Estudo fitoquímico das cascas das raízes de Zanthoxylum rigidum Humb. & Bonpl. ex Willd (Rutaceae)

Phytochemical study from root barks of Zanthoxylum rigidum Humb. & Bonpl. ex Willd (Rutaceae)

Zanthoxylum rigidum; alkaloids; flavonoid

ARTIGO

Estudo fitoquímico das cascas das raízes de Zanthoxylum rigidum Humb. & Bonpl. ex Willd (Rutaceae)

Phytochemical study from root barks of Zanthoxylum rigidum Humb. & Bonpl. ex Willd (Rutaceae)

Sally Katiuce Moccelini^I; Virgínia Claudia da Silva^I; Eliane Augusto Ndiaye^I; Paulo Teixeira de Sousa Jr.^I,*; Paulo Cezar Vieira^II

^IDepartamento de Química, Universidade Federal de Mato Grosso, 78060-900 Cuiabá - MT, Brasil

^IIDepartamento de Química, Universidade Federal de São Carlos, CP 676, 13560-970 São Carlos - SP, Brasil

ABSTRACT

Chemical investigation from root barks of Z. rigidum, resulted in the isolation of lupeol, a mixture of steroids campesterol, sitosterol, stigmasterol, sacarose, hesperidin, N-methylatanine and 6-acetonyldihydrochelerythrine. Their structures were established by spectral data analysis. No previous work has been reported on Z. rigidum species.

Keywords:Zanthoxylum rigidum; alkaloids; flavonoid.

INTRODUÇÃO

O gênero Zanthoxylum (Rutaceae) compreende mais de 200 espécies e encontra-se distribuído em todo mundo.¹ Quimicamente, este gênero é caracterizado pela presença de alcalóides,^2-7 cumarinas,^5,6,8 lignanas,^4,9 amidas^10,11 e terpenos.^5,6,12 Sob o ponto de vista farmacológico, ao gênero Zanthoxylum são atribuídas diversas atividades, tais como, antichagásica, ² tripanocida, ⁹ antiplasmódica,⁷ anti-HIV, ¹² antiinflamatória,⁸ anti-helmíntica,¹¹ entre outras de grande interesse medicinal. A espécie Zanthoxylum rigidum Humb. & Bonpl. ex Willd. é conhecida popularmente na região amazônica como hualaja e sua madeira é utilizada na construção de casas.¹³ No Pantanal, espécies de Zanthoxylum em geral, são denominadas de mamica-de-cadela ou mamica-de-porca.

Neste trabalho registra-se o resultado do primeiro estudo fitoquímico das cascas das raízes de Z. rigidum, descrevendo o isolamento e a identificação do triterpeno lupeol, dos esteróides campesterol, estigmasterol e sitosterol, da sacarose (1), do flavonóide hesperidina (2) e dos alcalóides N-metilatanina (3) e 6-acetonildiidroqueleritrina (4).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O extrato hexânico das cascas das raízes de Z. rigidum submetido à cromatografia em coluna de sílica gel resultou no isolamento do lupeol, da mistura dos esteróides campesterol, estigmasterol e sitosterol e do alcalóide N-metilatanina (3). A mesma técnica cromatográfica aplicada ao extrato metanólico forneceu novamente o lupeol e o alcalóide N-metilatanina (3), além do dissacarídeo sacarose (1), o flavonóide hesperidina (2) e o alcalóide 6-acetonildiidroqueleritrina (4).

