Saponinas triterpênicas das raízes de guettarda pohliana müll. Arg. (Rubiaceae)

Chemical constituents of the roots of Guettarda pohliana Müll. Arg. (Rubiaceae)

Resumo

The phytochemical investigation of Guettarda pohliana roots led to the isolation of 28-O-beta-D-glycopyranosyl-3-O-beta-D-quinovopyranosyl quinovic acid, 28-O-beta-D-glycopyranosyl-3-O-beta-D-glycopyranosyl quinovic acid, 3-O-beta-D-glycopyranosyl quinovic acid, 28-O-beta-D-glycopyranosyl-3-O-beta-D-glycopyranosyl cincholic acid along with quinovic acid, daucosterol and 4,5-O-dicaffeoyl quinic acid. The structures of the isolated compounds were assigned on the basis of spectroscopic data, including two-dimensional NMR methods. The antiradical activity of the crude methanolic extract and of its fractions was evaluated.

Guettarda pohliana; triterpenoid saponins; antioxidant activity

Guettarda pohliana; triterpenoid saponins; antioxidant activity

ARTIGO

Saponinas triterpênicas das raízes de guettarda pohliana müll. Arg. (Rubiaceae)

Chemical constituents of the roots of Guettarda pohliana Müll. Arg. (Rubiaceae)

Paulo Roberto Neves de Oliveira^I; Gláucio Testa^I; Simone Bortolotti de Sena^I; Willian Ferreira da Costa^I; Maria Helena Sarragiotto^I; Silvana Maria de Oliveira Santin^I,*; Maria Conceição de Souza^II

^IDepartamento de Química, Universidade Estadual de Maringá, 87020-900 Maringá – PR, Brasil

^IIDepartamento de Biologia, Universidade Estadual de Maringá, 87020-900 Maringá – PR, Brasil

ABSTRACT

The phytochemical investigation of Guettarda pohliana roots led to the isolation of 28-O-b-D-glycopyranosyl-3-O-b-D-quinovopyranosyl quinovic acid, 28-O-b-D-glycopyranosyl-3-O-b-D-glycopyranosyl quinovic acid, 3-O-b-D-glycopyranosyl quinovic acid, 28-O-b-D-glycopyranosyl-3-O-b-D-glycopyranosyl cincholic acid along with quinovic acid, daucosterol and 4,5-O-dicaffeoyl quinic acid. The structures of the isolated compounds were assigned on the basis of spectroscopic data, including two-dimensional NMR methods. The antiradical activity of the crude methanolic extract and of its fractions was evaluated.

Keywords:Guettarda pohliana; triterpenoid saponins; antioxidant activity.

INTRODUÇÃO

O gênero Guettarda (Rubiaceae) compreende plantas extensamente distribuídas em áreas tropicais. Elas são popularmente utilizadas na América do Sul para tratamento de ferimentos e inflamações.¹ Em levantamento bibliográfico realizado no gênero, foi constatado o estudo de apenas nove espécies, dentre elas, as espécies brasileiras G. platypoda e G. angelica, encontradas nas regiões nordeste e centro-oeste e utilizadas popularmente como antifebril.^2,3 Estes estudos constataram a presença de saponinas derivadas do ácido quinóvico, alcalóides indólicos e quinolínicos, ácidos clorogênicos, iridóides e secoiridoides^1-6 e, ainda, foi comprovada a atividade antiinflamatória de Guettarda acreana¹ e Guettarda platypoda² e o efeito hipoglicêmico em ratos para a Guettarda angélica.⁴

O estudo de G. pohliana, conhecida popularmente como angélica-do-mato, teve como objetivo dar continuidade à investigação do potencial químico das espécies pertencentes à subfamília Guettardoideae presentes na área de preservação ambiental de Porto Rico/PR. Em estudos anteriores das espécies Machaonia brasiliensis e Chomelia obtusa foram isolados o iridóide secologanosídeo,⁷ flavonóides,^7,8 ácidos clorogênicos,^7,8 ácidos ursólico e oleanóico, e saponinas derivadas dos ácidos quinóvico e cinchólico.⁸ O extrato bruto e frações de C. obtusa exibiram ainda atividades antiinflamatória e antioxidante.⁸

