduction in 50% and it's reduction associated with NBT dye freezing for 180 days can be used in caprines, but the values should be compared with their respective methodologies.

Index Terms:
Nitroblue tetrazolium reduction test; oxidative metabolism; neutrophil; goats

Introdução

Os neutrófilos constituem a primeira linha de defesa do organismo contra a invasão de microorganismos e a sua principal função é fagocitar e destruir bactérias, fungos, leveduras, algas, parasitos e vírus (Park 1971, Roth et al. 1982a, Feldman 2000). Qualquer fator que interfira com a produção ou a supressão das funções dos neutrófilos, rapidamente torna o animal mais susceptível às doenças infecciosas (Roth & Kaeberle 1982, Feldman 2000). Os mecanismos antibacterianos dos neutrófilos são classificados em dependentes e independentes de oxigênio. O mecanismo dependente de oxigênio é iniciado pela fagocitose ou por distúrbios na membrana da célula e envolve uma série de reações que produz espécies reativas de oxigênio (ERO) que interagem com outras substâncias ou atuam diretamente contra as bactérias.

Após a fagocitose realizada pelo neutrófilo ocorre a ativação do sistema NADPH-oxidase que catalisa a reação de redução do oxigênio molecular (O₂) para ânion superóxido (O₂^-) determinando um rápido aumento na atividade da oxidase causando uma "explosão respiratória" no consumo de oxigênio ("respiratory burst") (Ciarlini et al. 2004, Kaneko 2008). Existem muitos métodos para a avaliação do metabolismo oxidativo de neutrófilos. Dentre estes métodos, o teste de redução do tetrazólio nitroazul (NBT) é um dos mais utilizados (Ciarlini 1998, Ciarlini et al. 2004). O teste do NBT foi primeiramente utilizado por Baehner & Nathan (1967) para o diagnóstico de doença granulomatosa crônica (CGD) em crianças.

A CGD é uma doença genética que determina deficiência na produção da enzima NADPH-oxidase de grande importância na geração de ânions superóxido (O₂. Desta maneira, a CGD é caracterizada pela presença de infecções bacterianas crônicas recorrentes em humanos (Babior 1978).

O NBT é um corante amarelo claro que quando adicionado a uma suspensão de neutrófilos é reduzido pelo ânion superóxido a um precipitado insolúvel de coloração azul enegrecida conhecido como formazam (Nathan 1974). A redução do NBT tem uma estreita correlação com o metabolismo oxidativo e avalia um importante componente da ação bactericida do neutrófilo (Roth et al. 1983), sendo considerado como uma mensuração indireta da atividade dependente de oxigênio dos neutrófilos (Gordon et al. 1975, Jain 1986). A avaliação é realizada por meio da microscopia óptica e a localização do formazam é muito heterogênea, podendo apresentar-se ligado à membrana da célula ou no interior dos fagócitos (Nathan 1974). Na Medicina Veterinária, Poli et al. (1973) foram os primeiros a utilizarem o teste do NBT em doenças bacterianas de cães. Nos últimos anos, vários autores têm estudado o metabolismo oxidativo de neutrófilos por meio do teste do NBT em diversas situações e espécies de animais, Poli & Manteli (1974), Sara & Dwaraknath (1977), Lopes (2000), Fonteque (2001), Lopes et al. (2003) e Souza et al. (2006) em caprinos; Ciarlini (1998), Afonso et al. (2002) e Camargo (2009) em ovinos; Borges et al. (2001), Costa et al. (2000), Peixoto et al. (2002), Costa et al. (2004), Reis et al. (2005)), Costa (2005), Ciarlini et al. (2005) e Costa et al. (2008) em bovinos; Ciarlini et al. (1997), Laposy et al. (2000) e Silva et al. (2010) em equinos; Trevelin et al. (2009) em avestruzes; Barbosa et al. (2010), Ciarlini et al. (2010) e Bosco et al. (2012) em caninos. O objetivo do presente trabalho foi comparar duas metodologias para a realização do teste do NBT com o teste padrão desenvolvido por Park & Good (1970), reduzindo em 50% o volume do corante e a sua redução em 50% associada ao armazenamento por 180 dias a temperatura de -20°C.

Material e Métodos

Foram utilizados 10 caprinos, fêmeas, da raça Saanen, com idade entre oito a 12 meses, pesando entre 28 e 35Kg, clinicamente sadias, livres de ectoparasitas e endoparasitas. Amostras de sangue foram colhidas por venipunção jugular em tubos de 10mL a vácuo sem anticoagulante e uma alíquota de 500μL foi retirada e acondicionada em tubo "eppendorff" contendo 2μL de heparina. A mesma amostra de sangue foi utilizada para a realização dos três protocolos do exame. O teste foi realizado dentro do período máximo de duas horas após a colheita. A avaliação do metabolismo oxidativo de neutrófilos foi determinada por meio do teste de redução do tetrazólio nitroazul (NBT), método microscópico de Park & Good (1970), utilizando-se kit comercial (NBT Vial, Sigma Diagnostic. St. Louis, USA). A metodologia utilizada por Park & Good (1970) constitui-se a utilização de 50μL de NBT e 50μL de sangue (A). A primeira metodologia foi alterada para 25μL de NBT e 25μL de sangue (B); e a segunda metodologia alterada para 25μL de NBT congelado a -20^oC por 180 dias e 25μL sangue (C).