A estrutura do lupeol foi identificada pela análise dos espectros de RMN de ¹H e ¹³C, comparação com padrões usando CCD e com dados da literatura.¹⁴ Para confirmação da composição, a mistura dos esteróides campesterol, estigmasterol e sitosterol foi submetida à CG-EM, cuja identificação foi realizada através de comparação com amostras autênticas do padrão e análise dos fragmentos de massas obtidos de cada componente da mistura. No espectro de massas de cada uma das substâncias foi possível observar picos correspondentes ao íon molecular em m/z 400 (16%, C₂₉H₃₆O), 412 (7%, C₂₉H₄₈O) e 414 (16%, C₂₉H₅₀O), respectivamente. Outros picos com fragmentos em m/z 396, 382, 367, 256, 107 e 55, característicos de esteróides, foram detectados através da comparação do padrão de fragmentação com dados da literatura.¹⁵

A identificação da sacarose (1), isolada do extrato metanólico, foi realizada com base nos dados de RMN de ¹H e ¹³C (BBD e PENDANT¹⁶) e comparação de seus dados espectroscópicos com os registrados na literatura.^17,18 Analisando o espectro de RMN de ¹H, verificou-se sinais na região de açúcar entre δ_H 3,2 e 4,0, além do sinal atribuído ao hidrogênio ligado ao carbono anomérico em δ_H 5,2 (d, J 3,8 Hz). No experimento PENDANT (50 MHz), registraram-se 12 sinais de carbono, sendo três sinais atribuídos aos carbonos metilênicos δ_CH2 61,5 (C-6), 60,1 (C-1') e 62,5 (C-6') e um quaternário em δ_C 103,7 (C-2'), que confirmaram a estrutura do dissacarídeo sacarose ou α-D-glicopiranosil-β-D-frutofuranosídeo.

A estrutura da flavanona 2 foi definida com base nos dados fornecidos pelos espectros de RMN de ¹H, ¹³C (BBD e PENDANT), massas, bem como através da comparação dos valores dos seus deslocamentos químicos com os descritos na literatura.¹⁹ O espectro de RMN de ¹H mostrou sinais que absorvem na região de hidrogênios aromáticos, além de uma absorção em δ_H 12,06 indicando hidroxila quelada e outra em δ_H 3,77 com integração para 3 hidrogênios, indicando a presença de grupamento metoxílico. Os sinais correspondentes ao par de singletos largos em δ_H 6,15 (H-6) e δ_H 6,12 (H-8), formando um sistema AB no anel A, e um multipleto centrado registrado em δ_H 6,92 atribuído aos hidrogênios H-2', H-5' e H-6', representando um sistema do tipo AMX no anel B, foram verificados na região de hidrogênios aromáticos. Ainda pelo espectro de RMN de ¹H foram observados sinais atribuídos a um sistema ABX na região de hidrogênios alifáticos em δ_H 5,49 (dd, J 3,11 e 12,18 Hz, H-2), δ_H 2,77 (dd, J 3,11 e 15,11 Hz, H-3eq) e δ_H 3,07 (dd, J 13,8 e 12,0 Hz, H-3ax) os quais caracterizaram o esqueleto da flavanona. A presença de sinais na região de açúcar δ_H 3,09-3,86, o dubleto em δ_H 4,52 (J 7,38 Hz) e o singleto em δ_H 4,97 atribuídos aos hidrogênios anoméricos H-1" e H-1"', respectivamente, e principalmente o sinal de dubleto em δ_H 1,08 (d, J 6,0 Hz, H-6") confirmam a presença de uma unidade ramnose na molécula. A análise do espectro de RMN de ¹³C (PENDANT) confirmou os respectivos carbonos ligados aos hidrogênios representados por esses sinais e os carbonos metínico em δ_CH 78,4 e metilênico em δ_CH2 42,1, atribuídos aos respectivos carbonos C-2/C-3 (anel A), os carbonos metínicos não oxigenados-sp² em δ_CH 96,4 e 95,6 atribuídos aos carbonos C-6/C-8 (anel B) e em δ_CH 114,2, 112,0 e 117,9 relativos aos carbonos C-2'/C-5'/C-6' (anel C). A atribuição de todos esses valores foi compatível ao esqueleto de uma flavanona 7-O-glicosil substituída. O espectro de RMN de ¹³C também auxiliou na confirmação dos sinais dos carbonos quaternários da unidade aglicona proposta para 2 [δ_C 197,0 (C=O), 163,1 (C-5), 165,2 (C-7), 162,5 (C-9), 103,3 (C-10), 130,9 (C-1'), 146,5 (C-3') 147,9 (C-4')]. Outros sinais foram atribuídos à hidroxila fenólica em δ_H 12,02 (s, HO-5) e 9,11 (s, HO-3'), à metoxila em δ_H 3,77 (s, H₃CO-4') e às duas unidades de açúcar em δ_H 3,14-3,86, 4,97 (d, J 7,38 Hz, H-1"), 4,52 (s, H-1"') e 1,08 (d, J 6,0 Hz, H-6"'). Esses valores de deslocamentos químicos aliados à exibição do pico íon pseudo-molecular [M-H]⁺ em m/z 609,3 no espectro de massas (ESI-MS) foram condizentes com a fórmula molecular C₂₈H₃₄O₁₅ e confirmaram a estrutura da 7-O-β-D-rutinosil-3',5'-diidroxi-4'-metoxiflavanona ou hesperidina (2).