O presente trabalho descreve o isolamento e identificação de quatro saponinas triterpênicas, um triterpeno, um derivado do ácido clorogênico e de um esteróide glicosilado e os resultados dos ensaios de atividade antioxidante do extrato bruto e frações das raízes de Guettarda pohliana. As estruturas das substâncias isoladas foram definidas com base na análise de dados espectroscópicos de RMN ¹H e ¹³C e de experimentos HMQC, ¹H x ¹H COSY e NOESY e a comparação dos dados obtidos com os registrados na literatura.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros de RMN (uni- e bidimensionais) foram obtidos em espectrômetro Varian, modelo Mercury plus BB, operando a 300 MHz para ¹H e 75,5 MHz para ¹³C. Os deslocamentos químicos foram dados em ppm, tendo como referência interna o tetrametilsilano TMS (d = 0,0 ppm) ou o próprio solvente. Os solventes utilizados foram D₂O, CD₃OD, C₅D₅N e CDCl₃. Para as cromatografias em coluna (CC) utilizou-se sílica gel 60 (0,063-0,200 mm, Merck) ou Sephadex LH-20, como fase estacionária. Para as cromatografias em camada delgada (CCD) e em camada delgada preparativa (CCDP) empregou-se sílica gel 60 G e 60 GF₂₅₄ (Merck). A visualização dos compostos em CCD foi realizada por irradiação com luz ultravioleta em 254 e 366 nm e/ou por pulverização com solução de H₂SO₄/MeOH (1:1), H₂SO₄/anisaldeído/áci do acético (1:0,5:50 mL) seguido de aquecimento.

Material vegetal

A planta Guettarda pohliana, foi coletada em abril de 2005, às margens da bacia de inundação do alto do Rio Paraná na região de Porto Rico/PR. A exsicata do material vegetal encontra-se depositada no Herbário da Universidade Estadual de Maringá sob o registro nº HUNP 3563.

Isolamento dos constituintes químicos

As raízes de Guettarda pohliana (700,1 g) foram secas ao ar, pulverizadas e extraídas exaustivamente com metanol, à temperatura ambiente, fornecendo 39,1 g de extrato bruto. Parte deste extrato (32,1 g) foi solubilizado em MeOH/H₂O 1:1 e submetido à partição em hexano, clorofórmio, acetato de etila, o que resultou nas frações hexânica (2,6 g), clorofórmica (3,7 g) e acetato de etila (6,2 g). Parte da fração clorofórmica (2,5 g) foi fracionada em gel de sílica com misturas de hexano, acetato de etila e metanol em ordem crescente de polaridade. A purificação por recristalização (acetona) das sub-frações eluídas em hexano:AcOEt 30% e hexano:AcOEt 70% forneceu as substâncias 1 (15,1 mg) e 2 (5,1 mg). Parte da fração acetato de etila (4,2 g) foi fracionada em coluna de sílica gel, utilizando como eluentes hexano, AcOEt e MeOH em gradiente crescente de polaridade. A sub-fração eluída em AcOEt:MeOH 2% (2,4 g) foi parcialmente solubilizada em H₂O resultando na formação de um precipitado. A parte solúvel em H₂O foi submetida a uma filtração em Sephadex LH-20 utilizando com eluentes H₂O; H₂O:MeOH 25, 50 e 75%; MeOH; MeOH:acetona 1:1 e acetona, que resultou no isolamento de 3 (22,8 mg), 5 (14,0 mg) e 6 (11,0 mg). A parte insolúvel também foi submetida à filtração em Sephadex LH 20 utilizando como eluente MeOH resultando no isolamento de 4 (4,0 mg) e 7 (8,5 mg).

Ácido quinóvico (1)

Aspecto físico: cristais brancos. RMN de ¹H (300,06 MHz, C₅D₅N): d_H (multiplicidade, J em Hz): 3,30 (dd, 10,8; 5,1, H-3); 1,39 (m, H-6); 2,74 (d, 5,4, H-9); 2,14 (t, 9,8, H-11); 6,04 (d, 2,7, H-12); 1,80 (m, H-15); 2,64 (t, 12,0, H-16); 2,82 (d, 11,4, H-18); 1,39 (t, 5,7, H-21); 2,01 (m, H-22); 1,15 (s, H-23); 1,08 (s, H-24); 1,00 (s, H-25); 0,94 (s, H-26); 1,24 (d, 6,0, H-29) e 0,82 (d, 6,3, H-30). RMN de ¹³C ver Tabela 1.