Para a realização do método utilizando-se o corante congelado, o NBT foi separado previamente em alíquotas com uma pipeta automática de 25μL em tubos do tipo "eppendorf" e congeladas em freezer à temperatura de -20^oC por 180 dias até o momento da realização dos testes. Após a homogeneização as amostras foram incubadas em banho-maria a temperatura de 37°C por 10 minutos e posteriormente por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida os frascos foram homogeneizados e confeccionados esfregaços sanguíneos em lâminas de microscopia e corados com corante May Grünwald-Giemsa. A contagem de 100 neutrófilos por meio de microscopia óptica em aumento de 1.000x foi realizada a fim de determinar o número percentual de neutrófilos reativos ao NBT para as três metodologias. Considerou-se neutrófilo NBT positivo quando este apresentou qualquer grânulo intracitoplasmático de coloração azul a negro (formazam), independente do número e tamanho. Os dados foram avaliados por meio do teste de Análise de Variância de Medidas Repetida (ANOVA) comparando-se os três métodos ao nível de 5% de significância (P<0,05) e pela Correlação de Spearman segundo Curi (1998).

Resultados e Discussão

A técnica do NBT é rápida, não envolve equipamentos sofisticados e pode ser realizada a campo (Ciarlini 1998, Fonteque 2001). Porém, o teste implica em algumas limitações, como o custo por amostra e após a diluição do corante sua utilização se restringe a um período de no máximo 24 horas.

A proposta apresentada pelo trabalho visa à possibilidade de redução da quantidade de corante utilizado e a diminuição do custo do teste por amostra processada, além de prolongar a utilização do corante congelado por 180 dias.

A análise estatística dos dados (Quadro 1) demonstrou diferenças significativas (p<0,05) entre as médias das metodologias propostas e as do método de Park & Good (1970). Desta maneira a redução em 50% do corante e sua redução e armazenamento por 180 dias congelado provocam alterações nos resultados do teste de redução do tetrazólio nitroazul (NBT) quando comparados ao método tradicional. Analisando-se as médias dos valores (Quadro 1) os resultados demonstraram que tanto a redução quanto o congelamento do corante não podem ser utilizados como meio de diminuição do custo e de maior utilização do corante. Os valores para as metodologias com redução do corante NBT foram semelhantes aos observados por Lopes (2000) de 4,3% e Fonteque (2001) que variaram de 0 a 4,0% para caprinos clinicamente sadios. Porém, os valores de NBT utilizando o método de Park & Good (1970) estiveram acima dos valores encontrados.

Quadro 1:
Valores de média e desvios-padrão (x±sd) do teste de redução do tetrazólio nitroazul (NBT) em caprinos utilizando os métodos de 50μL fresco segundo Park & Good (1970) (A), 25μL de corante fresco (B) e 25μL de corante congelado a -20°C por 180 dias (C)

• ^a
  Para letras iguais não há diferença significativa (p<0,05) entre os grupos

Na análise das correlações foram observadas altas correlações entre as metodologias segundo o método de Spearman para os respectivos testes: 50μL fresco (A) x 25μL fresco (B) (r=0,82); 25μL fresco (B) x 25μL congelado por 180 dias (C) (r=0,75) e 50μL (A) x 25μL congelado por 180 dias (C) (r=0,93) (Quadro 2). Os dados obtidos demonstram que a alteração na metodologia do teste do NBT pode ser realizada, porém, os valores percentuais relativo aos neutrófilos reativos ao NBT não podem ser comparados com aqueles descritos na literatura que utilizaram o método de Park & Good (1970). Ciarlini et al (2005) utilizaram a técnica do NBT com redução para 25μl em bovinos vacinados contra a brucelose.

Quadro 2:
Resultados dos coeficientes de correlação (r_s) estimados pelo método de Spearman e seus respectivos "p-value" (p) referentes à redução do tetrazólio nitroazul (NBT) em caprinos utilizando os métodos de 50μL fresco segundo Park & Good (1970) (A), 25μL fresco (B) e 25μL congelado a -20°C por 180 dias (C)

• ^*
  Se p<0,05 existe correlação significativa

Os valores médios das porcentagens de neutrófilos redutores de NBT antes da vacinação foram semelhantes aos observados por Couto et al(2001), porém inferiores aos obtidos por Sara e Dwaraknath (1977) e por Costa & Kohayagawa (2000) para bovinos sadios.

O estudo demonstrou que a variação do número de neutrófilos reativos ao NBT no momento pré-vacinal esteve entre 0 e 2%, enquanto que os valores descritos por Sara e Dwaraknath (1977) variaram de 2 a 5%. Os valores de Costa & Kohayagawa (2000) tiveram média de 6% para a prova não estimulada e 12% para a prova estimulada, enquanto no trabalho de Ciarlini et al. (2005) as médias de neutrófilos redutores de NBT para o momento (M0) foram de 0,3% para a prova não estimulada e 0,8% para a prova estimulada. Segundo o autor tal diferença deve-se provavelmente ao fato de o tempo de incubação e de os critérios de leitura das reações de redução do NBT utilizados no presente trabalho não serem os mesmos adotados por Costa & Kohayagawa (2000) e Sara & Dwaraknath (1977). Porém, não leva em consideração que são duas metodologias distintas, pela redução do volume do corante, podendo ser também incluída como uma das causas da diferença. Trevelin et al. (2009) também utilizaram a técnica com redução para 25μL em avestruzes, porém não puderam comparar com outra literatura pela ausência de trabalhos científicos.

Conclusão

Conclui-se que o teste de Redução do Tetrazólio Nitroazul (NBT) segundo a metodologia descrita por Park & Good (1970) e a redução do corante em 50% do seu volume e a sua redução associada ao congelamento por 180 dias a -20°C podem ser realizadas em caprinos, porém os valores devem ser comparados com as respectivas metodologias utilizadas.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Dez 2015

Histórico

• Recebido
  28 Fev 2015
• Aceito
  29 Nov 2015