As estruturas dos alcalóides 3 e 4 foram definidas com base na análise dos espectros de RMN de ¹H e de ¹³C uni e bidimensionais e por comparação com os valores descritos na literatura para os alcalóides N-metilatanina²⁰ e 6-acetonildiidroqueleritrina,²¹ respectivamente. O espectro de RMN de ¹H de 3 indicou a presença de quatro hidrogênios em sistema aromático, cujos respectivos sinais apareceram em δ_H 7,78 (dd, J 1,5 e 7,9 Hz, H-5), 7,48 (ddd, J 1,5, 7,1 e 8,5 Hz, H-7), 7,33 (d, J 7,2 Hz, H-8) e 7,19 (t, J 7,1 Hz, H-6). A multiplicidade dos sinais em δ_H 5,28 (t, H-2') e 3,40 (d, H-4') com valor da constante de acoplamento J = 6,8 Hz foi compatível com a relação entre os hidrogênios ligados aos carbonos C-1' e C-2'. Além desses sinais, observou-se a presença dos singletos em δ_H 1,69, 1,82 e 3,67, atribuídos aos grupamentos metila, sendo o último valor correspondente ao grupamento N-metil e, em δ_H 3,67, equivalente à metoxila. No espectro de RMN de ¹³C (BBD e DEPT 135º) entre outros sinais, observaram-se os sinais dos carbonos metilênico em δ_CH2 23,9 (C-1'), metílicos δ_CH3 25,3 (C-5'), 17,6 (C-4'), 29,2 (N-CH₃) e 61,3 (OCH₃), olefínico δ_CH 121,24 (C-2'), metínicos δ_CH 121,2 (C-2'), 122,8 (C-5), 121,4 (C-6), 129,6 (C-7) e 113,6 (C-8) e quaternários 131,9 (C-3'), 117,9 (C-3), 159,7 (C-4), 122,0 (C-4a), 138,5 (C-8a) e 163,4 (C=O).