Ácido 28-O-b-glicopiranosilquinóvico (2)

Aspecto físico: sólido amorfo e higroscópico. RMN de ¹H (300,06 MHz, CD₃OD): d_H (multiplicidade, J em Hz): 1,95 (m, H-11); 5,61 (sl, H-12); 2,28 (d, 9,9, H-18); 0,87 (s, H-23); 1,00 (s, H-24); 0,97 (s, H-25); 0,82 (s, H-26); 0,90 (d, 5,4, H-29 e H-30); 5,37 (d, 7,8, H-1') e 3,34 (d, 6,0, H-2'). RMN de ¹³C ver Tabela 1.

Ácido 3-O-b-D-glicopiranosil-28-O-b-glicopiranosilquinóvico (3)

Aspecto físico: sólido amorfo marrom e higroscópico. RMN de ¹H (300,06 MHz, CD₃OD): d_H (multiplicidade, J em Hz): 3,19 (dd, 16,8; 8,4, H-3); 5,62 (sl, H-12); 2,28 (d, 9,9, H-18); 0,87 (s, H-23); 1,01 (s, H-24); 0,96 (s, H-25); 0,82 (s, H-26); 0,91 (d, 5,4, H-29 e H-30); 4,30 (d, 7,5, H-1') e 5,38 (d, 7,8, H-1"). RMN de ¹³C ver Tabela 1.

Ácido 3-O-b-D-quinovopiranosil-28-O-b-glicopiranosilquinó vico (4)

Aspecto físico: sólido amorfo e higroscópico. RMN de ¹H (300,06 MHz, CD₃OD): d_H (multiplicidade, J em Hz): 3,13 (dd, 7,8; 4,5, H-3); 0,76 (t, 10,8, H-5); 1,94 (m, H-11); 5,61 (sl, H-12); 2,28 (d, 9,9, H-18); 1,48 (t, 15,3, H-21); 0,87 (s, H-23); 1,01 (s, H-24); 0,96 (s, H-25); 0,82 (s, H-26); 0,90 (d, 5,4, H-29 e H-30); 4,29 (d, 7,8, H-1'); 3,26 (m, H-2'); 1,24 (m, H-6'); 5,37 (d, 8,1, H-1") e 3,34 (m, H-2"). RMN de ¹³C ver Tabela 1.

Ácido 3-O-b-D-glicopiranosil-28-O-b-glicopiranosilcinchólico (5)

Aspecto físico: sólido amorfo e higroscópico. RMN de ¹H (300,06 MHz, CD₃OD): d_H (multiplicidade, J em Hz): 3,13 (dd, 11,7; 4,5, H-3); 5,64 (sl, H-12); 2,89 (dd, 9,9; 4,2, H-18); 1,01 (s, H-23); 0,95 (s, H-24); 0,82 (s, H-25); 0,86 (s, H-26 e H-29); 0,91 (s, H-30); 4,29 (d, 7,8, H-1') e 5,39 (d, 7,8, H-1"). RMN de ¹³C ver Tabela 1.

Avaliação da atividade antioxidante

Os testes de atividade antioxidante foram realizados para o extrato bruto metanólico e frações hexânica (FH), clorofórmica (FC), acetato de etila (FAE) e hidrometanólica (FHM). Os potenciais de atividade antioxidante foram determinados com base na atividade seqüestradora de radical livre do 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH).⁹ As amostras foram adicionadas em diferentes concentrações à 2 mL de uma solução de DPPH em metanol (2,84.10^-4 mol/L). Após 30 min a absorbância foi determinada em espectrofotômetro UV-VIS, a 515 nm, empregando metanol como branco. Os testes foram realizados em triplicata. Uma solução de DPPH sem adição das amostras foi utilizada como controle. O BHT foi utilizado como padrão. A capacidade seqüestradora de radicais livres foi determinada utilizando a análise de regressão linear no intervalo de confiança de 95% (P<0,05). Os resultados foram expressos como IC₅₀, que corresponde à concentração da amostra necessária para seqüestrar 50% de radicais livres.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O estudo fitoquímico das raízes de G. pohliana resultou no isolamento dos ácidos quinóvico¹⁰ (1), 28-O-b-D-glicopiranosilquinóvico ⁵ (2), 3-O-b-D-glicopiranosil-28-O-b-D-glicopirano silquinóvico³ (3), 3-O-b-D-quinovopiranosil-28-O-b-D-glicopirano silquinóvico¹¹ (4), 3-O-b-D-glicopiranosil-28-O-b-D-glicopirano silcinchólico¹² (5), do 3-O-b-glicopiranosil-24a-etil-colesta-5-enol (daucosterol)¹³ (6) e do ácido 4,5-O-dicafeoilquínico⁷ (7). As estruturas das substâncias isoladas foram elucidadas com base nas análises dos dados espectroscópicos (RMN ¹H e ¹³C, DEPT 135º, COSY ¹H-¹H, HMQC, HMBC, NOESY) e por comparação com os dados disponíveis na literatura.