Os alcalóides do tipo benzofenantridínicos, semelhantes à 6-acetonildiidro queleritrina (4), são muito comuns no gênero Zanthoxylum.²² Os espectros de RMN de ¹H da substância 4, incluindo experimento ¹Hx¹H-COSY, apresentaram multiplicidades e valores das constantes de acoplamento da correlação entre os sinais em δ_H 2,25 (dd, J = 3,60 e 14,90 Hz, H-1'a), 2,57 (dd, J = 11,20 e 14,90 Hz, H-1'b) e 5,04 (dd, J = 3,60 e 11,2 Hz, H-6); entre δ_H 6,95 (d, J = 8,5 Hz, H-9) e δ_H 7,54 (d, J = 8,5 Hz, H-10) e entre δ_H 7,71 (d, J = 8,5 Hz, H-11) e δ_H 7,48 (d, J = 8,5 Hz, H-12). Outros sinais de destaque no espectro de RMN de ¹H foram os sinais do grupamento N-metil em δ_H 2,64, metoxi em δ_H 3,92, 3,95 (OCH₃), metilenodioxi em δ_H 6,04 (s), além dos singletos em δ_H 7,10 e 7,51 atribuídos aos hidrogênios H-4 e H-1, respectivamente. A análise do espectro de HSQC permitiu atribuir inequivocamente todos os valores de deslocamento químico dos carbonos hidrogenados (ver Parte Experimental). O espectro de RMN de ¹³C aliado ao espectro HMBC confirmou a localização das metoxilas pela correlação ³J entre o sinal em δ_H 3,92 com C-7 (152,1) e δ_H 3,95 com C-8 (145,5), da acetonila ³J entre H-6 (5,04) com C=O (207,5) e metilenodioxi ³J entre O₂CH₂ (6,04) com C-2 (147,5) e C-3 (148,1). A análise por ES-MS sugeriu a fórmula molecular C₂₄H₂₃NO_5, devido à presença do íon pseudo-molecular [M+H]⁺ em m/z 406,6, indicando também a presença de número impar de nitrogênios e confirmou a proposta para a estrutura da 6-acetonildiidroqueleritrina (4).

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais

Os pontos de fusão foram determinados em medidor digital Mettler FP 80-Hot Stage acoplado em microscópio binocular Olympus. Os espectros de massas de baixa resolução foram efetuados em cromatógrafo em fase gasosa acoplado à espectrometria de massas (CG-EM), modelo QP 5000 da Shimadzu, utilizando sistema de ion trap e ionização por impacto de elétrons a 70 eV e espectros de massas de alta resolução por ionização eletrospray foram efetuados em espectrômetro Quatro LC-Micromass UK (ESI-MS). As análises polarimétricas foram obtidas em polarímetro Perkin Elmer modelo 341, e os solventes foram clorofórmio, metanol e DMSO grau analítico e água Milli-Q. Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear, ¹H e ¹³C (incluindo experimentos em 2D) foram registrados em espectrômetros Bruker ARX-400 (¹H: 400 MHz e ¹³C: 100 MHz); Bruker AC-200 (¹H: 200 MHz e ¹³C: 50 MHz) e Jeol JNM-GX-400 (¹H: 400 MHz e ¹³C: 100 MHz), utilizando CDCl₃, D₂O, CD₃OD ou DMSO-d₆ como solventes e TMS como referência interna. Nas separações cromatográficas em coluna aberta usou-se sílica gel 60 (Merck e Aldrich); nas análises com camada delgada e preparativa utilizou-se sílica gel 60 PF₂₅₄ (Merck e Aldrich) com granulação adequada e revelação sob luz UV (254 e 365 nm), vanilina ácida, reagente de Dragendorff ou exposição em vapores de iodo.

Material vegetal

As raízes de Zanthoxylum rigidum foram coletadas em março de 2001 na fazenda N. S de Fátima, Poconé-Porto Cercado km 8, município de Poconé (MT). A ratificação taxonômica foi realizada pela Profª. Drª. F. Melo do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), sendo que no Herbário Central da UFMT se encontra catalogada uma amostra testemunho (exsicata nº 24.081).

Extração e isolamento

Após secagem e trituração, 520,0 g das cascas das raízes de Z. rigidum foram submetidas à extração através de maceração contínua com hexano e metanol à temperatura ambiente. A retirada do solvente foi feita em evaporador rotativo, originando os extratos hexânico (15,6 g) e metanólico (68,0 g). O extrato hexânico foi cromatografado em coluna de sílica gel 60 eluída inicialmente com hexano aumentando-se gradativamente a polaridade com AcOEt e MeOH, finalizando com MeOH. Foram obtidas 204 frações de aproximadamente 25 mL cada, reunidas conforme a similaridade em 22 grupos (G1-G22). A fração G4 (1,2 g) foi purificada em CC sílica gel eluída com hexano, misturas de hexano e AcOEt, AcOEt, misturas de AcOEt e MeOH e MeOH obtendo-se 24 frações, sendo que das frações 4-7 se obteve um sólido branco correspondente ao lupeol (30,0 mg, p.f. 212-214 ºC). A fração G5 (150,0 mg) forneceu cristais em forma de agulhas incolores que foram submetidos à análise por CG-EM, obtendo-se assim a mistura dos esteróides campesterol, estigmasterol e sitosterol (5,0 mg). As frações G6-G9 forneceram a substância 2 (1,2 g, p.f. 132,5-134,2 ºC, óleo amarelo-esverdeado). O extrato metanólico (68,0 g) foi cromatografado em coluna de sílica gel utilizando-se os gradientes hexano, misturas de hexano e AcOEt, AcOEt e misturas de AcOEt e MeOH, MeOH e misturas de MeOH e dietilamina. Foram obtidas 345 frações que foram analisadas e reunidas por CCD em 35 grupos (F1-F35). A partir do fracionamento por CC da fração F2 (290,0 mg) foi novamente obtido o triterpeno lupeol (10,0 mg). A fração F5 (510,0 mg) foi repurificada por CC em sílica gel utilizando-se como eluentes, hexano, AcOEt e MeOH, com aumento gradativo de polaridade. Foram obtidas 107 frações, reunidas em 17 frações (F5A-F5R). As frações F5I, F5J e F10 (150,0 mg) foram reunidas por similaridade por conterem a mesma substância majoritária. Estas depois de agrupadas foram purificadas por CCDP eluída com CH₂Cl₂ e AcOEt (95:5) e deram origem ao alcalóide 4 (18,0 mg, p.f. 192,2-193,3 ºC). Nas frações F25-F-27 houve a precipitação de um sólido cristalino em forma de cubos, que foram separados do sobrenadante por filtração, correspondente à sacarose (1, 330,0 mg, p.f. 180-184 ºC). O sobrenadante das frações F25-F27 (7,38 g) foi submetido à CC de sílica gel 60, eluída com misturas de hexano e AcOEt e misturas de AcOEt e MeOH, da qual foram recolhidas 236 frações que, com base em análise CCD, foram reunidas em 14 grupos (F25/27A-F25/F27N). Nas frações F25/F27J houve a formação de um sólido amorfo amarelado correspondente à substância 2 (144,0 mg). Nas frações F28-F29 também houve precipitação da substância 2 (740,0 mg, p.f. 258-259,2 ºC).

Sacarose (1): cristais transparentes, p.f. 180-184 ºC, [α]_D^22º +0,534 (H₂O; conc. 0,01 g/mL), RMN de ¹³C (50 MHz, D₂O) δ_C: 92,2 (C-1), 72,5 (C-2), 74,1 (C-3), 71,2 (C-4), 72,7 (C-5), 61,5 (C-6) [glicose], 60,3 (C-1'), 103,7 (C-2'), 76,5 (C-3'), 69,4 (C-4'), 81,5 (C-5'), 62,5 (C-6') [frutose].

Hesperidina (2): sólido amorfo amarelado, p.f. 258,0-259,2 ºC, [α]_D^22º -67,98 (DMSO; conc. 0,011 g/mL), RMN ¹H (200 MHz, DMSO-d₆) δ_H (mult.; J em Hz, H): 5,49 (dd, 3,11 e 15,11, H-2), 2,77 (dd, 3,11 e 15,11, H-3eq), 3,07 (dd, 13,8 e 12,0, H-3ax), 6,15 (sl, H-6), 6,12 (sl, H-8), 6,92 (m, H-2', H-5', H-6'), 4,52 (d, 7,8, H-1"), 4,97 (s, H-1"'), 3,09-3,86 (H-2"-H-5"'), 1,08 (d, 6,0, H-6"), 12,06 (s, 5-OH), 3,77 (s, 4'-OCH₃). RMN ¹³C (50 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 78,4 (C-2), 42,1 (C-3), 197,0 (C-4), 163,1 (C-5), 96,4 (C-6), 165,2 (C-7), 95,6 (C-8), 162,5 (C-9), 103,3 (C-10), 130,9 (C-1'), 114,2 (C-2'), 146,5 (C-3'), 147,9 (C-4'), 112,0 (C-5'), 117,9 (C-6'), 100,6 (C-1"), 73,0 (C-2"), 76,3 (C-3"), 69,6 (C-4"), 75,5 (C-5"), 66,1 (C-6"), 99,5 (C-1"'), 70,3 (C-2"'), 70,7 (C-3"'), 72,1 (C-4"'), 68,3 (C-5"'), 17,8 (C-6"'), 55,7 (4'-OCH₃).