A substância 1 foi obtida da fração clorofórmio como cristais brancos. Através do espectro de RMN de ¹H foram observados sinais para hidrogênios de seis grupos metila [d_H: 1,15 (s, H-23); 1,08 (s, H-24); 1,00 (s, H-25); 0,94 (s, H-26); 1,24 (d, J = 6,0 Hz, H-29) e 0,82 (d, J = 6,3 Hz, H-30)], um dupleto em d_H 6,04 (d, J = 2,7 Hz) correspondente ao hidrogênio vinílico (H-12), um duplo dupleto em d_H 3,30 (dd, J = 10,8 e 5,1 Hz) correspondente ao hidrogênio carbinólico (H-3) e um dupleto em d_H 2,82 (d, J = 11,4 Hz) correspondente a hidrogênio metínico (H-18). De acordo com estes dados pode-se constatar que a substância pertence à classe dos triterpenos da série ursano. Pelo espectro de RMN ¹³C de 1 foi observado sinal em d_C 78,3 (C-3) referente ao carbono oximetínico, em d_C 178,4 (C-27) e d_C 180,5 (C-28) correspondentes aos carbonos das carboxilas de grupos ácido, e em d_C 129,3 (C-12) e 134,5 (C-13) relacionados aos carbonos olefínicos (Tabela 1). Pelo mapa de contorno HMQC, foi possível atribuir inequivocamente todos os hidrogênios aos seus respectivos carbonos. Após análise dos espectros de RMN e comparação com os dados da literatura foi possível identificar a substância 1 como o ácido quinóvico.

Os espectros de RMN de ¹H e ¹³C para substâncias as 2, 3, e 4 apresentaram sinais característicos de triterpenos contendo o ácido quinóvico como unidade aglicônica. As unidades glicosídicas presentes nas substâncias 2-4 foram identificadas principalmente através dos sinais correspondentes aos carbonos anoméricos nas regiões de d_C 95,5 e d_C 106,6. Os valores das constantes de acoplamento (J = 7,5-7,8 Hz) correspondentes aos hidrogênios anoméricos indicaram que estes se encontram em posição axial, evidenciando a configuração b. O posicionamento das unidades glicosídicas para as substâncias 2-4 foi determinado com base nas correlações observadas nos respectivos espectros de HMBC. Além disto, os valores do deslocamento químico do C-3 (d_C 90,7) no caso das substâncias 3 e 4, e do C-28 (d_C 177,9-178,0) para as três substâncias, corroboram com a presença de unidade glicosídica nestes carbonos, uma vez que estes sinais aparecem em d_C 78,3 (C-3) e d_C 180,5 para o ácido quinóvico (1).

A substância 5 foi isolada da fração acetato de etila como sólido amorfo após tratamento em CC de sílica gel e filtração em Sephadex LH-20. O espectro de RMN de ¹H apresentou cinco sinais correspondendo a hidrogênios de seis grupos metila em d_H 0,95 (s, H-24); 0,86 (s, H-26 e H-29); 1,01 (s, H-23); 0,82 (s, H-25), e 0,91 (s, H-30), um sinal largo em d_H 5,64 (H-12) referente a hidrogênio olefínico, um duplo dupleto em d_H 3,13 (H-3) característico de hidrogênio carbinólico e um duplo dupleto em d_H 2,89 (H-18) de hidrogênio metínico. Foram observados sinais em d_H 4,29 (H-1') e d_H 5,39 (H-1") para os hidrogênios anoméricos. A análise de todos os dados de RMN (Tabela 1) indicou um esqueleto triterpênico para 5, e a multiplicidade dos sinais correspondentes a H-18 e dos sinais dos C-29 e C-30 determinou um triterpeno da série oleanano, pois H-18 apresentou-se na forma de um duplo dupleto. Os valores de deslocamento químico dos C-1' e C-1" em d_C 94,0 e d_C 106,7 são observados quando as unidades glicosídicas estão ligadas aos C-28 e C-3, respectivamente. A análise dos dados de RMN 1D e 2D e comparação com os descritos na literatura permitiram identificar 5 como o ácido 3-O-b-D-glicopiranosil-28-O-b-glicopiranosídeo cinchólico. Este é o primeiro relato do isolamento ácido cinchólico glicosilado no gênero.