N-metilatanina (3): óleo amarelo esverdeado, p.f. 132,5-134,2 ºC, RMN ¹H (200 MHz, CDCl₃) δ_Η (mult.; J em Hz, H): 7,78 (dd, 1,5 e 7,1, H-5), 7,19 (t, 7,1, H-6), 7,48 (ddd, 1,5, 7,1 e 8,5, H-7), 7,33 (d, 7,2, H-8), 3,40 (d, 6,8, H-1'), 5,28 (t, 6,8, H-2'), 1,69 (s, H-4'), 1,82 (s, H-5'), 3,89 (s, 4'-OCH₃), 3,67 (s, N-CH₃). RMN ¹³C (50 MHz, CDCl₃) δ_C: 163,4 (C-2), 117,2 (C-3), 159,7 (C-4), 122,0 (C-4a), 122,8 (C-5), 121,4 (C-6), 129,6 (C-7), 113,6 (C-8), 138,5 (C-8a), 23,9 (C-1'), 121,2 (C-2'), 131,9 (C-3'), 17,6 (C-4'), 25,3 (C-5'), 61,3 (4'-OCH₃), 29,2 (N-CH₃).

6-acetonildiidroqueleritrina (4): sólido bege-claro, p.f. 192,2-193,3 ºC, [α]_D^22º -5,560 (CHCl₃; conc. 0,014 g/mL), RMN ¹H (400 MHz, CDCl₃) δ_H (mult.; J em Hz, H): 7,51 (s, H-1), 7,10 (s, H-4), 5,04 (dd, 3,6 e 11,2, H-6), 6,95 (d, 8,5, H-9), 7,54 (d, 8,5, H-10), 7,71 (d, 8,5, H-11), 7,48 (d, 8,6, H-12), 2,57 (dd, 11,2 e 14,9, H-1'a), 2,25 (dd, 3,6 e 14,9, H-1'b), 6,04 (s, O₂CH₂), 2,06 (s, COCH₃), 3,92 (s, 7-OCH₃), 3,95 (s, 8-OCH₃), 2,64 (N-CH₃). RMN ¹³C (100 MHz, CDCl₃) δ_C: 100,6 (C-1), 147,5 (C-2), 148,1 (C-3), 104,3 (C-4), 127,3 (C-4a), 124,8 (C-4b), 54,9 (C-6), 139,3 (C-6a), 152,1 (C-7), 145,5 (C-8), 111,5 (C-9), 118,7 (C-10), 128,2 (C-10a), 123,3 (C-10b), 119,7 (C-11), 123,8 (C-12), 131,0 (C-120), 46,8 (C-1'), 207,5 (C-2'), 31,1 (C-3'), 55,8 (7-OCH₃), 60,9 (8-OCH₃), 101,0 (O₂CH₂), 42,8 (N-CH₃).

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq, FAPEMAT e Centro de Pesquisa do Pantanal (CPP) pelas bolsas concedidas e pelo apoio financeiro para o desenvolvimento dessa pesquisa e ao Prof. Dr. A. G. Ferreira (UFSCar) pelos espectros obtidos a 400 MHz.

Recebido em 27/2/08; aceito em 7/8/08; publicado na web em 20/1/09

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Fev 2009
• Data do Fascículo
  2009

Histórico

• Aceito
  07 Ago 2008
• Recebido
  27 Fev 2008