A substância 7 foi isolada da fração acetato de etila como sólido amorfo e caracterizada como ácido 4,5-O-dicafeoilquínico, através da comparação dos dados espectroscópicos de RMN com os descritos na literatura.⁷ O espectro de RMN de ¹H de 7 apresentou duas unidades cafeoíla devido à presença de sinais para hidrogênios olefínicos em relação de acoplamento trans em d_H 7,58 e 6,26 (d, J = 15,9 Hz, H-7' e H-8') e em d_H 7,50 e 6,18 (d, J = 15,9 Hz, H-7" e H-8"), de dois duplos dupletos em d_H 6,89 e 6,93 (J = 7,8 e 2,1 Hz, H-6' e H-6") e dos dupletos em d_H 7,03 e 7,05 (J = 2,1 Hz, H-2' e H-2") e em d_H 6,77 e 6,74 (J = 7,8 Hz, H-5' e H-5"). Além destes sinais foram observados a presença de três hidrogênios metínicos em d_H 5,10 (dd, J = 2,7 e 9,3 Hz, H-4), d_H 5,67 (m, H-5) e d_H 4,34 (m, H-3) e de sinais compreendidos na faixa de d_H 2,00-2,30 ppm, característicos de hidrogênios metilênicos. A confirmação dos grupos cafeoíla e do esqueleto do ácido quínico foi baseado nos espectros de RMN de ¹³C, especialmente, pelos sinais para dois grupos carbonilas das unidades cafeoíla em d_C 168,6 e 168,4, do grupo carboxila em d_C 178,4, de dois carbonos metilênicos em d_C 40,0 (C-2) e d_C 38,6 (C-6); de um carbono não hidrogenado em d_C 76,4 (C-1) e três carbonos metínicos em d_C 70,0 (C-3), d_C 75,8 (C-4) e d_C 69,3 (C-5). As posições dos grupos cafeoílas foram determinadas com bases nos valores de deslocamento químicos para H-3, H-4 e H-5 e comparação desses com os dos possíveis isômeros dos ácidos 3,4-, 3,5- e 4,5-dicafeoilquínico encontrados na literatura.¹⁴ As posições 4,5 para os grupos cafeoíla foram confirmadas com base no mapa de contornos NOESY. As correlações observadas entre os sinais d_H 4,34 (H-3) e d_H 5,10 (H-4) e a ausência de correlação desses hidrogênios com d_H 5,67 (H-5) sugeriram que H-3 e H-4 estão situados em um mesmo lado do plano da molécula e H-5 em lado oposto, consolidando a estereoquímica proposta.

O extrato bruto metanólico e suas frações provenientes de partição foram avaliados como anti-radicalar pelo método do DPPH, muito empregado para medir a capacidade seqüestradora de radicais livres⁹ de produtos naturais. Os resultados deste ensaio (Tabela 2) mostraram que o extrato bruto e a fração acetato de etila (FAE) foram os que apresentaram maior potencial anti-radicalar quando comparados com o controle positivo BHT. Nesta fração estão presentes as saponinas e o ácido 4,5-O-dicafeoilquínico, sendo este último conhecido por apresentar esta propriedade.¹⁵

AGRADECIMENTOS

À Fundação Araucária (Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Paraná) e ao CNPq pelas bolsas concedidas (PIBIC/CNPq/UEM/FA) (G. Testa e S. B. de Sena).

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Recebido em 21/11/07, aceito em 17/3/08, publicado na web em 23/4/08

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Jun 2008
• Data do Fascículo
  2008

Histórico

• Aceito
  17 Mar 2008
• Recebido
  21 Nov 2007